1、 第第2929讲讲 基因工程基因工程 1 必备知识2 关键能力3 真题回访 必备知识必备知识考点一 基因工程的基本工具1.1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(限制酶限制酶)(1)来源:主要从原核生物中分离纯化而来。(2)作用:识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列并切开每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。(3)结果:产生黏性末端或平末端。如下图所示,EcoR 限制酶识别的碱基序列是GAATTC,切割位点在G和A之间;Sma限制酶识别的碱基序列是CCCGGG,切割位点在G和C之间;说明限制酶具有专一性。必备知识必备知识 必备知识必备知识2.DNA2.DNA连接酶连接酶(1)作用:将
2、限制酶切割下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。(2)类型常用类型Ecoli DNA连接酶T4 DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能只“缝合”黏性末端“缝合”黏性末端和平末端结果恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 必备知识必备知识 必备知识必备知识 1.滴加生理盐水不仅可以维持红细胞原有的形态,还可以稀释血液,使红细胞分散,不易凝集成块,有利于后续加入蒸馏水吸水涨破。2.使用哺乳动物成熟的红细胞是因为其没有细胞核和众多的细胞器,能够获取纯净的细胞膜。限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶等相关酶的分析比较名称作用部位作用底物形成产物限制酶磷酸二酯键DNA分子带黏性末端或平末端的DNA片
3、段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段重组DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸子代DNA分子热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸子代DNA分子DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA分子游离的脱氧核苷酸解旋酶碱基对间的氢键DNA分子脱氧核苷酸单链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸单链RNA分子 必备知识必备知识萤火虫发光是萤火虫体内荧光素酶催化一系列反应所产生的现象。如果荧光素酶存在于植物体内,也可使植物体发光。一直以来荧光素酶的唯一来源是从萤火虫腹部提取。但加利福尼亚大学的一组科学家成功地通过基因工程实现了将荧光素酶基因导入大肠杆菌体内,并使其在大肠杆菌体内表达产生荧光素酶。请你根据已有的知识回答
4、下列有关问题:(1)在此基因工程中,目的基因是,具体操作过程中如图所示的黏性末端是由种限制性核酸内切酶作用产生的。答案答案荧光素酶基因2思维诊断思维诊断 必备知识必备知识(2)将此目的基因导入大肠杆菌体内需要载体的帮助,则作为载体必须具备能够在宿主细胞内复制并稳定保存,以及_(至少答出两点)等条件。(3)在此基因工程中,将体外重组DNA导入大肠杆菌体内,并使其在细胞内_ 的过程称为转化。最常用的转化方法是首先用Ca2+处理大肠杆菌,目的是 。(4)目的基因在受体细胞中是否能转录出mRNA,可用技术来检测;目的基因是否表达出相应的蛋白质,除了通过观察大肠杆菌是否发光来确定外,还可以通过特异性反应
5、来判断。具有特定的限制酶切割位点、具有某些标记维持稳定和表达基因使大肠杆菌细胞处于能够吸收周围DNA分子的状态(或使大肠杆菌处于感受态细胞状态)分子杂交抗原抗体答案答案 必备知识必备知识易错易混易错易混1.一般来说,天然载体往往不能满足人类的所有要求,因此人们根据不同的目的和需要,对某些天然载体进行人工改造。2.限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外,这样才能保证标记基因的完整性,有利于对目的基因的表达。必备知识必备知识考点二 基因工程操作步骤 必备知识必备知识2.基因表达载体的构建基因表达载体的构建基因工程的核心基因工程的核心(1)目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗
