1、实验九、十实验九、十 微生物的生理生化反应微生物的生理生化反应 糖发酵试验糖发酵试验 吲哚试验吲哚试验 产硫化氢试验产硫化氢试验vp试验试验 甲基红试验甲基红试验 淀粉水解试验淀粉水解试验一、目的要求一、目的要求 1.了解细菌的一般生化反应；了解细菌的一般生化反应；2.了解细菌的生化鉴定方法其原理。了解细菌的生化鉴定方法其原理。二、基本原理二、基本原理 n 由于各种微生物的新陈代谢类型不同，因此，由于各种微生物的新陈代谢类型不同，因此，对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同，我对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同，我们可以用化学反应来测定微生物的代谢产物，这们可以用化学反应来测定微生物的代谢
2、产物，这种反应称为生化反应。生化反应常用来鉴别在形种反应称为生化反应。生化反应常用来鉴别在形态或其它方面不易区别的微生物，例如：肠道细态或其它方面不易区别的微生物，例如：肠道细菌中，大肠杆菌和伤寒杆菌，二者在形态上不易菌中，大肠杆菌和伤寒杆菌，二者在形态上不易区分，但前者能发酵乳糖，后者不能。因此可以区分，但前者能发酵乳糖，后者不能。因此可以从它们能否发酵乳糖来区别它们，所以微生物的从它们能否发酵乳糖来区别它们，所以微生物的生化反应是微生物分类鉴定的重要依据之一。生化反应是微生物分类鉴定的重要依据之一。三、材料三、材料 n菌种：大肠杆菌；枯草杆菌；变形杆菌；菌种：大肠杆菌；枯草杆菌；变形杆菌；
3、自己分离的大肠杆菌自己分离的大肠杆菌。n培养基：糖发酵培养基（葡萄糖）；培养基：糖发酵培养基（葡萄糖）；H2S试验用培养基；蛋白胨水培养基；葡萄糖试验用培养基；蛋白胨水培养基；葡萄糖蛋白胨水培养基；淀粉培养基。蛋白胨水培养基；淀粉培养基。n试剂：吲哚试剂；碘液；甲基红试剂；试剂：吲哚试剂；碘液；甲基红试剂；VP试剂。试剂。1.糖发酵试验糖发酵试验n糖发酵试验是常用的生化反应，在肠道细菌的鉴糖发酵试验是常用的生化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为定上尤为重要，绝大多数细菌都能利用糖类作为能源及碳源，但是细菌的分解糖类的能力上有相能源及碳源，但是细菌的分解糖类的能力上有
4、相当大的差异，某些菌能使某些单糖或双糖分解，当大的差异，某些菌能使某些单糖或双糖分解，并产酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（甲烷、并产酸（乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（甲烷、氢、二氧化碳），或者只产酸而不产生气体。酸氢、二氧化碳），或者只产酸而不产生气体。酸和气体的产生与否，可以由培养后试管指示剂的和气体的产生与否，可以由培养后试管指示剂的颜色变化和小套管内气泡的有无来判定。当发酵颜色变化和小套管内气泡的有无来判定。当发酵产酸时，指示剂溴甲酚紫由紫色（产酸时，指示剂溴甲酚紫由紫色（pH6.8）变）变为黄色（为黄色（pH5.2）。其步骤如下：）。其步骤如下：（1）取盛有葡萄糖发酵培养基的试管四支）取
5、盛有葡萄糖发酵培养基的试管四支（内装有小套管），一支接种大肠杆菌，（内装有小套管），一支接种大肠杆菌，第二支接自己分离的大肠杆菌，第三支接第二支接自己分离的大肠杆菌，第三支接枯草杆菌，第四支不接种，作空白对照。枯草杆菌，第四支不接种，作空白对照。在各试管上标明菌名和组别，置在各试管上标明菌名和组别，置37培养培养24小时。小时。（2）观察结果：经培养后，指示剂呈黄色）观察结果：经培养后，指示剂呈黄色者表示为酸性，同时观察小套管中有无气者表示为酸性，同时观察小套管中有无气泡产生。泡产生。2 2吲哚试验吲哚试验n某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸而生成吲哚。吲哚与对
