1、食品生物技术导论目 录o第一章第一章 绪绪 论论o第二章第二章 食品与基因工程食品与基因工程o第三章第三章 食品与蛋白质工程食品与蛋白质工程o第四章第四章 食品与酶工程食品与酶工程o第五章第五章 食品与发酵工程食品与发酵工程o第六章第六章 食品与细胞工程食品与细胞工程o第七章第七章 食品生物工程中的下游过程食品生物工程中的下游过程o第八章第八章 食品生物技术与食品安全检测食品生物技术与食品安全检测o第九章第九章 生物技术与食品工业生物技术与食品工业“三废三废”治理治理第一章第一章 绪绪 论论n第一节第一节 食品生物技术涵义食品生物技术涵义n第二节第二节 食品生物技术研究内容食品生物技术研究内容
2、n第三节第三节 食品生物技术特点食品生物技术特点n第四节第四节 食品生物技术发展简史食品生物技术发展简史n第五节第五节 分子生物学的形成和发展分子生物学的形成和发展第一节第一节 食品生物技术涵义食品生物技术涵义一、生物技术一、生物技术l所谓生物工程是达到特殊目的生物过程的控制性工程所谓生物工程是达到特殊目的生物过程的控制性工程 “操纵生物操纵生物（微生物、植物、动物）的细胞、组织或酶，进行生物合成及分（微生物、植物、动物）的细胞、组织或酶，进行生物合成及分解转化解转化”。二、食品生物技术二、食品生物技术l食品生物技术（食品生物技术（food biotechnology）是利用生物体及其细胞、）
3、是利用生物体及其细胞、亚细胞和分子组成部分，结合工程学、信息学等手段去研究及加亚细胞和分子组成部分，结合工程学、信息学等手段去研究及加工处理或制造食品产品的新技术。工处理或制造食品产品的新技术。第二节第二节 食品生物技术研究内容食品生物技术研究内容一、食品与基因工程一、食品与基因工程l基因工程又称遗传工程，它是在体外将异源基因工程又称遗传工程，它是在体外将异源DNA（目的基因）与基（目的基因）与基因载体（质粒、病毒等）重组成复制子并转移至宿主细胞的过程。因载体（质粒、病毒等）重组成复制子并转移至宿主细胞的过程。二、食品与酶工程二、食品与酶工程l酶是活细胞产生的具高度催化活性和高度专一性的生物催
4、化剂。酶是活细胞产生的具高度催化活性和高度专一性的生物催化剂。l所谓酶工程是把酶或细胞或经过修饰后直接应用于化学反应的生物催所谓酶工程是把酶或细胞或经过修饰后直接应用于化学反应的生物催化工程，包括固定化酶、固定化细胞和固定化活细胞体系等。化工程，包括固定化酶、固定化细胞和固定化活细胞体系等。l酶工程的应用能有效地改造传统的食品工业。酶工程的应用能有效地改造传统的食品工业。三、食品与发酵工程三、食品与发酵工程n发酵工程其涵义是采用现代发酵设备，使经基因重组技术改良的细胞发酵工程其涵义是采用现代发酵设备，使经基因重组技术改良的细胞或经其它现代技术改造的菌株进行放大培养和控制发酵，获得工业化或经其它
5、现代技术改造的菌株进行放大培养和控制发酵，获得工业化生产预定的食品产品或食品的功能成分。生产预定的食品产品或食品的功能成分。四、食品与细胞工程四、食品与细胞工程l应用细胞生物学方法，按照人们预定的设计，有计划地改造遗传物质应用细胞生物学方法，按照人们预定的设计，有计划地改造遗传物质和细胞培养技术，包括细胞融合技术、细胞拆合技术以及动物、植物和细胞培养技术，包括细胞融合技术、细胞拆合技术以及动物、植物大量控制性培养技术，还包括染色体工程和细胞质工程等内容。大量控制性培养技术，还包括染色体工程和细胞质工程等内容。l细胞工程与微生物细胞培养一样，在人工控制条件下在生物反应器中细胞工程与微生物细胞培养
6、一样，在人工控制条件下在生物反应器中大规模培养，获得人类所需要的各种食品产品及保健产品大规模培养，获得人类所需要的各种食品产品及保健产品 五、食品与蛋白质工程五、食品与蛋白质工程n1983年美国年美国Genex 公司公司KUtrner提出蛋白质工程（提出蛋白质工程（protein engineering）概念，其涵义是指从蛋白质分子结构的设计入手，将待改进的蛋白质提概念，其涵义是指从蛋白质分子结构的设计入手，将待改进的蛋白质提纯为结晶，用纯为结晶，用x射线衍射等手段研究其空间构象，确定其需要改变的氨射线衍射等手段研究其空间构象，确定其需要改变的氨基酸残基，然后再用基因定位突变和体外定向进化等方