6、传给下一代,同时,使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体的组成 必备知识必备知识(3)构建过程 必备知识必备知识(3)构建过程 生物种类植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法农杆菌转化法 显微注射法 Ca2+转化法受体细胞体细胞或受精卵 受精卵原核细胞、真核细胞等单细胞生物转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上导入农杆菌用农杆菌侵染植物细胞整合到受体细胞的染色体DNA上表达将含有目的基因的表达载体提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物Ca2+处理细胞感受态细胞重组表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子 必备知识必备知识4.4.目的基因的检测与鉴定目的基
7、因的检测与鉴定 必备知识必备知识基因工程操作过程中的5个易错点1.目的基因的插入位点不是随意的:基因表达需要启动子与终止子的调控,所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。2.基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象:如第一步人工合成DNA,第二步黏性末端之间连接成重组DNA分子,第四步DNA分子杂交或mRNA分子杂交检测目的基因。四步中都存在碱基互补配对现象。必备知识必备知识3.农杆菌转化法原理:农杆菌易感染植物细胞(双子叶植物和裸子植物),其Ti质粒上的T-DNA可转移并整合到受体细胞染色体的DNA上。4.标记基因的种类和作用:常见的标记基因有抗生素抗
8、性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。标记基因的作用是筛选、检测目的基因是否导入受体细胞。必备知识必备知识5.受体细胞的选择:受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素(需内质网、高尔基体的加工、分泌)则必须用真核生物,如酵母菌。一般不用支原体,原因是它营寄生生活;一定不能用哺乳动物成熟的红细胞,原因是它无细胞核,也没有核糖体等细胞器,不能合成蛋白质。必备知识必备知识(2019重庆模拟)“杂交水稻之父”袁隆平带领的海水稻团队于2019年5月在迪拜热带沙漠种植的海水稻测产成功,最高亩产超过50
9、0公斤。引起全世界广泛关注。回答下列问题:(1)若培育转基因海水稻,可将耐盐基因导入高产水稻细胞内培育。要大量获得耐盐基因可采用技术。构建的中通常含有标记基因,标记基因的作用是 。答案答案PCR思维诊断思维诊断基因表达载体鉴定并筛选出含目的基因的受体细胞 必备知识必备知识(2)将耐盐基因导入水稻细胞常用的方法是;检测耐盐基因是否在水稻细胞中转录成功,通常采用 技术检测。(3)目前,以袁隆平院士为首的科研团队利用杂种优势提高产量。基因工程技术相对于杂交育种的突出优点是。通过转基因技术,耐盐基因能在水稻细胞或其他细胞中成功表达的原因是。答案答案基因枪法mRNA杂交克服远缘杂交不亲和障碍,定向改变生
10、物性状密码子具有通用性或不同生物共用一套密码子 必备知识必备知识考点三 基因工程的应用与蛋白质工程1.1.基因工程的应用基因工程的应用(1)植物基因工程:培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄);利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。(2)动物基因工程:用于提高动物生长速率从而提高产品产量;用于改善畜产品的品质;用转基因动物生产药物;用转基因动物作器官移植的供体等。必备知识必备知识 原理操作过程进展基因治疗基因表达将正常基因导入有基因缺陷的细胞中,以表达出正常性状来治疗疾病临床实验基因诊断碱基互补配对制作特定的 DNA探针与病人样品DN
