1、HPV 竞品分析竞品分析市场部市场部 王飞雁王飞雁HPV 检测检测HPV DNA 检测检测HPV E6，E7 mRNA 检测检测分型分型不分型不分型部分分型部分分型方法方法代表厂家代表厂家PCR-反向点杂交法亚能、凯普、达安、港龙、珠海赛乐奇流式荧光杂交法上海透景杂交捕获（HC2）QIAGEN(凯杰)PCR-荧光探针法港龙、凯普、达安、科华PCR-荧光探针法罗氏bDNA 技术科蒂亚酶切信号放大法（Cervista）HOLOGIC(英硕力)不分型 PCR-PCR-反向点杂交法原理反向点杂交法原理 PCR-反向点杂交法技术特点反向点杂交法技术特点n高灵敏度-PCRn高特异性-核酸分子杂交n高通量-
2、膜上固定多种探针n能实现HPV分型检测 亚亚 能能 凯凯 普普技术原理技术原理PCR+反向点杂交PCR+膜杂交法（实质为PCR+反向点杂交）标本类型标本类型宫颈脱落细胞，疣体组织，病理石蜡切片，液基细胞学标本宫颈脱落细胞检测检测HPV 种类种类l23型l无HPV 44，低危型l21型l无HPV73，83，MM4（82）而73、82型为IARC认定的15种常见高危型之一DNA提取提取l提取试剂只含裂解液一种成分l提取试剂分溶液,提取步骤复杂PCRPCR反应液已分装PCR反应液未分装，需人工配制反应液杂交杂交全自动核酸分子杂交手工杂交结果结果判读判读l显色斑点大，边界清晰l判读结果方便快捷l膜条小
3、，显色斑点小l判读结果时需与对照卡进行比对内部质控内部质控l有真正意义的内部质控l无真正意义的内部质控亚能和凯普亚能和凯普HPV基因分型产品对比基因分型产品对比亚能和凯普膜条显色对比亚能和凯普膜条显色对比亚能亚能凯普凯普膜条尺寸：12mm78mm膜条尺寸：22mm22mm亚能产品与凯普亚能产品与凯普HPV分型产品的比较优势分型产品的比较优势n 有配套的全自动核酸分子杂交仪n 检测HPV 型别多：23型n 有真正意义的内部质控n 可检测更多类型的标本，有文献支持n 灵敏度、特异性、重复性好n PCR扩增体系预分装n 显色斑点大而清晰，易于进行结果判读HPV 检测检测HPV DNA 检测检测HPV
4、 E6，E7 mRNA 检测检测分型分型不分型不分型部分分型部分分型方法方法代表厂家代表厂家PCR-反向点杂交法亚能、凯普、达安、港龙、珠海赛乐奇流式荧光杂交法上海透景杂交捕获（HC2）QIAGEN(凯杰)PCR-荧光探针法港龙、凯普、达安、科华PCR-荧光探针法罗氏bDNA 技术科蒂亚酶切信号放大法（Cervista）HOLOGIC(英硕力)不分型n代表厂家：上海透景n高危型人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒n检测的基因型：19种高危型（16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68,73,83，26,55,61,66），种低危型（6,11,40,42,44,53,
5、54）(无注册证)n进口专用仪器(美国Luminex多功能流式点阵分析仪）流式荧光杂交法流式荧光杂交法流式荧光杂交法流式荧光杂交法流式荧光杂交法是将PCR产物和微球杂交液进行混合，并经过杂交，荧光素标记，Luminex流式分析仪阅读得到相应的检测结果。微球杂交液中包含多种荧光编码微球，每种编码微球的表面都共价交联有与HPV 型别对应的探针，在杂交过程中，探针特异性识别并结合相应的靶序列，经过荧光素反应后形成微球-探针-PCR产物-荧光素的复合物，经Luminex流式分析仪阅读，可以获得每种复合物的微球编码及对应的荧光信号强弱，得出检测结果流式荧光杂交法操作流程流式荧光杂交法操作流程PCR 扩增
6、DNA提取向微孔杂交板中加入微球杂交液，加入PCR产物PCR产物变性杂交，48，30 min加入荧光素SA-PE(链霉亲和素标记的藻红蛋白)，15 minLuminex 流式分析仪检测Luminex 100TM多功能流式点阵仪流式荧光杂交法流式荧光杂交法-HPV 不定量不定量流式荧光杂交法技术总结流式荧光杂交法技术总结原理：普通PCR技术，核酸分子杂交技术和荧光标记技术尚不成熟，灵敏度和特异性有待提高只分型，不定量需价格昂贵的流式荧光检测仪项目亚能亚能透景透景技术原理技术原理基因芯片法流式荧光杂交法操作步骤操作步骤DNA提取PCR杂交化学显色判读结果 DNA提取-PCR杂交荧光标记激光判读 检