7、法达到修饰蛋白基酸残基，然后再用基因定位突变和体外定向进化等方法达到修饰蛋白质分子空间结构的目的。质分子空间结构的目的。六、食品与后基因组学六、食品与后基因组学l2003年随着人类基因组图谱草图绘制成功，为后基因组学（年随着人类基因组图谱草图绘制成功，为后基因组学（post-genomics）的诞生拉开了序幕。而现代研究认为，一个基因可以编码数）的诞生拉开了序幕。而现代研究认为，一个基因可以编码数个蛋白质，随之形成所谓基因组学（个蛋白质，随之形成所谓基因组学（genomics）和蛋白质组学）和蛋白质组学（proteomics），近年来，在日本、美国和德国等国又启动了营养基因），近年来，在日本、
8、美国和德国等国又启动了营养基因组学（组学（nutrigenomics）的研究。）的研究。七、食品与食品安全七、食品与食品安全n生物技术的发展为食品安全的检测提供高速高效的生物技术的发展为食品安全的检测提供高速高效的PCR系统检测技术。系统检测技术。为加强食品安全在食品加工过程除必须严格执行为加强食品安全在食品加工过程除必须严格执行CAC、HACCP、GMP和和ACP安全体系外。还必须制订切实可行的食品安全监督管理安全体系外。还必须制订切实可行的食品安全监督管理体系。体系。第三节第三节 食品生物技术特点食品生物技术特点一、食品生物技术与食品产业化紧密相关一、食品生物技术与食品产业化紧密相关l食品
9、生物技术对改造传统食品工食品生物技术对改造传统食品工业和农副产品深加工，具有革命业和农副产品深加工，具有革命性意义和较大的经济价值。食品性意义和较大的经济价值。食品生物技术即食品生物工程包括上生物技术即食品生物工程包括上游工程（游工程（up stream process）和下）和下游工程（游工程（down stream process），），整个过程有多个操作工序，一环整个过程有多个操作工序，一环扣一环，核心技术为生物技术和扣一环，核心技术为生物技术和酶工程，形成较为完整的产业链，酶工程，形成较为完整的产业链，如图如图1-1所示。所示。图图1-1 食品生物技术产业链示意图食品生物技术产业链示意
10、图二、食品生物技术属边缘性交叉学科二、食品生物技术属边缘性交叉学科n生物技术是研究生命的科学技术，是生物科学和工程学综合交叉的边生物技术是研究生命的科学技术，是生物科学和工程学综合交叉的边缘学科。缘学科。三、食品生物技术具有三、食品生物技术具有“六高六高”基本特征基本特征l食品生物技术与其他高新技术一样，对国民经济的发展和食品工业的食品生物技术与其他高新技术一样，对国民经济的发展和食品工业的革新具有革新具有“六高六高”的基本特征：即高效益，高智力、高投入、高竞争、的基本特征：即高效益，高智力、高投入、高竞争、高风险和高潜力。高风险和高潜力。四、食品生物技术属高新技术范畴四、食品生物技术属高新技
11、术范畴l根据当今世界科技发展对世界经济发展贡献情况。信息、能源、生物根据当今世界科技发展对世界经济发展贡献情况。信息、能源、生物技术、航天、材料、汽车和环境等己被列为世界技术、航天、材料、汽车和环境等己被列为世界“七大七大”高科技领域。高科技领域。五、食品生物技术已成为食品科学发展的重要研究方向五、食品生物技术已成为食品科学发展的重要研究方向n食品生物技术作为生物技术的分支学科，在自然科学中涵盖范围广为食品生物技术作为生物技术的分支学科，在自然科学中涵盖范围广为其特征。其特征。第四节第四节 食品生物技术发展简史食品生物技术发展简史一、史前时期一、史前时期l从出土文物发现，追溯至距今数千多年前的
12、龙山文化时期。酿酒、制从出土文物发现，追溯至距今数千多年前的龙山文化时期。酿酒、制醋和制酱等发酵技艺已经发展到世界一流水平。醋和制酱等发酵技艺已经发展到世界一流水平。二、近代时期二、近代时期n从从19世纪世纪50年代开始，伴随着欧洲的文艺复兴带来科学和工业的繁荣。年代开始，伴随着欧洲的文艺复兴带来科学和工业的繁荣。由于法国科学家巴斯德（由于法国科学家巴斯德（Pasteur）对微生物学创立的贡献，德国科学）对微生物学创立的贡献，德国科学家柯赫（家柯赫（Koch）发明了微生物的分离和纯种培养技术和法国学者布）发明了微生物的分离和纯种培养技术和法国学者布合乃尔（合乃尔（Buchner）兄弟俩通过实验
13、揭示了发酵本质是细胞中酶的作）兄弟俩通过实验揭示了发酵本质是细胞中酶的作用。标志着传统食品生物技术向近代食品生物技术的发展。从传统发用。标志着传统食品生物技术向近代食品生物技术的发展。从传统发酵食品的生产靠天然微生物作用酵食品的生产靠天然微生物作用。三、现代的发展三、现代的发展l从从20世纪世纪50年代初开始，伴随着生物化学，遗传学和化学分析技术的年代初开始，伴随着生物化学，遗传学和化学分析技术的发展。特别是发展。特别是1953年年“DNA双螺旋结构双螺旋结构”的发现、的发现、1969年酶固定化技术年酶固定化技术的应用成果和的应用成果和1973年基因工程诞生等重大科技成就为标志的划时代发年基因