11、A混合,分析杂交带情况临床应用(3)比较基因治疗与基因诊断 必备知识必备知识2.蛋白质工程蛋白质工程(1)概念理解a.基础:蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。b.操作:基因修饰或基因合成。c.结果:改造了现有蛋白质或制造出 新的蛋白质。d.目的:根据人们对蛋白质功能的特定需求,对 蛋白质结构进行分子设计。必备知识必备知识(2)操作过程从预期的蛋白质 功能出发设计预期的 蛋白质结构推测应有的 氨基酸序列找到相对应的 脱氧核苷酸序列(基因)基因表达产生需要的蛋白质。其流程图如下:必备知识必备知识1.用基因工程的方法,使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系一般称为“工程菌”,而青霉素是诱变后的
12、高产青霉菌产生的,不是经过基因工程改造的工程菌产生的。2.用基因工程生产的药品,从化学成分上分析都应该是蛋白质类。3.动物基因工程的实施主要是为了改善畜产品的品质,不是为了产生体型巨大的个体。4.并非所有个体都可作为乳腺生物反应器,制备乳腺生物反应器通常是培育出雌性个体。必备知识必备知识干扰素是动物体内合成的一种蛋白质,可以用于治疗病毒感染和癌症,但体外保存相当困难。如果将干扰素分子中的一个半胱氨酸变成丝氨酸,干扰素就可以在-70 条件下保存半年,给广大患者带来福音。(1)蛋白质的合成是受基因控制的,因此获得能够控制合成“可以保存的干扰素”的基因是生产的关键,依据蛋白质工程原理,设计实验流程,
13、让动物生产“可以保存的干扰素”:答案答案应有的氨基酸序列思维诊断思维诊断相对应的脱氧核苷酸序列(基因)预期的蛋白质结构预期的蛋白质功能 必备知识必备知识(2)基因工程和蛋白质工程相比较,基因工程在原则上只能生产的蛋白质,不一定符合 的需要。而蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础,通过 或,对现有蛋白质进行,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活需要。(3)蛋白质工程实施的难度很大,原因是蛋白质具有十分复杂的 结构。(4)对天然蛋白质进行改造,应该直接对蛋白质分子进行操作,还是通过对基因的操作来实现?说明原因。答案答案自然界已存在人类生产和生活基因修饰基因合成改造空
14、间(4)应该通过对基因的操作来实现对天然蛋白质的改造。原因是:首先,任何一种天然蛋白质都是由基因编码的,改造了基因也就是改造了蛋白质,并且改造过的蛋白质可以通过改造过的基因遗传给下一代。如果对蛋白质直接改造,即使改造成功,被改造过的蛋白质分子还是无法遗传;其次,对基因进行改造比对蛋白质直接进行改造要容易操作,难度要小得多 关键能力关键能力题型一 限制酶的选择【典例】下图为培育转基因抗虫棉的两种思路,请据图回答问题:关键能力关键能力(1)与思路2相比,思路1的优点是筛选出的目的植株 。(2)构建重组质粒时,需要使用的限制酶是 ,还需要使用的工具酶是。(3)图中过程获取的完整的重组质粒,除了图中标
15、出的特殊DNA片段外,还应该有 等部分;过程常用的方法是 ;过程常用的试剂为 ;培育获取棉株2 或棉株4采用的生物学技术是。(4)为检测棉株3、棉株4的抗虫特性,常使用的方法是 。能稳定遗传(是纯合子)EcoR 和BamHDNA连接酶标记基因(和复制原点)农杆菌转化法秋水仙素植物组织培养接种害虫,观察棉株是否有抗虫能力答案答案解析解析 关键能力关键能力【解析】(1)思路1是采用单倍体育种方法,结合基因工程,培育出目的植株,与思路2相比,该方法的优点是目的植株是纯合子,能稳定遗传。(2)据图分析,如果用Sma酶切割目的基因,会破坏目的基因,因此用图中的质粒和目的基因构建重组DNA分子时,不能使用
