1、免疫学实验技术及荧光定量免疫学实验技术及荧光定量PCR内容提要 抗原和抗体抗原和抗体 ELISA Western blot 免疫组化（免疫荧光）免疫组化（免疫荧光）Real Time PCR抗原和抗体u 抗原的基本知识u 抗体的基本知识u 多克隆抗体u 单克隆抗体抗原和抗体抗原的基本知识抗原的基本知识l 定义：抗原（antigen）是能够刺激机体产生免疫应答的效应物质（抗体和致敏淋巴细胞），并能与之特异性结合的物质。l 两个基本特性：免疫原性（immunogenicity）：能够刺激机体产生抗体和效应T淋巴细胞的免疫反应能力。抗原性（antigenicity）：与免疫反应最终产物（如抗体和/或
2、T细胞表面受体）特异结合的能力。l 完全抗原与半抗原l 抗原表位（Epitopes）：抗原决定簇。存在于抗原分子中，决定抗原特异性的基本结构或化学基团。是与TCR/BCR及抗体结合的基本单位。抗原和抗体抗体的基本知识抗体的基本知识l 定义：antibody。指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。l 结构与功能：1）重链轻链；2）超变区是抗原结合位，与抗原表位互补；3）抗体Fc片段上两结构域共同与细胞膜Fc受体结合，发挥不同的生物学效应。l 应用医学应用：1.诊断：各类血清学检测，抗人球蛋白测试，早孕检测等。2.治疗：
3、单克隆抗体疗法（类风湿性关节炎多发性硬化症等），肿瘤治疗。科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等。抗原和抗体多克隆抗体多克隆抗体抗原多个表位诱导多种B细胞克隆增殖与分化，产生多种抗体的混合物。特点：多抗是单抗的混合物，群体综合的性质。更容易捕捉抗原。特异性相对较差：交叉反应抗体的纯化、标记难。抗原和抗体多克隆抗体制备多克隆抗体制备动物选择：兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多。（新西兰,大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少。（BALB/C,昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物。（Wistar大鼠）羊（
4、sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）。马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用。抗原和抗体多克隆抗体制备多克隆抗体制备延长抗原的作用时间增强吞噬作用刺激抗原提呈促进细胞因子分泌诱导淋巴细胞分裂、增殖影响T细胞“极化”佐剂的作用机理：佐剂的作用机理：抗原制备：抗原制备：商品化或自行表达基础免疫：基础免疫：首次，抗原用量大，用弗式完全佐剂（含矿物油,卡介苗等)。加强免疫：加强免疫：第2次以后，抗原量减半，多次，间隔2-4周，用弗式不完全佐剂(不含卡介苗).取血测效价：取血测效价：加强免疫两次或三次以后的第7天取血。放血制
5、备血清：放血制备血清：可一次放血(颈动脉)也可多次取血(耳静脉)过程（简单了解）：抗原和抗体单克隆抗体单克隆抗体单个抗原表位诱导单种B细胞克隆增生与分化，产生单克隆抗体。什么情况下需要制备单克隆抗体什么情况下需要制备单克隆抗体？目的蛋白有结构类似物抗原不纯，无法分开多抗效果不好（已排除非特异性反应）希望将抗体用于治疗，研制成药品希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂ELISAu 基本原理u 方法种类u 实验操作u 应用u 常见问题分析u 写作实例ELISA基本原理基本原理 全称：酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay）原理：（1）固相的抗原或抗体，即
6、“免疫吸附剂”；（2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”；辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）（3）酶反应的底物。ELISA方法种类方法种类直接法检测Ag将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可测定抗原总量。优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。缺点：实验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。ELISA方法种类方法种类间接法检测Ab用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标二抗，加底物显色。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性。缺点：交互反应发生的机率较高。ELISA方法
7、种类方法种类双抗体夹心法检测Ag将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗原成正比。适用于某些大分子的具有至少双表位的抗原，而不能用于小分子半抗原的检测。优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。ELISA方法种类方法种类其他方法双抗原夹心法、竞争法、捕获法、基于细胞法酶酶底物底物颜色颜色HRP3,3,5,5-四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)+H2O2黄色黄色(450nm)邻苯二胺邻苯二胺(OPD)+H2O2橙红橙红(429nm)5-氨基水杨酸氨基水杨酸(5-ASA
8、)+H2O2棕色棕色(550nm)鲁咪诺鲁咪诺+H2O2荧光荧光AP对硝基苯磷酸酯对硝基苯磷酸酯(P-NPP)黄色黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯甲基伞基磷酸酯(4-MuP)荧光荧光-半乳糖苷酶半乳糖苷酶4-甲基伞基甲基伞基-半乳糖苷半乳糖苷荧光荧光ELISA实验操作实验操作包被：聚苯乙烯板封闭：0.12%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清孵育：加抗原/抗体洗涤：PBST、TBST、PBS等显色：避光发色结果测定：吸光值 待测孔（P）与阴性对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2者为阳性。ELISA应用应用ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检
