1、质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 郑郑 敏敏生化与分子生物学系生化与分子生物学系分子生物学分子生物学 从从分子水平分子水平上研究生命现象物质基础的学上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。生理功能，以及细胞信号的转导等。基因工程基因工程移液器和EP管质质 粒粒 质粒主要发现于细菌、
2、放线菌和真菌细胞中，质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧脱氧核糖核酸核糖核酸物质。物质。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。生素的抗性等。F质粒质粒(又称又称F因子或性质粒因子或性质粒)、R质粒质粒(抗药性因子抗药性因子)和和Col质粒质粒(产大肠杆菌素因子产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。等都是常见的天然质粒。能稳定地能稳定地独立存在独立存在于染色体外，并传递到子代，于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。一般不整合到宿主染色
3、体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是常含抗生素抗性基因，是重组重组DNADNA技术技术中重要的中重要的工具。工具。分类：分类：u单拷贝质粒；单拷贝质粒；u多拷贝质粒多拷贝质粒；l紧密控制型；紧密控制型；l松弛控制型；松弛控制型；质粒质粒DNADNA的提取方法的提取方法 碱裂解法；碱裂解法；煮沸裂解法；煮沸裂解法；酚氯仿抽提法；酚氯仿抽提法；概括起来主要是用非离子型或离子型概括起来主要是用非离子型或离子型去去污剂污剂、有机溶剂或碱有机溶剂或碱进行处理及用进行处理及用加热加热处处理。理。基本思路基本思路1.1.培养细菌
4、使质粒扩增；培养细菌使质粒扩增；2.2.收集和收集和裂解细菌裂解细菌；3.3.分离质粒分离质粒DNADNA(有时还要求纯化质粒有时还要求纯化质粒DNADNA，根据实验所需根据实验所需)4.4.电泳检测；电泳检测；碱裂解法的基本原理碱裂解法的基本原理 十二烷基磺酸钠十二烷基磺酸钠(SDS)(SDS)可使可使细胞膜裂解细胞膜裂解。经经SDSSDS处理后，细菌染色体处理后，细菌染色体DNADNA会缠绕附着在细胞碎片上，会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体同时由于细菌染色体DNADNA比质粒大得多，易受机械力和核比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。酸酶等的作用而
5、被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体染色体DNADNA变性变性，而共价闭合环状而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNADNA(Covalently closed circularDNA，简称，简称cccDNA)cccDNA)的两条链不会相互分开。的两条链不会相互分开。当外界条件恢复正常时，线状染色体当外界条件恢复正常时，线状染色体DNADNA片段难以复性，片段难以复性，而是与而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒，而质粒DNADNA双链又恢复原状，重
6、新形成天然的超螺旋分子，并以溶解双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。状态存在于液相中。实验步骤实验步骤1 1、将含有质粒、将含有质粒DNADNA的细菌在的细菌在LBLB培养基中培养过夜。取培养基中培养过夜。取1.5ml 1.5ml LBLB培养液培养液倒入倒入1.5mleppendorf1.5mleppendorf管中，管中，44下下12000g12000g离心离心3030秒。秒。2 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。3 3、菌体沉淀重悬浮于、菌体沉淀重悬浮于溶液溶液中（需剧烈振荡）。中（需剧烈振荡
7、）。4 4、加入新配制的、加入新配制的溶液溶液，盖紧管口，快速温和颠倒，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorfeppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴2 2分钟。分钟。5 5、加入、加入预冷的预冷的溶液溶液，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中5 5分钟，分钟，44下下12000g12000g离心离心1010分钟。分钟。6 6、上清液、上清液移入干净移入干净eppendorfeppendorf管中，加入管中，加入等体积的等体积的饱和酚饱和酚（1:11:1），充分颠倒混匀，），充分颠倒混匀，44下下12000g12