16、Sma酶切割,只能选用EcoR和BamH切割目的基因和运载体,还需要使用的工具酶是DNA连接酶。(3)过程是构建基因表达载体,即重组质粒。基因表达载体中除了具有目的基因、启动子和终止子之外,还需具有标记基因和复制原点等;过程是将目的基因导入受体细胞,受体细胞是植物细胞,常用的方法是农杆菌转化法;棉株2是单倍体幼苗的外植体经过植物组织培养技术获得的,是单倍体;过程常用的试剂为秋水仙素,使植株2细胞中染色体数目加倍,获得纯合体植株3。(4)检测棉株3、棉株4的抗虫特性,常使用的方法是接种害虫,观察棉株是否有抗虫能力。关键能力关键能力限制酶的选择原则 关键能力关键能力1.根据目的基因两端的限制酶切点
17、确定限制酶的种类(1)应选择切点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择Pst,不能选择Sma。(2)为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶切割目的基因。关键能力关键能力2.根据质粒的特点确定限制酶的种类(1)所选限制酶要与切割目的基因的限制酶具有相同的黏性末端。(2)质粒作为载体必须具备标记基因、复制原点等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,应至少含有一个完好的标记基因,如图乙中限制酶pst因其会破坏标记基因而不宜选择。(3)所选限制酶,其切点应位于启动子与终止子之间,如图乙中Hind会破坏启动子,Ec
18、oR会破坏终止子,而Nde、Xba及BamH切出的切口可让目的基因嵌入启动子与终止子之间;若质粒上标出了T-DNA片段,则所选限制酶切点应位于T-DNA片段中。关键能力关键能力下图1为用Pvu限制酶切下的某目的基因及其上DNA片段示意图;图2为三种质粒示意图。图2中AP为氨苄青霉素抗性基因,Tc为四环素抗性基因,图中还显示了EcoR、Pvu等限制酶及其切割的位点与复制原点的距离。复制原点是在基因组上复制起始的一段序列,是指质粒在受体细胞中复制时的起点。对点练 关键能力关键能力(1)组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架相同的元素是 。(2)图2中质粒A、质粒C能否作为理想的目的基因运载体?(填
19、“能”或“否”),请说明理由_。(3)重组质粒成功导入受体细胞的概率一般仅为10-7,用质粒B构建重组质粒,为了筛选出导入了重组质粒的大肠杆菌,在导入完成后,将所有大肠杆菌分别放在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养,大肠杆菌在两种培养基上的生长状况不可能的是 ,可能性最大的是 。(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物,则需要将重组质粒导入山羊的(填细胞)中。C、H、O、P否质粒A缺少标记基因;质粒C用切割目的基因的限制酶切割时,复制原点会被限制酶切割,会影响重组质粒的自主复制在含四环素的培养基上能正常生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养
20、基上都不能正常生长受精卵答案答案解析解析 关键能力关键能力【解析】(1)脱氧核糖和磷酸交替连接构成DNA片段D的基本骨架,脱氧核糖由C、H、O三种元素组成,组成磷酸的元素是H、P、O;磷脂双分子层构成细胞膜的基本骨架,磷脂分子是由C、H、O、N、P组成的;可见,组成片段D的基本骨架与细胞膜的基本骨架相同的元素是C、H、O、P。(2)分析图2可知:质粒A缺少标记基因,质粒C用切割目的基因的限制酶切割时,复制原点会被限制酶切割,进而影响重组质粒的自主复制,所以质粒A、质粒C均不能作为理想的目的基因运载体。(3)用质粒B构建重组质粒,当用切割目的基因的限制酶(Pvu)切割时,Tc(四环素抗性基因)遭
21、到破坏,而AP(氨苄青霉素抗性基因)结构完好,因此在重组质粒导入完成后,将所有大肠杆菌分别放在含有四环素和氨苄青霉素的培养基中培养,大肠杆菌在两种培养基上的生长状况不可能的是在含四环素的培养基上能正常生长,在含氨苄青霉素的培养基上不能正常生长。因重组质粒成功导入受体细胞的概率一般仅为10-7,所以生长状况可能性最大的是在含氨苄青霉素的培养基和含四环素的培养基上都不能正常生长。(4)若想在山羊的乳汁中收获上述目的基因的表达产物,则需要将重组质粒导入山羊的受精卵中。关键能力关键能力题型二题型二 基因工程与蛋白质工程实例应用基因工程与蛋白质工程实例应用【典例】(2019兰州期中)科研人员从一些荒漠植