9、测一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原。检查抗原和半抗原方面：在内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等；在血液学方面可用于检查凝固因子（如第凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（Hapto Globin）等；在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（CEA）。检查抗体方面：用ELISA间接法检查抗体，已获得对多种传染病和寄生虫病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查。在寄生虫病方面，它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断；在免疫性疾病方面有
10、试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过敏原的抗体、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等；在卫生学方面，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等。ELISA常见问题分析常见问题分析 阴性对照出现阳性结果试剂或样品可能被污染，或者由于孔之间的溅洒出现交叉污染。酶标板洗板不彻底。抗体量过多导致非特异结合。夹心法、捕获法中检测抗体与包被抗体/抗原交互反应。酶标板整体背景高抗体非特异性结合。底物结合浓度过高或反应时间过长。底物溶液不新鲜或被污染。底物孵育过程没有避光。吸光度数值偏高或偏低样品中待检抗原含量太低会导致测试结果偏低。加入抗体量不合适也会造成结果偏低或偏高孵
11、育时间不够长会导致检测结果偏低孵育温度不适合。ELISA写作实例写作实例详细描述IF=3.534ELISA写作实例写作实例抗体浓度抗原种类AbsIF=3.534ELISA写作实例写作实例引用文献ELISA写作实例写作实例浓度时间ELISA写作实例写作实例操作手册ELISA写作实例写作实例浓度组别Western blotu 定义及原理u 应用u 实验操作u 常见问题分析u 半定量分析u 写作实例定义及原理定义及原理 定义：又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后 利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。原理：Western blot应用应用Western blotWestern Blo
12、t 被广泛地应用于蛋白质研究，基础医学和临床医学的研究。目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的半定量分析实验操作实验操作Western blot转膜转膜免疫反应免疫反应显色或发光显色或发光蛋白定量蛋白定量SDS-PAGE蛋白提取蛋白提取封闭封闭实验操作实验操作Western blot步骤一、蛋白提取 WB过程中最重要的一点就是确定目的蛋白在组织、细胞中的定位定位，选择合适的提取方法把目的蛋白提取出来才能进行后续的实验。防止蛋白质的降解防止蛋白质的降解 冰上操作 加入蛋白酶抑制剂 Bac-细菌蛋白抽提试剂 Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 Yea-酵母蛋白抽
13、提试剂 Tis-组织蛋白抽提试剂 Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂实验操作实验操作Western blot步骤二、蛋白定量实验操作实验操作Western blot步骤三、SDS-PAGEE ESDS 是一种离子性的表面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链。当 SDS 与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质的疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以磺酸根离子外露与水分子作用。大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4(以重量为单位)，而蛋白质结合固定比例的SDS 后，由于 SDS 带强负电荷，使蛋白质原先所带电荷显得微不足道,且每单位重量的蛋白质所带电荷一致，所以不同蛋白质的迁移率
14、大小就主要由蛋白分子大小这一主要因素决定。实验操作实验操作Western blot步骤三、SDS-PAGE凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212Staking gelSeparating gel实验操作实验操作Western blot步骤四、转膜 膜的选择：膜的选择：NC、PVDF、尼龙膜 转膜方法：转膜方法：半干转、湿转 转膜确认：转膜确认：立春红染色、蛋白预染Marker实验操作实验操作Western blot步骤四、转膜实验操作实验操作Western blot步骤四、转膜p 半干转半干转 用滤纸吸Buffer来
15、做转移体系的转移方法；适合转移小分子量的蛋白；半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据 蛋白分子大小定的；56mA/膜 1h p 湿转湿转 将膜、胶、滤纸整个浸泡在Buffer的Tank里转移的 方法；适合转移大分子量（100KD以上）蛋白；湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定；300mA 1h实验操作实验操作Western blot步骤四、转膜u丽春红丽春红 可逆染色，检测转膜效率。与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。u蛋白预染蛋白预染Marker 实时监测 分子量参照 与目的蛋白同时转移至印迹膜上，检测转膜效率。u对转膜后的凝胶进行考染对转膜后的凝胶进行考染转膜确认实验操作实验操作