6、二甲基氨苯甲醛结合，形吲哚。吲哚与对二甲基氨苯甲醛结合，形成玫瑰吲哚，此为红色化合物，其反应变成玫瑰吲哚，此为红色化合物，其反应变化如下：化如下：（1 1）取蛋白胨水培养基试管四支，分别接种大肠）取蛋白胨水培养基试管四支，分别接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，留一支杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，留一支作空白对照，并在试管上注明菌名和组别，置作空白对照，并在试管上注明菌名和组别，置3737培养培养4848小时。小时。（2 2）培养后取出，在培养液中先加入乙醚约）培养后取出，在培养液中先加入乙醚约1 1毫升毫升（使呈明显的乙醚层），充分振荡，使吲哚溶于（使呈明显的乙醚层），充分振荡
7、，使吲哚溶于乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上面，乙醚中，静置片刻，使乙醚层浮于培养基的上面，这时再沿管壁慢慢加入吲哚试剂这时再沿管壁慢慢加入吲哚试剂510510滴，观察有滴，观察有无红色出现。有红色环出现者为阳性，黄色者为无红色出现。有红色环出现者为阳性，黄色者为阴性。阴性。（注意：加入试剂后不可再摇动，否则被混合，红（注意：加入试剂后不可再摇动，否则被混合，红色不明显。）色不明显。）3 3产硫化氢试验产硫化氢试验n某些菌能分解含硫的有机物或无机物产生硫化氢某些菌能分解含硫的有机物或无机物产生硫化氢（H H2 2S S），），H H2 2S S遇金属盐类，如铅盐、铁盐等，则遇金属盐类，
8、如铅盐、铁盐等，则形成黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物。从而可断形成黑色的硫化铅或硫化铁的沉淀物。从而可断定定H H2 2S S的产生与否。其测定方法有两种，一种是的产生与否。其测定方法有两种，一种是用含有柠檬酸铁铵的培养基穿刺培养，看是否有用含有柠檬酸铁铵的培养基穿刺培养，看是否有黑色沉淀（本实验采用）；另一种是在盛有液体黑色沉淀（本实验采用）；另一种是在盛有液体培养基的试管中接种菌以后，在试管的棉塞下吊培养基的试管中接种菌以后，在试管的棉塞下吊一片醋酸铅试纸，经培养后看醋酸铅试纸是否变一片醋酸铅试纸，经培养后看醋酸铅试纸是否变黑。其步骤如下：黑。其步骤如下：（1 1）取）取H H2 2S S试
9、验用培养基四支（内含有柠檬酸试验用培养基四支（内含有柠檬酸铁铵），分别用穿刺法接种大肠杆菌，自铁铵），分别用穿刺法接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌和变形杆菌，留一支空己分离的大肠杆菌和变形杆菌，留一支空白，试管上注明菌名和组别，置白，试管上注明菌名和组别，置3737培养培养2424小时。小时。（2 2）培养后取出观察，看有无黑色沉淀产生。）培养后取出观察，看有无黑色沉淀产生。4 4伏一普（伏一普（Voges-proskauerVoges-proskauer）二氏反应，即二氏反应，即VPVP反应反应n某些菌生长于葡萄糖蛋白胨水培养基中能某些菌生长于葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，而
10、丙酮酸又可缩分解葡萄糖产生丙酮酸，而丙酮酸又可缩合、脱羧而转化成乙酰甲基甲醇，如加入合、脱羧而转化成乙酰甲基甲醇，如加入强碱液，即与空气中的氧起作用产生二乙强碱液，即与空气中的氧起作用产生二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的含胍基成分作用酰，二乙酰与蛋白胨中的含胍基成分作用生成红色化合物，称阳性反应，没有红色生成红色化合物，称阳性反应，没有红色化合物产生则称阴性反应。化合物产生则称阴性反应。（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，分别）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，分别接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯接种大肠杆菌，自己分离的大肠杆菌，枯草杆菌，留一支作空白对照，并在试管上草杆菌，留一支作空白对照，并在试