14、工程诞生等重大科技成就为标志的划时代发展展 第五节第五节 分子生物学的形成和发展分子生物学的形成和发展一、细胞学说一、细胞学说l在在19世纪中时施莱登和施旺（世纪中时施莱登和施旺（Schwann）两位学者经过）两位学者经过20年的研究绘年的研究绘出有关细胞结构明显图象和细胞组成，从而创立了细胞学说。出有关细胞结构明显图象和细胞组成，从而创立了细胞学说。二、生物进化论二、生物进化论l奥地利学者格里哥尔奥地利学者格里哥尔.孟德尔（孟德尔（Gregor Mendel）研究认为，遗传性状）研究认为，遗传性状是由一对遗传因子决定的，是由一对遗传因子决定的，四、摩尔根的基因学说四、摩尔根的基因学说n摩尔根
15、提出：摩尔根提出：“物质必须由某种独立的要素组成，正是这些要素我们物质必须由某种独立的要素组成，正是这些要素我们叫做遗传因子，或者更简单地叫做基因叫做遗传因子，或者更简单地叫做基因”。五、基因本质的发现五、基因本质的发现l摩尔根提出：摩尔根提出：“物质必须由某种独立的要素组成，正是这些要素我们物质必须由某种独立的要素组成，正是这些要素我们叫做遗传因子，或者更简单地叫做基因叫做遗传因子，或者更简单地叫做基因”。多年来研究证实这种转化。多年来研究证实这种转化物质就是物质就是DNA，这是基因本质的重大发现。，这是基因本质的重大发现。六、分子生物学的诞生六、分子生物学的诞生n1953年美国遗传学家詹姆
16、斯年美国遗传学家詹姆斯.沃森（沃森（James D.Watson）和英国生物物理学家弗朗西斯）和英国生物物理学家弗朗西斯.克里克克里克（Francis crick）根据莫）根据莫.休休.弗弗.威尔金斯（威尔金斯（M.H.F.wilkins）的）的x-射线衍射等系列图谱结构分析射线衍射等系列图谱结构分析基础上，用标度分子模型在英国基础上，用标度分子模型在英国Max Perutz教授分子生物学实验室进行研究。其研究成果，教授分子生物学实验室进行研究。其研究成果，在英国自然杂志上发表的在英国自然杂志上发表的DNA结构一文，提出了结构一文，提出了“DNA双螺旋结构模型双螺旋结构模型”。首次阐明。首次阐
17、明了了D结构与功能，为遗传信息的贮存、传递和利用提供了科学依据，创立了现代分子生结构与功能，为遗传信息的贮存、传递和利用提供了科学依据，创立了现代分子生物学。这是物学。这是20世纪科学史上划时代的里程碑。世纪科学史上划时代的里程碑。Watson和和crick均为诺贝尔奖获得者。均为诺贝尔奖获得者。DNA双螺双螺旋结构分子模型如图旋结构分子模型如图1-1、1-2所示其结构要点说明如下：所示其结构要点说明如下：图图1-1 DNA分子双螺旋结构模型分子双螺旋结构模型图图1-2 DNA双螺旋结构分子模型双螺旋结构分子模型 n（1）DNA是由两条极性相反并互补的多聚核苷酸链，围绕中心轴的是由两条极性相反
18、并互补的多聚核苷酸链，围绕中心轴的双螺旋结构。此螺旋为右螺旋，并存在大沟和小沟。双螺旋结构。此螺旋为右螺旋，并存在大沟和小沟。n（2）两条链中碱基之间按照）两条链中碱基之间按照A配对配对T、G配对配对C的互补原则，的互补原则，DNA两两链间的维系主要靠氢键，其中链间的维系主要靠氢键，其中A与与T之间形成二个氢键，之间形成二个氢键，G与与C之间形之间形成三个氢键。成三个氢键。n（3）双螺旋的直径为）双螺旋的直径为2nm，两个相邻碱基的间距为，两个相邻碱基的间距为0.34nm，每，每10个个碱基的间距为碱基的间距为3.4nm，构成一段完整的螺旋结构，其相邻碱基的夹角，构成一段完整的螺旋结构，其相邻
19、碱基的夹角为为36。n（4）两条多聚核苷酸链间碱基配对的互补规律为：）两条多聚核苷酸链间碱基配对的互补规律为：A配对配对T或或T配对配对A、G配对配对C或或C配对配对G，而且其分子比率为，而且其分子比率为1。n（1）DNA分子能自我复制根据分子能自我复制根据DNA双螺结构模型，在两条多聚核双螺结构模型，在两条多聚核苷酸链中，任何一条都可以作为另苷酸链中，任何一条都可以作为另一条生物合成的模板，这一点明显一条生物合成的模板，这一点明显地不同于其它生物大分子。经过自地不同于其它生物大分子。经过自我复制出来的每一个我复制出来的每一个DNA分子中的分子中的一条链被保留下来。这种复制，称一条链被保留下来