7、测通量检测通量检测23种HPV基因型（18种高危型和5种低危型)检测26种HPV基因型（19种高危型和7种低危型，注册证只批检19高危）基本设备基本设备离心机、PCR仪、普通杂交仪离心机、PCR仪、LuminexLuminex多功能流式点阵多功能流式点阵分析仪分析仪标本类型标本类型宫颈脱落细胞、疣体组织、石蜡切片、液基细胞学标本宫颈脱落细胞灵敏度灵敏度高较低特异性特异性高较低理论耗时理论耗时6小时5小时标本保存时标本保存时间间室温下放置时间长（12小时）室温下放置时间短（1小时）PCR反应液反应液已配制并预分装分成引物混合液，PCR预混液，聚合酶三部分，需人工配制亚能与流式荧光杂交法对比亚能与
8、流式荧光杂交法对比亚能产品与上海透景产品的比较优势亚能产品与上海透景产品的比较优势n 灵敏度，特异度更高n 通用仪器设备n 可检测更多来源的标本n 标本保存时间更长n PCR 反应液预分装亚能生物亚能生物港龙港龙技术原理技术原理基因芯片技术基因芯片技术检 测检 测 HPV型型别别18种高危，5种低危16种高危，10种低危主要仪器设备主要仪器设备离心机、普通PCR仪、普通杂交仪离心机、普通PCR仪、HPV分型基因芯片检测阅读系统标本类型标本类型宫颈脱落细胞、液基细胞学标本、疣体组织、石蜡切片标本宫颈脱落细胞灵敏度灵敏度高（1103拷贝/毫升）低（1105拷贝/毫升）PCR 扩增扩增PCR反应液已
9、分装，减少操作人员工作量，避免污染PCR反应液未分装，增加操作人员工作量，带来污染风险杂交方式杂交方式单管密封杂交，避免污染在96微孔板中杂交，敞开环境，易污染。结果判读结果判读可直接用肉眼判读结果，无需专用设备必须用配套的基因芯片检测阅读系统来判读结果亚能生物与港龙亚能生物与港龙HPV 基因分型对比基因分型对比HPV 检测检测HPV DNA 检测检测HPV E6，E7 mRNA 检测检测分型分型不分型不分型部分分型部分分型方法方法代表厂家代表厂家PCR-反向点杂交法亚能、凯普、达安、港龙、珠海赛乐奇流式荧光杂交法上海透景杂交捕获（HC2）QIAGEN(凯杰)PCR-荧光探针法港龙、凯普、达安
10、、科华PCR-荧光探针法罗氏bDNA 技术科蒂亚酶切信号放大法（Cervista）HOLOGIC(英硕力)不分型杂交捕获二代（杂交捕获二代（Hybrid Capture 2,HC2）nHC2基本原理：利用对抗体捕获信号的放大和化学发光信号的检测n13种高危HPV基因型,不能提示具体的基因型计算机判读15 min杂交60 min抗体捕获60 min第二抗体结合，化学发光30 minDNA变性45 minHC2 实验步骤图示实验步骤图示吸取变性剂于对照和样本管中旋涡振荡10秒65孵育45分钟，采用Microplate heater I HC2操作步骤操作步骤-DNA 变性变性将已变性的样本混匀，吸
11、取75 ul 于“杂交微孔板”中20-25孵育10分钟加入25 ul 高危HPV探针于微孔板中65孵育60分钟置于Rotary Shaker I中，1100 rpm，32分钟准备HPV 探针混合物HC2操作步骤操作步骤-杂交杂交将杂交产物转移至“捕获微孔板”相应的小孔中20-25孵育30-45分钟20-25孵育60分钟，1100 rpm加入75 ul Detection Reagent 1（碱性磷酸酶偶联的抗体）于“捕获”微孔板相应的小孔中HC2操作步骤操作步骤-抗体捕获及酶标抗体捕获及酶标洗涤微孔板：采用Automated Plate Washer I或进行手动洗板，重复洗6次加入75 ul