22、物中成功克隆抗旱功能基因,培育出抗旱、耐盐碱和耐贫瘠能力的转基因紫花苜蓿新品系。它的研究成功,对改良与利用大面积盐荒地,改善生态环境,促进农牧业可持续发展具有现实意义。结合所学知识回答下列问题:(1)克隆抗旱功能基因是应用技术,其原理为。(2)获取目的基因的常用方法有从中得到,也可人工合成。PCRDNA双链复制基因文库答案答案 关键能力关键能力(3)构建好的基因表达载体需含有目的基因、终止子、和标记基因共五部分。(4)紫花苜蓿为双子叶植物,常用的导入目的基因的方法是。(5)若进行个体水平的检测,需将该植株栽培于 环境中,以观察其生长状况。(6)某些地区在规划中违背了生态工程的 原理,造成了“前
23、面造林,后面砍林”的现象;我国西北土地沙化和盐渍化非常严重,主要原因是超载放牧,导致草地退化,当地的生产活动违背了生态工程的原理。答案答案解析解析启动子复制原点农杆菌转化法干旱、盐碱和贫瘠的整体性协调与平衡 关键能力关键能力【解析】(1)题目中“克隆”的是基因,可采用PCR技术,原理是DNA双链复制。(2)获取目的基因的常用方法是从基因文库中获得,也可以人工合成。(3)基因表达载体的组成包括目的基因、终止子、启动子、标记基因和复制原点共五部分。(4)将目的基因导入双子叶植物常用的方法是农杆菌转化法。(5)从个体水平上的检测,要筛选出抗旱、耐盐碱和耐贫瘠能力的植株,需将该植株栽培于干旱、盐碱和贫
24、瘠的环境中,以观察其生长状况。(6)“前面造林,后面砍林”的现象违背了生态工程中的整体性原理;我国西北土地沙化和盐渍化非常严重,原因有多种,其中一个主要原因是超载放牧导致草地退化,该事实主要违背了生态工程的协调与平衡原理。关键能力关键能力下图是科学家利用大肠杆菌生产人胰岛素的部分过程。请结合相关知识回答问题:对点练 关键能力关键能力(1)除图示方法获得目的基因(人胰岛素基因)外,还可通过的方法获得目的基因。(2)图中所获得的人胰岛素基因在大肠杆菌中不能表达,需要质粒为其提供_等调控因子;质粒含有一个或多个 切割位点,供目的基因插入其中;质粒上还含有,供重组DNA的鉴定和选择。(3)图中切割人胰
25、岛素基因和质粒的酶(酶A)相同,其目的是 。将重组DNA分子导入大肠杆菌前,常需用处理大肠杆菌,使其成为感受态细胞。(4)由于大肠杆菌中没有 等结构,其内合成的人胰岛素没有活性,需要经过再加工。人工合成内质网、高尔基体子、终止子启动限制酶标记基因获得相同的黏性末端或平末端Ca2+答案答案解析解析 关键能力关键能力【解析】(1)获取目的基因的方法除题图所示方法外,还有人工合成法。(2)图中所获得的人胰岛素基因由于不含启动子和终止子,因此需要运载体质粒提供。质粒上还应含有一个或多个限制酶切割位点,供目的基因插入其中;质粒上还含有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。(3)用同一种限制酶切割目的基因和
26、质粒,以便获得相同的末端。将重组DNA分子导入大肠杆菌前,需用Ca2+处理大肠杆菌,使其成为感受态细胞。(4)由于大肠杆菌中没有内质网、高尔基体等结构,其内合成的人胰岛素没有活性,需要经过再加工。关键能力关键能力题型三 PCR技术的应用【典例】PCR技术是分子生物学实验室里的一种常规技术手段,其原理是利用DNA的半保留复制,在试管中进行DNA的人工复制(如图所示),在很短的时间内,将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍,使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。回答下列问题:关键能力关键能力(1)PCR的全称是 ,94 高温使DNA双链打开,这一步是打开 键,称为。而这一过程在细胞内是通过酶实现
27、的。(2)当温度降低时,引物与模板端结合,在 的作用下,引物沿模板延伸,此过程中原料是 ,其还可以提供。(3)PCR技术的必要条件除模板、原料、ATP、酶以外,至少还需要三个条件,即液体环境、适宜的和,前者由PCR仪自动调控,后者则靠来维持。(4)DNA的复制需要引物,其主要原因是_。引物的实质是 ,若将1个DNA分子拷贝10次,则需要在缓冲溶液中至少加入个引物。多聚酶链式反应氢变性解旋3热稳定DNA聚合酶dATP、dTTP、dCTP、dGTP能量温度pH缓冲液DNA的复制不能从头开始,DNA聚合酶只能从引物的3端延伸DNA链单链RNA或者单链DNA分子211-2答案答案解析解析 关键能力关键