20、。这种复制，称为半保留复制（为半保留复制（Semi conservative replication）（如图）（如图1-3）。）。n（2）DNA是遗传基因的载体是遗传基因的载体 可以从分子水平上阐明其生物学功能：可以从分子水平上阐明其生物学功能：图图1-3 半保留复制示意图半保留复制示意图n（3）DNA双螺旋结构模型为遗双螺旋结构模型为遗传信息的保存、传递和利用提供传信息的保存、传递和利用提供了基础。同时，根据了基础。同时，根据1970年年Crick等人提出的分子生物学中心法则，等人提出的分子生物学中心法则，如图如图1-4所示。所示。n（4）DNA的调节功能的调节功能1961年，法年，法国 分
21、 子 生 物 学 家国 分 子 生 物 学 家 F.J a c o b 和和J.Monod首次证实在大肠杆菌（）首次证实在大肠杆菌（）基因调节事实，提出了乳糖操纵基因调节事实，提出了乳糖操纵子（子（Lac Operon）假说。）假说。图图1-4 分子生物学中心法则分子生物学中心法则5l应用乳糖操纵子假说，从分子水平上阐明基因控制蛋白质的诱导合成应用乳糖操纵子假说，从分子水平上阐明基因控制蛋白质的诱导合成另一种酶合成调节与酶的诱导合成机制不同，称为酶的反馈阻遏。另一种酶合成调节与酶的诱导合成机制不同，称为酶的反馈阻遏。n第一节第一节 概概 述述n第二节第二节 工具酶工具酶n第三节第三节 目的基因
22、制备目的基因制备n第四节第四节 基因载体基因载体n第五节第五节 基因重组基因重组n第六节第六节 转化、增殖和表达转化、增殖和表达n第七节第七节 基因工程在食品工业中应用基因工程在食品工业中应用n第八节第八节 后基因组学及其应用研究后基因组学及其应用研究第二章第二章 食品与基因工程食品与基因工程第一节第一节 概概 述述一、基因工程的诞生一、基因工程的诞生l1973年等在美国科学院学报（年等在美国科学院学报（PNAS）上发表了题为）上发表了题为“Construction of Biological Functional Bacterial Plasmid in Vitro”，阐明了体外构建的，阐明
23、了体外构建的细菌质粒能够在细胞中进行表达，标志着基因工程的诞生细菌质粒能够在细胞中进行表达，标志着基因工程的诞生 二、基因工程涵义、特点及其操作步骤二、基因工程涵义、特点及其操作步骤n基因工程（基因工程（gene engineering）又称）又称为分子克隆（为分子克隆（molecular cloning）或）或重组重组DNA技术（技术（recombinant DNA Technology），其涵义为：用酶学），其涵义为：用酶学方法，将异源基因与载体方法，将异源基因与载体DNA在体在体外进行重组，将形成的重组子外进行重组，将形成的重组子DNA导入宿体细胞，使异源基因在宿体导入宿体细胞，使异源基
24、因在宿体细胞中复制表达，从而达到改造生细胞中复制表达，从而达到改造生物品种或性状，大量生产出人类所物品种或性状，大量生产出人类所需要生物品种和产物。需要生物品种和产物。n基因工程操作过程如图基因工程操作过程如图2-1所示。所示。图图2-1基因工程操作过程示意图基因工程操作过程示意图2三、基因工程的发展三、基因工程的发展n1977年英国分子生物学家年英国分子生物学家F.Sanger发明了快速发明了快速DNA测序技术并首先完测序技术并首先完成的全长成的全长5387bp的的174噬菌体基因组全序列的测定噬菌体基因组全序列的测定。n1982年第一个由基因工程菌生产的药物胰岛素已在美国和英国获准使年第一
25、个由基因工程菌生产的药物胰岛素已在美国和英国获准使用。用。n1983年第一个转基因植物培育成功，年第一个转基因植物培育成功，1992年第一个转基因玉米及转基年第一个转基因玉米及转基因小麦植株诞生，因小麦植株诞生，1994年转基因番茄上市。年转基因番茄上市。1996年完成了酵母基因组年完成了酵母基因组DNA（125105bp）的全序列测定。）的全序列测定。2003年人类基因组计划经过年人类基因组计划经过20多年努力已宣布草图描绘成功。为后基因组时代的诞生拉开了序多年努力已宣布草图描绘成功。为后基因组时代的诞生拉开了序幕幕。第二节第二节 工具酶工具酶n在基因工程中应用的酶统称为工具酶（在基因工程中