16、Western blot步骤五、封闭为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背景，因此需要进行膜的封闭，去除非特异结合位点。常用的封闭液：常用的封闭液：Blocking Buffer：3%BSA 5%MilkRoom Temperature 1 h 实验操作实验操作Western blot步骤六、抗体孵育一抗一抗选择选择：单单克隆克隆抗抗体体 或者 多多克隆克隆抗抗体体 直接标记的抗体直接标记的抗体 或者 未标记的抗体未标记的抗体 抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数.实验
17、操作实验操作Western blot步骤六、抗体孵育 二抗的选择：二抗的选择：抗小鼠抗小鼠抗兔抗兔抗大鼠抗大鼠抗人抗人抗山羊抗山羊抗鸡抗鸡抗豚鼠抗豚鼠抗马抗马标记物标记物HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记、荧光标记、无标记荧光标记抗体荧光标记抗体红色Cy3、TRITC、RRX、Texas Red X、Dylight549、Dylight 594、Dylight 649绿色FITC、Cy2、Dylight488蓝色AMCA近红外线Cy5根据一抗物种：根据标记物：实验操作实验操作Western blot步骤七、检测方法化学发光法：化学发光法：常用HRP酶标系统酶标系统的显色底物为ECL鲁
18、米诺（Luminol）特点：特点：无毒害、灵敏度高、速度快；特异性好、节省抗体、线性宽；可重新剥离检测。化学显色法：化学显色法：常用酶标系统酶标系统HRP的显色底物为TMB和DAB 酶标系统酶标系统AP的显色底物为BCIP和NBT 特点：特点：方便、便宜；具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢；检测后的膜不可重新剥离检测。实验操作实验操作Western blot步骤七、检测方法常见问题分析常见问题分析Western blot没有阳性条带或很弱可能原因一抗、二抗等不匹配一抗或/和二抗浓度低转膜不充分,或洗膜过度过度封闭二抗受叠氮钠抑制曝光时间过短封闭剂与一抗或二抗有交叉反应验证或解决办法认真选取一
19、抗与组织种属,可设置内参以验证二级检测系统的有效性。使用温和的去污剂，如TWEEN20，或更换封闭剂（常用的脱脂奶、BSA、血清或明胶延长曝光时间所用溶液和容器中避免含有叠氮钠(HRP的抑制剂)更换合适的封闭剂、降低封闭剂浓度或减少封闭时间使用丽春红S检测转膜效果,PVDF膜需浸透，需正确的转膜操作,勿过度洗膜增加抗体浓度，延长孵育时间常见问题分析常见问题分析Western blot背景高一抗或二抗与封闭剂 有交叉反应可能原因封闭不充分一抗浓度过高抗体孵育温度过高二抗非特异性结合洗膜不充分膜干燥验证或解决办法延长封闭时间，更换合适的封闭剂（脱脂奶粉，BSA，血清等）增加一抗稀释倍数,低温孵育（
20、如4)设置二抗对照(不加一抗),降低二抗浓度 在孵育和洗涤液中加入Tween-20 以减少交叉反应.增加洗涤次数保证充分的反应液，避免出现干膜现象常见问题分析常见问题分析Western blot条带位置不对可能原因表达的蛋白具有多种修饰形式（乙酰化、磷酸化、甲基化、烷基化、等）蛋白样本降解一抗浓度过高二抗浓度过高，产生的非特异性结合抗体未纯化蛋白存在二聚体或多聚体验证或解决办法查文献，使用去修饰的试剂使蛋白恢复其正确的大小使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂 降低抗体浓度，可以减少非特异性条带 降低抗体浓度，增加二抗对照，选择特异性更强，只针对重链的二抗 使用单克隆或亲和纯化的抗体，减少非特
21、异条带 SDS-PAGE电泳上样前，煮沸10min，以增强蛋白质解聚变性Western blot半定量分析半定量分析灰度分析软件：Quantity One、BandScan、BandLeader、Sigma Gel、Image J等常用的蛋白质内参有GAPDH和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。内参：一般是指由管家基因编码表达的蛋白。在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。ELISA与Western
22、 blot比较v Western blot 可以看到特异性的条带，但是定量比较麻烦；v ELISA可以直接读出浓度，但是如果抗体有非特异性结合，那得到的数值就不可信；v WB只能半定量，但是可以检测细胞膜蛋白，这点ELISA做不到；v WB所检测的一般是抗原，而ELISA抗原抗体都可以检测；v WB所检测的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚体、降解产物等，WB可以确定所用抗体是与哪种蛋白起作用的，而ELISA无能为力；v WB一次处理量就是一块胶板，最多10-20个样品。ELISA一块96孔板一次可以处理96个样本，可以设置多个复孔、对照、梯度样等来提高检测的可信度。写作实例写作实例We
23、stern blot详细描述写作实例写作实例Western blot显影结果+定量分析 DEDD:Death Effector Domain-containing DNA binding protein相对表达量写作实例写作实例Western blotIF=9.284更加详细写作实例写作实例Western blotIF=9.284Metformin：二甲双胍（抗糖尿病药、降血糖药）人乳腺癌细胞株MCF-7 mTOR signaling pathway 显影结果差异明显写作实例写作实例Western blot不作方法描述IF=31.477细胞因子刺激磷酸化水平免疫组化u 定义及原理u 应用u 分
24、类及实验方法u 结果分析u 常见问题分析u 写作实例定义及原理定义及原理免疫组化 定义：用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。原理：根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原