28、能力【解析】打开DNA双链需破坏碱基对间的氢键;引物的游离端为5端,即DNA合成时从新链的53端延伸,故引物需与模板的3端结合;PCR所用液体环境需保障适宜的温度和pH,其pH可借助缓冲液维持;DNA复制不能从头开始,故必须提供引物。在DNA分子扩增时,需要2种引物,由于新合成的链都需要引物作为复制的起点,故所需的引物数目等于新合成的DNA链的数目,即2210-2=211-2。关键能力关键能力1.生物体内DNA复制与PCR的区别体内DNA复制PCR解旋在解旋酶的作用下,细胞提供能量,双链部分解开加热至90 以上,双链全部解开,不需要解旋酶引物一小段RNA可以是RNA或单链DNA分子片段合成子链
29、在引物的基础上,一条链连续合成,另一条链不连续合成分别从两条链的引物端开始,都是连续合成,控制温度72 左右特点边解旋边复制,半保留复制体外迅速扩增DNA聚合酶不需要需要循环次数受生物体自身控制30多次相同点生物体内的DNA复制和PCR体外扩增DNA都需要模板、四种游离的脱氧核苷酸,且都需要在一定的缓冲溶液中进行 关键能力关键能力2.PCR中需要两种引物(分别与DNA的两条链结合),每合成一个子链就需要一个引物,若一个DNA分子扩增N次则需要引物2N2-2个。关键能力关键能力下图1表示含目的基因的DNA片段,图2表示质粒(已知Pst、EcoR和Hind三种限制酶切割后产生的黏性末端都不相同)。
30、请回答下列问题:对点练(1)已知DNA合成时总是从子链的5端向3端延伸。利用PCR技术以图1中的DNA片段为模板扩增目的基因,需要的引物有(从A、B、C、D四种单链DNA片段中选择)。上述过程中,经过次循环后会产生双链等长的目的基因片段。B、C3答案答案 关键能力关键能力(2)要保证目的基因能与图2中的质粒连接,要将(2)中选出的两种引物的5端分别添加上 两种限制酶的识别序列。在此基础上,对扩增的目的基因和质粒都用这两种限制酶处理,待基因表达载体构建完成后,加入含大肠杆菌的转化液中。请简述从中分离出含该重组质粒的大肠杆菌单菌落的操作思路:(3)从DNA分子结构分析,上述操作用到的工具酶作用的共
31、同点是_ 。Pst、EcoR将转化液接种在加入四环素的固体培养基上,在适宜条件下培养一段时间,待长出菌落后,用无菌纸将菌落中的菌按标记好的方位印在含有青霉素的培养基中进行培养,最后筛选出在四环素中能长出菌落而印到青霉素的培养基上却不能长出菌落对应部位的菌。于磷酸二酯键,但不作用氢键都作用答案答案解析解析 关键能力关键能力【解析】(1)已知DNA合成时方向总是从子链的5端向3端延伸,组成DNA分子的两条链是反向平行的。因此,利用PCR技术以图1中的DNA片段为模板扩增目的基因,需要的引物有B、C;DNA复制具有半保留复制的特点,由此可推知在利用PCR技术扩增目的基因时,经过3次循环后会产生双链等
32、长的目的基因片段。(2)图2中的质粒上有三种限制酶切点,其中Pst、EcoR切割抗青霉素基因,Hind切割抗四环素基因。为了保证重组质粒至少有一个标记基因,在两种引物的5端分别添加上Pst、EcoR这两种限制酶的识别序列。重组质粒中含有抗四环素基因而不含抗青霉素基因,所以选择在含有四环素的培养基上能生长而在含有青霉素的培养基上不能生长的大肠杆菌。(3)基因工程中用到的是限制酶和DNA连接酶,这两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键。真题回访真题回访基础题 自查基础1.(2019全国卷)基因工程中可以通过PCR技术扩增目的基因。回答下列问题。(1)基因工程中所用的目的基因可以人工合成,也可以从基因文库
33、中获得。基因文库包括和。(2)生物体细胞内的DNA复制开始时,解开DNA双链的酶是 ,在体外利用PCR技术扩增目的基因时,使反应体系中的模板DNA解链为单链的条件是 ,上述两个解链过程的共同点是破坏了DNA双链分子中的。(3)目前在PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。答案答案基因组文库解析解析cDNA文库解旋酶Taq 酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下失活A加热至9095 氢键 真题回访真题回访【解析】本题考查基因工程的相关知识,考查考生的理解能力。(1)基因工程中可以提取细胞的全部基因,也可以以细胞中的mRNA为模板逆转录获得,前者含有全部基因,称为