26、应用的酶统称为工具酶（enzyme of tools）。）。l一、限制性内切酶种类一、限制性内切酶种类l限制性内切酶有三种类型：限制性内切酶有三种类型：I型酶、型酶、II型酶和型酶和III型酶。型酶。lII型酶分子量较小，大约型酶分子量较小，大约20-100kD，是一种简单的单功能酶，作用时，是一种简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需无需辅助因子或只需Mg2+，能识别双链，能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，上特异的核苷酸序列，同时专一性强，而且其识别序列与切割序列相一致。这类酶特别适合同时专一性强，而且其识别序列与切割序列相一致。这类酶特别适合于基因工程操作。于基因工程操作。l二、限制性
27、内切酶命名二、限制性内切酶命名l1973年，和年，和Nathaus提出限制性内切酶的命名原则提出限制性内切酶的命名原则 一、限制性内切酶一、限制性内切酶l限制性内切酶（限制性内切酶（restriction endonuclease 简称简称RE）是一类专一性很强）是一类专一性很强的核酸内切酶的核酸内切酶 l三、限制性内切酶的作用机制和作用方式三、限制性内切酶的作用机制和作用方式n如图如图2-2所示所示图图2-2限制性核酸内切酶作用机制限制性核酸内切酶作用机制 l其作用方式及识别位点有如下几种：其作用方式及识别位点有如下几种：l1.识别不同的特异核苷酸序列识别不同的特异核苷酸序列lEcoR I识
28、别识别lHae I识别识别 53GAATTC 5()()3 ATGGCCTAnAsu I识别识别 nEcoR II识别识别nMbo I识别识别 n注：注：表示切割表示切割5-磷酸二酯键位置。磷酸二酯键位置。n3.切割后形成各种粘性末端或平整末端，按其切割双链的方式可分切割后形成各种粘性末端或平整末端，按其切割双链的方式可分两种：粘性末端和平整末端。两种：粘性末端和平整末端。53 GGACC5()3 ACCGGT53 GATC5335GGATCCGGATCCCCTAGGGGATCC正读时为反读时为l限制性内切酶错位切割限制性内切酶错位切割DNA双链而形成彼此互补的单链末端，称双链而形成彼此互补的
29、单链末端，称为粘性末端（为粘性末端（Cohesion ends）。）。n另一种是在同一位点平齐切割另一种是在同一位点平齐切割DNA两条链而形成的双链末端，称为平整末端两条链而形成的双链末端，称为平整末端（Flush ends）。如）。如Alu I的识别序列为：的识别序列为：l4.切割后形成异源二聚体切割后形成异源二聚体l四、限制性内切酶识别序列及反应系统四、限制性内切酶识别序列及反应系统l限制性核酸内切酶在双链限制性核酸内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列称为识别序列。上能够识别的特殊核苷酸序列称为识别序列。l稀切酶（稀切酶（rare cuting enzymes），如表），如表2-1
30、所示所示，同裂酶（，同裂酶（isoschizomer）如表）如表2-2所所示。同尾酶（示。同尾酶（isocaudamer），如表），如表2-3所示。所示。表表2-1 部分限制性内切稀切酶部分限制性内切稀切酶2稀切酶切 割 位 点 数识别序列Ad2SV40X174M13mp7PBr322T7TPAA.DFseIGGCCGGCCO30000001NotIGCGGCCGC070000000RsrIICGGWCCG520000110SfiIGGCCN5CCGG031000112SgrICrCCGGyG760001000SwaIATTT/AAAT011010101表表2-2 具有相同切割位点的同裂酶具有
31、相同切割位点的同裂酶限制性核酸内切酶识别序列及切割位点限制性核酸内切酶识别序列及切割位点AatI，StuIAAGG/CCTBamHI，BstIG/GATCCAccII，FnuDII，MunI，ThaICG/CGBbnIII，ClaIBbuI，SphIAT/CGATGCATG/CAccIII，BspII，MroIT/CCGGABbrPI，PmaCICAC/GTGAcyI，AhaII，AnsII，BbiIIGr/CgyCBcnI，NciIBspRI，HaeIII，PatICC/sGGGG/CCAflI，AuaII，Eco471G/GwCCBstYI，MflI，XhoIIR/GATCyAflII，B