11、管上注明菌名和组别。置注明菌名和组别。置3737培养培养2424小时。小时。（2 2）培养后取出，按书）培养后取出，按书119119页上的要求加试页上的要求加试剂后，放置剂后，放置3737温室温室3030分钟，呈红色者为分钟，呈红色者为阳性，不呈红色者为阴性。阳性，不呈红色者为阴性。5 5甲基红试验（甲基红试验（MRMR试验）试验）n某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能产某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能产生大量的酸，使生大量的酸，使pHpH降低至降低至4 45 5，它先产生，它先产生丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、丙酮酸，丙酮酸再被分解成甲酸、乙酸、乳酸等。酸的产生可由加入甲基红指示剂乳酸
12、等。酸的产生可由加入甲基红指示剂的变色而指示（有效的变色而指示（有效pHpH范围为范围为4.24.26.36.3）。）。细菌分解葡萄糖产酸，则培养液由原来的细菌分解葡萄糖产酸，则培养液由原来的桔黄色，变为红色，即为甲基红反应。桔黄色，变为红色，即为甲基红反应。（1 1）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，）取葡萄糖蛋白胨水培养基四支，一支一支接种大肠杆菌，第二支接自己分离的大肠接种大肠杆菌，第二支接自己分离的大肠杆菌，第三支接枯草杆菌，第四支不接种，杆菌，第三支接枯草杆菌，第四支不接种，作空白对照。在各试管上标明菌名和组别，作空白对照。在各试管上标明菌名和组别，置置37培养培养48小时。小时。（2 2
13、）培养后取出，沿管壁加入甲基红指示）培养后取出，沿管壁加入甲基红指示剂剂3 34 4滴上层呈红色者为阳性。滴上层呈红色者为阳性。6 6淀粉水解试验淀粉水解试验n某些细菌可以产生能水解培养基中淀粉某些细菌可以产生能水解培养基中淀粉的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦的淀粉酶（胞外酶），使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀芽糖和葡萄糖，再被细菌吸收利用。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。粉水解后，遇碘不再变蓝色。（1 1）淀粉培养基在水浴中融化后，冷至）淀粉培养基在水浴中融化后，冷至 50 50，以无菌操作制成平板。用接种环取，以无菌操作制成平板。用接种环取 少量枯草杆菌在平板的一边划少量枯草
14、杆菌在平板的一边划“+”“+”字形字形接接 种（或点种），另取少量大肠杆菌菌在平种（或点种），另取少量大肠杆菌菌在平 板的另一边接种，板的另一边接种，在各培养皿底部标明菌在各培养皿底部标明菌 名和组别名和组别。置。置3737温箱中培养温箱中培养16162020小时。小时。（2 2）观察结果：打开皿盖，滴加少量碘液）观察结果：打开皿盖，滴加少量碘液于培养基上，轻轻旋转培养皿，使碘液均于培养基上，轻轻旋转培养皿，使碘液均匀铺满整个平板。如果在菌周围出现无色匀铺满整个平板。如果在菌周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解。透明圈大小说透明圈，说明淀粉被水解。透明圈大小说明该菌水解淀粉能力的大小。明该菌水解淀粉能力的大小。四、结果与思考题四、结果与思考题1 1将实验结果填于将实验结果填于p114-120p114-120表中表中（1 1）糖发酵试验结果：）糖发酵试验结果：“+”“+”表示产酸；表示产酸；“”-“”-产酸产气；产酸产气；“-”“-”表示阴性。表示阴性。（2 2）其它试验结果：）其它试验结果：“+”“+”表示阳性反应；表示阳性反应；“-”“-”表示阴性反应。表示阴性反应。2 2细菌的生化反应试验意义何在？细菌的生化反应试验意义何在？