8、000g离心离心1010分钟。分钟。7 7、将水相、将水相移入干净移入干净eppendorfeppendorf管中，加入管中，加入等体积酚等体积酚/氯仿氯仿，颠倒混匀，颠倒混匀，12000rpm12000rpm离心离心10min10min。8 8、将水相、将水相移入干净移入干净eppendorfeppendorf管中，加入管中，加入2 2倍体积倍体积的无水乙醇的无水乙醇，振荡混匀后置于，振荡混匀后置于-20-20冰箱中冰箱中2020分钟，然后分钟，然后44下下12000g12000g离心离心1010分钟。分钟。9 9、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，、弃上清，将管口敞开倒置于卫
9、生纸上使所有液体流出，加入加入 7070乙醇乙醇洗沉淀一次，洗沉淀一次，44下下12000g12000g离心离心5-105-10分分钟。钟。1010、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥燥1010分钟或室温干燥。分钟或室温干燥。1111、将沉淀溶于、将沉淀溶于缓冲液（缓冲液（pH8.0pH8.0，含，含20g/ml 20g/ml RNaseARNaseA）中，储于中，储于-20-20冰箱中。冰箱中。LBLB液体培养基（液体培养基（Luria-BertaniLuria-Bertani）称取蛋白胨（称取蛋白胨（TryptoneTryp
10、tone）10g10g，酵母提取物，酵母提取物（YeastextractYeastextract）5g5g，NaCl10gNaCl10g，溶于，溶于800ml800ml去去离子水中，用离子水中，用NaOHNaOH调调pHpH至至7.57.5，加去离子，加去离子水至总体积水至总体积1 1升，高压下蒸气灭菌升，高压下蒸气灭菌2020分钟。分钟。溶液溶液I I 50mmol/L50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，25mmol/L T r i s.Cl25mmol/L T r i s.Cl（pH8.0pH8.0），），10mmol/L10mmol/LEDTAEDTA（pH8.0pH8.0）。）。溶液溶液可
11、成批配制，每瓶可成批配制，每瓶100ml100ml，高压灭菌高压灭菌1515分钟，储存于分钟，储存于44冰箱冰箱u溶液溶液I I：重悬细菌；：重悬细菌；u葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀；uTrisTrisHClHCl：缓冲体系；：缓冲体系；uEDTAEDTA：螯合金属离子；：螯合金属离子；溶液溶液 0.2mol/L0.2mol/LNaOHNaOH（临用前用临用前用10mol/LNaOH10mol/LNaOH母液稀释），母液稀释），1 1SDSSDSu溶液溶液IIII破膜，变性基因组破膜，变性基因组DNADNA和蛋白质；和蛋白质；uSDSSDS破膜作用，变性蛋白质
12、；破膜作用，变性蛋白质；uNaOHNaOH破膜，变性基因组破膜，变性基因组DNADNA；溶液溶液 5mol/LKAc60ml5mol/LKAc60ml，冰醋酸冰醋酸11.5ml11.5ml，H2O H2O 28.5ml28.5ml，定容至定容至100ml100ml，并高压灭菌。溶液并高压灭菌。溶液终浓度为：终浓度为：K+3mol/LK+3mol/L，Ac5mol/LAc5mol/L。u溶液溶液IIIIII中和溶液，复性质粒中和溶液，复性质粒DNADNA；酚酚/氯仿（氯仿（1:11:1）u酚酚变性蛋白质；变性蛋白质；u氯仿氯仿萃取溶液中的酚；萃取溶液中的酚；分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿分为
13、两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。混合液。吸取时不要震荡。乙醇乙醇u无水乙醇（无水乙醇（2 2倍体积）倍体积）沉淀质粒沉淀质粒DNADNA；u70%70%乙醇乙醇洗涤质粒洗涤质粒DNADNA沉淀，沉淀，除去沉淀中的盐分；除去沉淀中的盐分；核酸的定量 260 nm，1OD值相当于：值相当于：双链双链DNA浓度为浓度为50 g/ml单链单链DNA浓度为浓度为40 g/mlA260/A280=1.8（DNA）A260/A280=2.0（RNA）电电 泳泳 Electrophoresis 电泳电泳带电粒子在直流电场中向着电性带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。相反电极移