32、frIC/AATTGCcrI，PaeR71，XhoI，SexIC/TCGAGAhaIII，DraITTT/AAACelII，EspIGC/TnAGCAocI，Bsu361，Crnl,Eco811CC/TnAGGCfoI，HhaICfrI，EaeIGCG/CY/GGCCrAocII，BmyI，Bsp1286，NspII，SduIGdGCh/CDarII，EcoO1091EagI，EclXI，Eco521rG/GnnCCyC/GGCCGAosI，AuiII，PspITGC/GCAEcoT141，StyIC/CwwGGApaLI，SnoIG/TGCACEcoVIII，HindIIIA/AGCTTAp
33、yI，BstNI，MvaICC/wGGHapII，HpaII，MspIC/CGGAquI，AvaI，AvrI，NspIIIC/yCrGHincII，HindIIGty/rACAseI，AsnIAT/TAATKsPI，SacII，SstIICCGC/GGAsp7001，XmnIGAAnn/nnTTCNspHI，NsPIrCAtG/yAspHI，HgiAIGwGCw/GPvuI，XorIICGAT/CGAspI，Tth111GACn/nnGTCSacI，SstIGAGCT/CAspI，Cfr131，NspIV，Sau961G/GnCCTaqI，TthHB81XamI，XcyIT/CGAC/CCGG
34、GAsuII，BstBI，NspV，SfuITT/CGAA表表2-3 部分限制性核酸内切同尾酶部分限制性核酸内切同尾酶2黏性末端限 制 性 核 酸 内 切 酶5CATGAflIII，DsaI，NcoI，StyI，BspHI5GATCSau3A，NdeII，BglII，XhoII，BamHI，MleI，BelI5GGCCEclXI，EaeI5CGCGMluI，AflIII，BssHII，DsaI5CCGGCfr10，AgeI，XmaI，AvaI，MorI5TCGASaeI，XhoI，AvaI5GTACSap718，BanI，SphI5CTAGSpeI，NheI，AvrII，StyI，XbaI5C
35、GMaeI，AcyI，HinPI，NarI，HpaII，MspI，TaqI，ClaI，AccI，SfuI5TANdeI，MaeI，MseI，AsnICATG3NlaIII，NspI，SphIAGCT3SacI，BanII，BmyIGGCC3ApaI，BanII，BmyI，AspHITGCA3NsiI，AspHI，BmyI，PstIGCGC3HaeII，BbeI二、基因工程操作中的其他酶二、基因工程操作中的其他酶（一）、（一）、DNA连接酶连接酶（二）、（二）、DNA聚合酶聚合酶I（三）、碱性磷酸酯酶（三）、碱性磷酸酯酶（四）、（四）、T4多聚核核苷酸激酶多聚核核苷酸激酶（五）、（五）、S1核酸
36、酶核酸酶（六）、反向转录酶（六）、反向转录酶第三节第三节 目的基因制备目的基因制备n原核生物基因的分离多采用前法，而真核细胞基因的分离则采用后两原核生物基因的分离多采用前法，而真核细胞基因的分离则采用后两种方法。种方法。一、生物学方法一、生物学方法l原核生物中常用鸟枪射击法或滔弹散射法（原核生物中常用鸟枪射击法或滔弹散射法（shotgun cloning）来克隆）来克隆分离基因。此法优点是：快速简便、产物纯度高，是真正的天然基因，分离基因。此法优点是：快速简便、产物纯度高，是真正的天然基因，兼有外显子和内含子。兼有外显子和内含子。l另一种生物学方法是采用分子杂交手段。另一种生物学方法是采用分子
37、杂交手段。1973年年，Shin和和Martin用分用分子杂交技术分离目的基因获得成功。子杂交技术分离目的基因获得成功。二、化学合成法二、化学合成法化学合成一个循环有如下化学合成一个循环有如下4个步骤：个步骤：l整个合成反应历程如图整个合成反应历程如图2-3表示。表示。图图2-3 固定化亚磷酸三酯法合成寡聚核苷酸固定化亚磷酸三酯法合成寡聚核苷酸三、基因文库法三、基因文库法n基因文库（基因文库（gene library）或称为）或称为DNA文库，它是指用克隆方法将一文库，它是指用克隆方法将一种生物全部基因组以重组体的方式长期保持在适当的宿主中。当需要种生物全部基因组以重组体的方式长期保持在适当的
38、宿主中。当需要重组体重组体DNA某一片段时，便可以在此文库中查找。基因文库又称为某一片段时，便可以在此文库中查找。基因文库又称为cDNA文库文库34。cDNA文库构建的步骤：文库构建的步骤：l1.酶促合成法制取酶促合成法制取cDNAl2.从组织或细胞中制备总从组织或细胞中制备总RNA和和mRNAl3.合成合成cDNA第一条链第一条链l其反应过程为图其反应过程为图2-5的所示。的所示。图图2-5 合成合成cDNA第一链反应过程第一链反应过程l4.cDNA第二条链的合成，其反应历程如图第二条链的合成，其反应历程如图2-6所示。所示。图图2-6 置换法合成置换法合成cDNA反应过程反应过程四、四、P