12、 Detection Reagent 2（化学显色底物）于“捕获”微孔板相应的小孔中20-25孵育15-30分钟采用Digene microplate luminometer(DML2000)读数HC2操作步骤操作步骤-洗板及化学显色洗板及化学显色HC2如何进行结果判读如何进行结果判读?l 1.阴性对照阴性对照 每次实验必须同时做3份阴性对照份阴性对照。阴性对照的结果必须为10-250 RLU（相对光单位）。变异系数（变异系数（%CV）应该25%，如果25%，那么去掉偏离平均值最远的一个阴性对照，用剩下的两个阴性对照计算平均值以及变异系数。%CV必须25%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无
13、法给病人出报告l 2.标准品标准品 每次实验必须同时做3份高危份高危HPV标准品标准品。%CV应该15%，如果15%，那么去掉偏离平均值最远的一个标准品，用剩下的两个标准品计算平均值以及变异系数。%CV必须15%，否则，本次实验结果无效，必须重做，无法给病人出报告l 3.用标准品平均值（MHRC）以及阴性对照平均值MNC计算MHRC/MNC比值比值.2.0MHRC/MNC 15。如果2.0 或15，本次实验结果无效，必须重做。l 4.如果符合以上的标准，检测结果是可靠的。此时的Cutoff值值（阳性标本评判的标准）就是MHRC阴性对照阴性对照（NC）高危高危HPV标标准品准品(HRC)9731
14、210133591307平均值平均值96318%CV4.94.7HRC/NC3.31Cutoff 值=318，所有标本的相对光单位（RLU）应该转换为与Cutoff值的比值，比值大于1为阳性，比值小于1则为阴性结果的判定结果的判定质控质控对照对照HPV 基因型基因型预期的结果（预期的结果（RLU/Cutoff值）值）最小值最小值最大值最大值QC1-LRHPV 60.0010.999QC2-HRHPV 16283份阴性对照，3份高危HPV标准品，2份质控，共需额外消耗8人份试剂！HC2-定性检测定性检测以上为以上为FDA 批准的说明书中内容截图批准的说明书中内容截图HC2技术总结技术总结n 原理
15、：采用核酸分子杂交，抗体捕获（吸附杂交体），化学显色n 不分型n 不能检测HPV多重感染n 不定量n 有交叉杂交反应n 手动操作很多，步骤繁琐n 每次实验要额外消耗8人份试剂，试剂成本高n 需基因杂交信号放大系统，设备成本高项目项目基因芯片（亚能）基因芯片（亚能）HC2技术原理技术原理PCR+反向点杂交+化学显色分子杂交抗体捕获+化学显色是否分型是否分型分型，确定具体的基因型不能分型，仅提示是否有HPV感染检测检测HPV种类种类检测23种HPV基因型，18种高危，5种低危检测13种高危型标本类型标本类型宫颈脱落细胞、疣体组织、病理石蜡切片，液基细胞学标本宫颈脱落细胞，液基细胞学标本灵敏度灵敏度
16、高（1000 copies/mL）低（100000 copies/mL）交叉杂交交叉杂交无有基基 本本 设设 备备离心机、普通PCR仪、普通杂交仪（价格低廉）基因杂交信号放大系统（价格昂贵）检测成本检测成本可单人份使用，一次可检测标本量96个或更多每次实验需额外消耗8人份试剂，试剂成本高亚能亚能HPV产品与产品与HC2的比较优势的比较优势n 能分型n 检测23种HPV 基因型n 可检测更多来源的标本n 无交叉杂交反应，特异性高n 通用仪器设备，如PCR仪和杂交仪n 检测成本低 careHPV Test定性检测14种高危型 HPV 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58
17、,59,66,68产品名称产品名称：高危型人乳头瘤病毒（HPV）核酸检测试剂盒方法方法：杂交捕获-化学发光法商品名商品名：careHPV Test该检测技术专为缺少水、电或现代化实验室等基础设施落后的临床环境设计，便于携带、易于使用，当日可出检查结果careHPV识别宫颈癌与高度病变的敏感度和特异度，都大大优于醋酸染色后观察法HPV 检测检测HPV DNA 检测检测HPV E6，E7 mRNA 检测检测分型分型不分型不分型部分分型部分分型方法方法代表厂家代表厂家PCR-反向点杂交法亚能、凯普、达安、港龙、珠海赛乐奇流式荧光杂交法上海透景杂交捕获（HC2）QIAGEN(凯杰)PCR-荧光探针法港