34、基因组文库,后者只含有部分基因,称为cDNA文库。(2)生物体内DNA复制时,首先要解开DNA双链,该过程中所需的酶是解旋酶,PCR技术扩增目的基因时,要高温处理,通过高温加热至9095使模板DNA解链为单链,DNA双链解链为单链的过程中破坏的化学键是氢键。(3)PCR反应中使用Taq酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是PCR过程需要在高温下进行,Taq酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下失活。真题回访真题回访2.(2019天津卷)B基因存在于水稻基因组中,其仅在体细胞(2n)和精子中正常表达,但在卵细胞中不转录。为研究B基因表达对卵细胞的影响,设计了如下实验。据图回答:真题回访
35、真题回访(1)B基因在水稻卵细胞中不转录,推测其可能的原因是卵细胞中。(单选)A.含B基因的染色体缺失B.DNA聚合酶失活C.B基因发生基因突变D.B基因的启动子无法启动转录(2)从水稻体细胞或中提取总RNA,构建文库,进而获得B基因编码蛋白的序列。将该序列与Luc基因(表达的荧光素酶能催化荧光素产生荧光)连接成融合基因(表达的蛋白质能保留两种蛋白质各自的功能),然后构建重组表达载体。答案答案D精子cDNA 真题回访真题回访(3)在过程、转化筛选时,过程中T-DNA整合到受体细胞染色体DNA上,过程在培养基中应加入卡那霉素。(4)获得转基因植株过程中,以下鉴定筛选方式正确的是。(多选)A.将随
36、机断裂的B基因片段制备成探针进行DNA分子杂交B.以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交C.以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞提取的mRNA杂交D.检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光(5)从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到细胞内仅含一个染色体组,判定该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明 。答案答案解析解析BCDB基因表达能使卵细胞不经受精直接发育成胚 真题回访真题回访【解析】(1)通过题干信息可知,在体细胞和精子中存在B基因,说明含B基因的染色体未缺失,也没有发生基因突变,A、C错误;基因表达过程中的转录需要RNA聚合
37、酶,不是DNA聚合酶,B错误;B基因在卵细胞中不能转录,可能是B基因的启动子在卵细胞中不能启动转录,D正确。(2)通过题干信息可知,水稻的体细胞和精子中B基因可表达,故可从水稻的体细胞和精子中提取RNA。通过逆转录产生DNA,从而构建cDNA文库,进而获得B基因编码蛋白的序列。(3)图示过程表示筛选含有目的基因的重组质粒的农杆菌,图示中质粒有抗卡那霉素标记基因和抗潮霉素标记基因,如果选择培养基中加入的是卡那霉素,起作用的是抗卡那霉素标记基因。过程表示将筛选出含有重组质粒的农杆菌的T-DNA整合到水稻细胞染色体DNA上。真题回访真题回访(4)获得转基因植株,鉴定筛选方式有:a.DNA分子杂交技术
38、,即以Luc基因为模板设计探针进行DNA分子杂交,A错误、B正确;b.用标记的目的基因作探针与mRNA杂交,即以B基因编码蛋白的序列为模板设计探针与从卵细胞中提取的mRNA杂交,C正确;c.检测目的基因是否翻译成蛋白质,通过(2)可知B基因与Luc基因连接形成B-Luc融合基因,即可通过检测加入荧光素的卵细胞中是否发出荧光来确定Luc基因是否表达,D正确;故选BCD。(5)当从转基因植株未成熟种子中分离出胚,观察到细胞内仅含有一个染色体组,推断该胚是由未受精的卵细胞发育形成的,而一般情况下水稻卵细胞在未受精时不进行发育,由此表明B基因表达能使卵细胞不经受精作用直接发育成胚。真题回访真题回访3.