25、位确定某些化学成分的分布和含量。应用应用免疫组化v 用途:对目的蛋白进行定性、定位和定量分析。v 优点：能够明确目的蛋白的细胞定位、亚细胞定位及多种蛋 白之间的相互位置关系v 局限性：敏感性差，蛋白定量效果差。分类分类免疫组化 按标记物质的种类 如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。按染色步骤 可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。按结合方式 分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素
26、蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等；聚合物链接，如即用型二步法。免疫荧光法免疫荧光法免疫组化 免疫荧光法:最早建立的免疫组织化学技术。基本原理：它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。优点：由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。免疫荧光法免疫荧光法免疫组化 固定：醛类（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）、醇类（常用乙醇）、其它（丙 酮），4固定过夜或室温固定0.5h
27、 通透化：0.1%TritonX-100，置于冰上15min。封闭：1BSA 37封闭1h。一抗孵育：4孵育过夜或室温孵育2h。二抗孵育：放上玻片，室温孵育1h。染核：加入DAPI，室温避光染色。封片：甘油封片。镜检：4避光保存免疫荧光法免疫荧光法免疫组化FluorochromeExcitation(nm)Emission(nm)ColorDAPI365420BlueFluorescein495525GreenHoechts 33258360470BlueR-phycocyanin555,618634RedB-phycoerythrin545,565575Orange,redR-phycoer
28、ythrin480,545,565578Orange,redRhodamine552570RedTexas red596620Red常用荧光素免疫荧光法免疫荧光法免疫组化3T3 LinePtK1 LineNBL-6 LineRK13 LineLongitudinal Fissure大脑纵裂Blood VesselsCerebellum小脑即用型二步法即用型二步法免疫组化 常用的标记酶及其显色底物 辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)：DAB或AEC显色系统（结果染为棕黄色）碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)：NBT/BCIP（结果染为
29、蓝黑色）ABC法法免疫组化一抗、生物素化的二抗、ABC复合物（亲和素+酶标生物素）产生多级放大，从而提高生物反应的敏感性和特异性。生物素和亲和素有很强的亲和力，比抗原-抗体的亲和力要高一万倍以上。卵白素-生物素-过氧化物酶复合物SP三步法三步法免疫组化脱蜡与水化脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 抗原修复、暴露抗原修复、暴露抗原决定簇抗原决定簇 封闭非特异性蛋封闭非特异性蛋白白 一抗孵育一抗孵育 生物素标记的二抗二抗孵育生物素标记的二抗二抗孵育 SP(链霉亲和素链霉亲和素-过氧化物酶过氧化物酶)反应反应 显色显色 复染、脱水、复染、脱水、透明、封片透明、封片 细胞通透、封闭细胞通透、
30、封闭内源性过氧化物内源性过氧化物酶酶 ABC法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合。灵敏特异性低，成本低。灵敏特异性低，成本低。结果分析结果分析免疫组化阳性着色细胞计数法：在40*光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组36张不同动物组织切片，然后进行组间比较即可。Melatonin：褪黑素：褪黑素 Hy:hypoxia缺氧缺氧Nestlin:巢蛋白，特异性的表达在神经上皮干细胞神经干细胞增殖分化Journal of Pineal Research IF=7.812结果分析结果分析免疫组化 灰密度分析法：通过在不同组别和不同动物组织切片上选择相同区域
31、、相同条件下用Image pro plus进行灰密度分析，然后进行统计分析即可。结果分析结果分析免疫组化 评分法：通过在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（03分为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围进行评分（14分为025%、2650%、5175%、76100%），最终可以分数相加，再进行比较。v 相同曝光时间、相同显色时间v 大体分为阴性、弱阳性、阳性BDCAEFGHNormal常见问题分析常见问题分析免疫组化原因原因 解决办法解决办法抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4过夜 孵育温度过高，孵育温度超过37一般室温20-28
32、 DAB显色时间过长或DAB浓度过高显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准 染色过强常见问题分析常见问题分析免疫组化 染色弱原因解决办法抗体浓度过低，孵育时间过短 提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟试剂超过有效使用期及时更换试剂操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）室温太低，低于15若室温低于15度，要改放在37孵育箱孵育30-60分钟（或4冰箱过夜）蛋白封闭过度封闭时间不要超过10分钟常见问题分析常见问题分析免疫组化 染色阴性原因解决办法 操作步骤错误重新试验，设立阳性对照 组织中无抗原 设立阳性对照片，以验证实验结果