18、龙、凯普、达安、科华PCR-荧光探针法罗氏bDNA 技术科蒂亚酶切信号放大法（Cervista）HOLOGIC(英硕力)不分型PCR-荧光探针法荧光探针法化 学 原 理n 原理：在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,实时监控整个PCR过程。n 基于Taqman探针PCR-荧光探针法总结荧光探针法总结灵敏度高不分型，或部分分型不能检测HPV多重感染检测HPV 种类有限，目前最多检测14种高危型自动化程度高需价格昂贵的荧光定量PCR仪 项项 目目亚能生物基因分型亚能生物基因分型PCR-荧光探针法荧光探针法技术原理技术原理PCR+反向点杂交+化学显色PCR+荧光标记+发光、读数理理 论
19、论 耗耗 时时6小时3小时标本类型标本类型宫颈脱落细胞、疣体组织、病理石蜡切片，液基细胞学标本宫颈脱落细胞，液基细胞学标本基基 本本 设设 备备普通PCR仪、普通杂交仪（价格低廉）荧光定量PCR仪（价格昂贵）检测通量检测通量23型2/8/10/13型等是否分型是否分型分型，确定具体的基因型不分型，仅提示是否有HPV感染多重感染多重感染能检测多重感染检测不能检测多重感染检测亚能与亚能与PCR-荧光探针法对比荧光探针法对比亚能产品与亚能产品与PCR-荧光探针法的比较优势荧光探针法的比较优势n 能分型n 检测23种HPV 基因型n 能检测HPV多重感染n 可检测更多来源的标本n 使用普通PCR仪n
20、特异性更高亚能生物亚能生物HPV基因分型与罗氏对比基因分型与罗氏对比亚能生物亚能生物罗氏罗氏原理原理PCR-反向点杂交法PCR-荧光探针法仪器设备仪器设备离心机、PCR仪、杂交仪。价格低廉，适合各级实验室使用Combas 4800。价格昂贵检测检测HPV型别型别数量数量23种14种能否分型能否分型能仅能区分HPV 16,18型标本类型标本类型宫颈脱落细胞、疣体组织、石蜡切片宫颈脱落细胞HPV 检测检测HPV DNA 检测检测HPV E6，E7 mRNA 检测检测分型分型不分型不分型部分分型部分分型方法方法代表厂家代表厂家PCR-反向点杂交法亚能、凯普、达安、港龙、珠海赛乐奇流式荧光杂交法上海透
21、景杂交捕获（HC2）QIAGEN(凯杰)PCR-荧光探针法港龙、凯普、达安、科华PCR-荧光探针法罗氏bDNA 技术科蒂亚酶切信号放大法（Cervista）HOLOGIC(英硕力)不分型酶切信号放大法酶切信号放大法n代表厂家：美国Hologic，中国子公司-英硕力n产品名称（中文）：高危型人乳头瘤状病毒DNA 检测试剂盒（酶切信号放大法）n产品名称（英文）：Cervista HPV HR亚能生物亚能生物 HPV 基因分型基因分型英硕力英硕力 Cervista 技术原理技术原理PCR-反向点杂交法酶切信号放大法检测检测HPV种类种类18种高危（HPV16，18，31，33，35，39，45，51
22、，52，53，56，58，59，66，68，73，82，83），5种低危（HPV6，11，42，43，81）14种高危型（HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66,68）能否分型能否分型能精确分型不能分型每批实验标每批实验标本数量本数量1-96个，每个样本检测只需1管1-28个，每个样本检测需分3管操作标本类型标本类型宫颈脱落细胞、疣体组织、石蜡切片标本宫颈脱落细胞DNA 提取时提取时间间30分钟/28个标本，操作简便120分钟/28个标本，操作繁琐交叉反应交叉反应无对HPV 67、HPV 70有交叉反应亚能生物与亚能生物与Cervista 的比较优势的比较优势n能对HPV进行精确分型n检测HPV 种类多：能检测23种HPVn兼容标本类型多n单次检测标本量多：最多可做96个标本n无交叉反应n标本处理简便快速