14、动的现象。电泳分析技术电泳分析技术利用电泳现象进行物质利用电泳现象进行物质分离的技术。分离的技术。二、电泳分析技术发展概况二、电泳分析技术发展概况 1809年年 发现电泳现象发现电泳现象 1937年年 Tiselius 自由界面电泳自由界面电泳 1948年年 Wieland 滤纸电泳滤纸电泳 1980年年 毛细管电泳毛细管电泳 (capiliary electrophoresis三、电泳分析技术的分类三、电泳分析技术的分类4.4.按支持物的物理性状不同按支持物的物理性状不同a)a)滤纸及其他纤维薄膜电泳滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维纤维、聚氯乙烯
15、纤维b)b)凝胶电泳凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳丙烯酰胺凝胶电泳c)c)粉末电泳，粉末电泳，纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳d)d)丝状电泳丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳如尼龙丝、人造丝电泳5.5.按支持物的装置形式不同按支持物的装置形式不同a)平板式电泳平板式电泳b)垂直板式电泳垂直板式电泳c)垂直柱式电泳垂直柱式电泳6 6.根据电泳系统根据电泳系统pHpH是否连续是否连续 连续连续pHpH电泳电泳指电泳过程中指电泳过程中pHpH保持不变；保持不变；不连续不连续pHpH电泳电泳指电极缓冲液和电泳支持物的不指电极
16、缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的同区段也有不同的pHpH ；电泳技术的特点电泳技术的特点:凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离离,并可进行定性或定量分析并可进行定性或定量分析;样品用量极少样品用量极少;设备简单设备简单;可在常温进行可在常温进行;操作简便省时操作简便省时;分辨率高分辨率高.移动速度移动速度以蛋白质分子为例以蛋白质分子为例:迁移率迁移率（Mobility)Mobility)带电颗粒在单位带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。电场强度下的泳动速度。V QV Q M=M=E 6 E 6 r r 五、影响电泳速度的因素五、影响电泳速度的因素
17、1.1.电场强度（电场强度（E E）E E电流电流热效应热效应支持介质上的水分蒸发支持介质上的水分蒸发样品样品的热变性的热变性 EE电泳速度慢电泳速度慢延长电泳时间延长电泳时间样品扩散样品扩散区带模区带模糊不清糊不清分辨率下降分辨率下降2.2.带点颗粒的半径带点颗粒的半径 r r 阻力阻力电泳速度变慢电泳速度变慢3.3.支持物介质支持物介质吸附作用；电渗作用；分子筛作用吸附作用；电渗作用；分子筛作用4 4 缓冲液缓冲液 离子强度（离子强度（I I）：pHpH电泳电泳 在一定电场强度下，在一定电场强度下，DNADNA分子的迁移取决于分子分子的迁移取决于分子筛效应，即筛效应，即DNADNA分子本身
18、的分子本身的大小大小和和构型构型(相对分子相对分子质量不同的质量不同的DNADNA片段泳动速度不一样片段泳动速度不一样)，且，且DNADNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。关系。凝胶电泳凝胶电泳不仅可分离不仅可分离不同相对分子质量不同相对分子质量的的DNADNA，也可以也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的分离相对分子质量相同，但构型不同的DNADNA分子。分子。琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部
19、分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛分子筛，常用于，常用于凝凝胶层析和电泳胶层析和电泳。电泳鉴定电泳鉴定 其中其中超螺旋结构超螺旋结构泳动最快；泳动最快；其次为其次为线性结构；线性结构；最慢的可能是最慢的可能是复制中间体复制中间体（没有复制完的两（没有复制完的两个质粒连在一起）；个质粒连在一起）；染料染料EBEB 溴化乙锭（溴化乙锭（EBEB）是一种荧光染料）是一种荧光染料(3,8-(3,8-二氨二氨基基-5-5-乙基乙基-6-6苯基菲啶溴盐苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光。下，发出橙色荧光。注意注意 EBEB是诱变剂，配制和使用是诱变剂，配制和使用EBEB染色液时，应染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EBEB的的器皿或物品，必须进行清洗或弃去。器皿或物品，必须进行清洗或弃去。