33、 一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗与二抗种属无误 常见问题分析常见问题分析免疫组化 非特异性背景染色原因解决办法操作过程中冲洗不充分每步冲洗35 组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长 组织中含内源性生物素 正常非免疫动物血清再封闭 血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间 写作实例写作实例免疫组化IF=1.959写作实例写作实例免疫组化IF=5.006写作实例写作实例免疫组化 IF=3.534写作实例写作实例免疫组化 IF=3.534Real Time PCRu 几个概念u Real Time PCR定义u 应用u 原理u 结果分析u 写作实例Real Time
34、PCR几个概念几个概念PCR，RT-PCR，Real Time PCR，qPCRuPCR：Polymerase Chain Reaction。uRT-PCR：Reverse Transcription PCR，首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。可对基因表达进行相对定量；也有称Real time PCR为RT-PCR。uReal Time PCR：实时聚合酶链反应。uqPCR：Real time Quantitative PCR Detecting System（Real Time PCR），实时荧光定量PCR。Real Time PCR定义定义
35、荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。Real Time PCR应用应用病毒及病原菌定量分析病毒及病原菌定量分析导入基因拷贝数解析导入基因拷贝数解析GMO定量检测定量检测差异显示结果验证差异显示结果验证基因芯片结果验证基因芯片结果验证siRNA效果确认效果确认mRNA表达量分析表达量分析病毒及病原菌检测病毒及病原菌检测物种鉴定物种鉴定基因分型基因分型Real Time PCR原理原理使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方法。激激发发光光发发
36、射射光光CtCt值值Real Time PCR荧光定量PCR与普通PCR比较 实时在线监控实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性 增加定量的精确性增加定量的精确性 全程监控，精确定量 结果分析更快捷方便，结果分析更快捷方便，无需电泳无需电泳 Real Time PCR 扩增曲线（primary curve）随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量
37、的变化，从而得到扩增曲线图。PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线。纵坐标：Rn（荧光值）横坐标：cycle number （循环数）线性期Real Time PCR荧光阈值（threshold）基线基线(baseline)：一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。荧光阀值荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值扩增曲线上人为设定的一个值-缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍,（机器自动设置）。-手动设置：大于样本的荧光背景值手工调整荧光阈值示意图 Real Time PCR
38、Ct 值(Cycle Threshold)Ct值值：在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定；Ct值则极具重现性 起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。Real Time PCR温度荧光强度熔解曲线分析PCR过程结束后，将温度缓慢升高，此时双链DNA解链成为单链，内掺染料会被释放出来，荧光信号逐渐减弱。l将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)峰值代表斜率改变最大时的温度值，即
39、Tm，其值与双链DNA的长度、GC%含量有关，可部分代表序列的特异性Real Time PCR熔解曲线分析融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确引物不特异（杂带或者二聚体）或者掺入gDNAReal Time PCRTaqManProbeCyclingProbeMolecularBeaconetc.荧光染料嵌合法荧光染料嵌合法荧光探针法荧光探针法Real Time PCR的检测方法Real Time PCR荧光染料嵌合法（SYBR Green I）l SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色
40、激发波长的染料。l SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光。l 荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。Real Time PCR荧光染料嵌合法（SYBR Green I）Primer退退 火火 FFFFPol.FPrimerPol.延延 伸伸 FFFFFFPrimer热变性热变性 FFFFReal Time PCR结果分析结果分析通过标准曲线对对照样品、检测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后以管家基因的定量结果为依据对目的基因进行比值校正，求得相对值即为相对表达量。相对值=校正值=目的基因定量结果管家基因定量结果检测样品的校正值对照样品的校正值通过对照样品、检测样品的目的基因及管家基因的Ct值，然后以管家基因的Ct值为依据对目的基因进行差值校正，最终求得相对表达量。双标准曲线法 Ct法相对值=2-Ct(目检-管检)-Ct(目对-管对)写作实例写作实例Real Time PCR写作实例写作实例Real Time PCRIF=5.006谢谢