39、CR扩增法扩增法n1985年，美国年，美国Cetus公司的公司的Mullis等人开发成功的聚合酶等人开发成功的聚合酶链式反应（链式反应（Polymerase chain reaction，PCR）技术，这一）技术，这一快速地扩增特异快速地扩增特异DNA片段系片段系统在分子生物学领域中是一项统在分子生物学领域中是一项重大的革新。重大的革新。n其反应历程如图其反应历程如图2-7所示。所示。图图2-7 PCR扩增技术基本原理扩增技术基本原理第四节第四节 基因载体基因载体n目前，在基因工程中应用的基因载体主要是质粒、病毒和噬菌体，它目前，在基因工程中应用的基因载体主要是质粒、病毒和噬菌体，它们都能担当
40、无性繁殖载体。因为它们均符合作为载体应具备的下列条们都能担当无性繁殖载体。因为它们均符合作为载体应具备的下列条件：件：n（1）本身是一个复制子，能自我复制；）本身是一个复制子，能自我复制；n（2）相对分子质量较小，）相对分子质量较小，n（3）能给宿主细胞（受体细胞）提供可选择标记）能给宿主细胞（受体细胞）提供可选择标记 n（4）只有单一限制性内切酶切点）只有单一限制性内切酶切点一、质一、质 粒粒l质粒（质粒（plasmid）存在于细菌、放线菌及酵母细胞内细胞质中双螺旋）存在于细菌、放线菌及酵母细胞内细胞质中双螺旋共价闭环的共价闭环的DNA（covalently,closed and circu
41、lar DNA,缩写为缩写为cccDNA）。它能进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。）。它能进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。（一）质粒载体（一）质粒载体pBR322npBR322是目前应用最广泛的人工构建的载体之一。如图是目前应用最广泛的人工构建的载体之一。如图2-8所示所示5。用小写英文字母用小写英文字母P代表质粒，代表质粒，BR表示该质粒表示该质粒 研究者研究者Bolivar 和和Rogigerus，而，而322是具体研究编号。是具体研究编号。pBR322大小为大小为4363bp，（，（1bp=1碱基对）含有碱基对）含有2个抗生素抗性基因个抗生素抗性基因。npBR322质粒具有抗菌素抗
42、性基因质粒具有抗菌素抗性基因，构建的，构建的pBR325、pBR327如图如图2-9、图图2-10所示。所示。图图2-9 pBR325衍生质粒衍生质粒 图图2-10 pBR327衍生质粒衍生质粒（二）质粒载体（二）质粒载体PUCnpUC质粒是在质粒是在pBR322的基础上，在的基础上，在未端加入一段多克隆位点未端加入一段多克隆位点（multiple cloning sites,MCS）的）的LacZ基因。基因。二、二、噬菌体噬菌体l噬菌体（噬菌体（Phage）是病毒的一种，形态微小，只能在电子显微镜下才）是病毒的一种，形态微小，只能在电子显微镜下才能观察到。能观察到。三、三、M13噬菌体噬菌体
43、四、病毒四、病毒第五节第五节 基因重组基因重组n基因重组即将目的基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重基因重组即将目的基因（或外源基因）与载体在体外结合构建形成重组子。组子。图图2-11 DNA体外重组方式体外重组方式 第六节第六节 转化、增殖和表达转化、增殖和表达一、转化一、转化1、宿主细胞、宿主细胞2、感受态、感受态3、扩增检筛、扩增检筛 R.K.Saiki和和K.B.Mullis分别于分别于1985年和年和1987年发展了一种年发展了一种“多聚酶多聚酶链反应（链反应（polymerase chain reaction,PCR）”。PCR技术操作步骤为：反复将目的基因片段进行热变性处
44、理，技术操作步骤为：反复将目的基因片段进行热变性处理，令其双股链解开；进行反链杂交、退火、形成单链；用令其双股链解开；进行反链杂交、退火、形成单链；用Taq DNA多聚酶沿多聚酶沿DNA链全程全成出两股双链链全程全成出两股双链DNA分子；然后开始第二个分子；然后开始第二个反应周期反应周期。二、基因表达二、基因表达 克隆克隆DNA的最终目的是表达最终目的产物。因此，通过的最终目的是表达最终目的产物。因此，通过DNA重重组技术使特定基因片段在受体细胞内大量增殖，拷贝数目大大增加，组技术使特定基因片段在受体细胞内大量增殖，拷贝数目大大增加，就必须使特点基因进一步转录、翻译为相应的蛋白质（或酶），进而