39、(2019江苏卷)图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图,载体质粒P0具有四环素抗性基因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。请回答下列问题:图1 真题回访真题回访(1)EcoR V酶切位点为,EcoRV酶切出来的线性载体P1为末端。(2)用Taq DNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段,其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理,在两端各添加了一个碱基为的脱氧核苷酸,形成P2;P2和目的基因片段在 酶作用下,形成重组质粒P3。答案答案平胸腺嘧啶(T)DNA连接 真题回访真题回访答案答案 菌落类型平板类型ABC无抗生素+氨苄青霉素+-四环素+-氨苄青霉素+四环素+-
40、(3)为筛选出含有重组质粒P3的菌落,采用含有不同抗生素的平板进行筛选,得到A、B、C三类菌落,其生长情况如下表(“+”代表生长,“-”代表不生长)。根据表中结果判断,应选择的菌落是(填下表中字母)类,另外两类菌落质粒导入情况分别是、。BA类菌落含有P0C类菌落未转入质粒 真题回访真题回访答案答案解析解析(4)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒,拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置,PCR鉴定时应选择的一对引物是。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段,原因是。图2乙丙目的基因反向连接 真题回访真题回
41、访【解析】(1)根据题意分析,EcoRV酶识别的序列是GATATC,并且两条链都在中间的T与A之间进行切割,因此其切出来的线性载体P1为平末端。(2)依题意并据图分析,目的基因两侧为黏性末端,且露出的碱基为A,则在载体P1的两端需要加一个含有碱基T的脱氧核苷酸,以便形成具有黏性末端的载体P2,再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。(3)根据以上分析可知,限制酶(EcoR V酶)切割后破坏了四环素抗性基因,但是没有破坏氨苄青霉素抗性基因,因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中不能生长,而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长,结合表格分析可知,应该选择B类菌落。根据表格分
42、析,A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长,说明其导入的是P0;C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长,说明其没有导入任何质粒。真题回访真题回访(4)据图分析,根据目的基因插入的位置和PCR技术的原理分析,PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和丙;根据题意和图形分析,某同学用图中的另外一对引物(甲、乙)从某一菌落的质粒中扩增出了400 bp的片段,说明其目的基因发生了反向连接。真题回访真题回访4.(2018全国卷)回答下列问题:(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Cohen)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明
43、了_ (答出两点即可)。(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的方法导入大肠杆菌细胞,而体外重组的噬菌体DNA通常需与 组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是。答案答案重组的质粒可以进入体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达体外转化外壳蛋白(或答噬菌体蛋白)细菌 真题回访真题回访(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加的抑制剂。答案答案解析解析蛋白酶缺陷型蛋白酶 真题回访真题回访
44、【解析】(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达,该过程证明了体外重组的质粒可以进入体细胞,真核生物基因可在原核细胞中表达等。(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与外壳蛋白组装成完整的噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞。噬菌体只能侵染细菌,而不能寄生在其他细胞中,因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解,为防止蛋白质被降解,在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的
45、抑制剂。真题回访真题回访5.(2018全国卷)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5末端,获得了L1-GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。真题回访真题回访回答下列问题:(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是。使用这两种酶进行酶切是为了保证,也是为了保证。(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说
46、明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了和过程。(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生绿色荧光细胞的移入牛的中、体外培养、胚胎移植等。E1和E4甲的完整甲与载体正确连接转录翻译细胞核去核卵母细胞答案答案 真题回访真题回访(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。答案答案解析解析核DNA 真题回访真题回访【解析】(1)要保证目的基因在受体细胞中能够正确表达,目的基因的首端应有启动子,尾端应有终止子。甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的
47、5末端而获得的L1-GFP融合基因,据此结合题意并分析题图可知:该团队在将甲插入质粒P0时,如果用E2或E3,则目的基因不完整,而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切则保证了甲的完整,而且也保证了甲与载体正确连接,因此,使用的两种限制酶是E1和E4。(2)构建的真核表达载体P1中含有GFP基因,而GFP基因的表达产物某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。因此若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达,基因的表达过程包括转录和翻译。(3)若要获得含有甲的牛,可采用核移植技术,即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组
48、细胞,并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎,再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。真题回访真题回访(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写,是一种在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。真题回访真题回访6.(2018天津卷)甲型流感病毒为RNA病毒,易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法,主要环节如下。(1)改造病毒的部分基因,使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板,逆转录成对应DNA后,利用技术扩增,并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)
49、内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比,改造后的基因表达时不能合成完整长度的 ,因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原等其他基因分别构建重组质粒,并保存。答案答案PCR多肽(或蛋白质)真题回访真题回访(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因,其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合,并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的进行分子杂交鉴定,筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞,并在补加
50、的培养基中进行培养,则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA,翻译出改造病毒基因的完整蛋白,产生大量子代病毒,用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时,识别其启动子的酶是(单选)。A.病毒的DNA聚合酶 B.宿主的DNA聚合酶 C.病毒的RNA聚合酶 D.宿主的RNA聚合酶答案答案载体总RNA非天然氨基酸(Uaa)D 真题回访真题回访(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖,没有致病性,因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比,该病毒活疫苗的优势之一是可引起免疫,增强免疫保护效果。细胞答案答案解解析析 真题回访真题回访【解析】(1)PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种