45、就必须使特点基因进一步转录、翻译为相应的蛋白质（或酶），进而获得它们的代谢产物，这一过程获得它们的代谢产物，这一过程称为基因表达。称为基因表达。第七节第七节 基因工程在食品工业中应用基因工程在食品工业中应用一、转基因微生物食品一、转基因微生物食品转基因微生物菌株则称为工程菌（转基因微生物菌株则称为工程菌（engineering strain）。）。（一）应用于提高食品产品的品质（一）应用于提高食品产品的品质第 一 个 采 用 基 因 工 程 改 造 的 食 品 微 生 物 为 面 包 酵 母第 一 个 采 用 基 因 工 程 改 造 的 食 品 微 生 物 为 面 包 酵 母（saccharo
46、myces cerevisiae）。）。1991年，英国政府批准通过了年，英国政府批准通过了DNA重重组面包酵母工程菌的商业化应用组面包酵母工程菌的商业化应用7。在啤酒酿造中。在啤酒酿造中一乙酰乳酸通过一乙酰乳酸通过自发氧化作用形成双乙酰，双乙酰形成机理及其基因重组控制双乙酰自发氧化作用形成双乙酰，双乙酰形成机理及其基因重组控制双乙酰如图如图2-12、图、图2-13所示。所示。图图2-12 啤酒酿造中双乙酰形成机理啤酒酿造中双乙酰形成机理图图2-13 啤酒酵母导入啤酒酵母导入-乙酰乳酸脱羧酶基因后双乙酰酶促转化乙酰乳酸脱羧酶基因后双乙酰酶促转化（二）应用于简化工艺，缩短生产周期（二）应用于简化
47、工艺，缩短生产周期近年来，在一个啤酒酵母菌株中表达了一个内源性的近年来，在一个啤酒酵母菌株中表达了一个内源性的PGUI基因，结果基因，结果发现这个重组菌株能够分泌有活性的内聚半乳糖酸酶，可以大大缩短葡萄酒发现这个重组菌株能够分泌有活性的内聚半乳糖酸酶，可以大大缩短葡萄酒的过滤时间。的过滤时间。（三）应用于食品的抗菌和防腐保鲜（三）应用于食品的抗菌和防腐保鲜现将工程菌在食品工业应用较多的菌株如列表现将工程菌在食品工业应用较多的菌株如列表2-4所示。所示。表表2-4 基因工程改良的微生物工程菌基因工程改良的微生物工程菌工程菌名称改造的方式用 途Lactobacillus修饰细菌素合成乳制品生产、无
48、污染物质生产Lactococcus修饰蛋白酶活性乳制品生产加速干酪熟化避免噬菌体感染提高菌种稳定性修饰溶菌酶合成干酪生产，预防杂菌感染Saccharomyces葡聚糖酶基因导修啤酒酵母中表达啤酒生产，缩短发酵时间Cerevisiae饰豌豆脂肪氧化酶增强面团流变学物性及稳定性Saccharomyces Carlsbergensis修饰来自Enterobacter aerogenes或Aceto-bacter pasteurianus的a-乙酸乳酸脱羧酶基因缩短酿造周期修饰来自Aspergieeus niger 的葡萄糖淀粉酶基因应用于淀粉降解和低热量啤酒的生产修饰来自Schwanniomyces
49、 occidentalis的淀粉酶和葡萄糖淀粉酶应用于淀粉酒精和低热量啤酒的生产葡聚糖酶应用于葡聚糖降解和啤酒过滤澄清Saccharomyces Cerevisiae-1,4-葡聚糖酶基因导入葡萄酒酵母中表达增加酿制酒的果香味萜类化合物形成（四）应用于食品级酶制剂生产菌的改良（四）应用于食品级酶制剂生产菌的改良 凝乳酶（凝乳酶（chymosin）是第一个应用基因工程技术把小牛胃中的）是第一个应用基因工程技术把小牛胃中的凝乳酶基因转移至细菌或真核微生物生产的一种酶。凝乳酶基因转移至细菌或真核微生物生产的一种酶。现将现将NovoNordisk、Gist-Brocades等公司采用基因工程改良霉菌等
50、公司采用基因工程改良霉菌种列于表种列于表2-5、表、表2-6、表、表2-7。表表2-5 丹麦丹麦Novo Nordisk公司利用基因工程改良产酶微生物菌种公司利用基因工程改良产酶微生物菌种12（5）应用于生产保健食品的有效成分）应用于生产保健食品的有效成分n现在，可以采用转基因手段，在动、植物或其细胞中，得到基因表达现在，可以采用转基因手段，在动、植物或其细胞中，得到基因表达而制造有益于人类健康的保健成分或有效因子。采用基因重组构建军而制造有益于人类健康的保健成分或有效因子。采用基因重组构建军一株高表达的单链蛋白还原酶，以加速催化生成维生素一株高表达的单链蛋白还原酶，以加速催化生成维生素C的前
