1、实验二实验二 GSTZ基因的基因的PCR扩增扩增Amplifying GSTZ gene by Polymerase Chain Reaction核酸的体外扩增v真核细胞内DNA的复制v聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）The Nobel Prize in Chemistry 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry for his invention of the polymerase chain reaction(PCR)method
2、 Kary B.MullisLa Jolla,CA,USA B:1944 一、一、PCR的基本原理：的基本原理：一种模拟天然DNA复制的体外扩增法PCR反应三部曲：变性(denature)：加热使双链DNA解开螺旋退火(annealing)在退火温度条件下引物同模板杂交延伸(extend)在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物 DNA模板模板 template 引物引物 primers dNTPs 耐热聚合酶耐热聚合酶 Taq DNA polymerase 反应缓冲液反应缓冲液 reaction buffer MgCl2 试剂原液浓度工作浓度50l体系P
3、CR缓冲液 1015L上游引物10mol/L0.5mol/L2.5L下游引物10mol/L0.5mol/L2.5LdNTPs2.5mmol/L 200mol/L4LMgCl225mmol/L1.5mmol/L3LDNA模板 0.110ngddH2O补足47.5LTaq酶1U/L2.5U/50L体系2.5LPCR PARAMETERvPre-denature:94 5minvPCR Cycles:Denature 94 40secAnnealing 58 35secExtend72 1min30secvTotally 3540 cyclesvPost-extend:72 7min DNA模板模板
4、 template 引物引物 primers dNTPs 耐热聚合酶耐热聚合酶 Taq DNA polymerase 反应缓冲液反应缓冲液 reaction buffer MgCl2 DNA模板模板 template 引物引物 primers dNTPs 耐热聚合酶耐热聚合酶 Taq DNA polymerase 反应缓冲液反应缓冲液 reaction buffer MgCl2 引物-人工合成的寡核苷酸v一般PCR反应中引物的终浓度为0.1-1mol/L，在此范围内产物量基本相同。引物浓度低于0.1mol/L时，产物量降低；引物浓度过高会引导非特异产物扩增，还会增加引物二聚体的形成。引物设计原
5、则：软件+经验v引物长度以15-30个碱基为宜；v引物碱基尽可能随机分布，G+C含量宜在4555%左右；v引物内部、引物之间不应形成二级结构；v避免重复多聚碱基；v引物与核酸序列数据库的其他序列无明显同源性；v两个引物的Tm值要尽可能接近；重组时引物设计的其它几个问题：1.移码突变 2.酶切位点3.保护碱基引物引物AATTGGATCCATGGCGAATTCCGGCGAAGA(BamH I)引物引物BACCAAGCTTGATGGTGGAAGAAGGAGC(Hind III)DNA模板模板 template 引物引物 primers dNTPs 耐热聚合酶耐热聚合酶 Taq DNA polymer
6、ase 反应缓冲液反应缓冲液 reaction buffer MgCl2 三磷酸脱氧核苷（dNTPs）v四种三磷酸脱氧核苷（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是DNA合成的基本原料，工作浓度应为20200mmol/L。所用的四种dNTP的浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。dNTPs浓度过低则反应速度下降，dNTPs浓度过高则扩增特异性降低，而且当dNTP浓度高于50mM时也会抑制Taq DNA聚合酶的活性。DNA模板模板 template 引物引物 primers dNTPs 耐热聚合酶耐热聚合酶 Taq DNA polymerase 反应缓冲液反应缓冲液 reaction buffe
7、r MgCl2 耐热DNA聚合酶 vTaq聚合酶是从耐热菌（thermus aquatious）中提取出来的耐热酶，95仍有活性。该酶的应用浓度一般为12.5U/50L反应体系，然而，酶的用量可依据不同的模板分子或引物而变化。酶浓度过高时，会出现非特异性扩增；过低时扩增产物量很低。反应缓冲液反应缓冲液vTris-HClvKClv酶的稳定剂A typical reaction buffer for PCR would something like:10mM Tris,pH 8.3 50mM KCl 0.01%gelatin DNA模板模板 template 引物引物 primers dNTPs
8、耐热聚合酶耐热聚合酶 Taq DNA polymerase 反应缓冲液反应缓冲液 reaction buffer MgCl2 Mg2+vMg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的。Mg2+浓度直接影响着酶的活性与忠实性、产物的特异性以及引物二聚体的形成等等。Generally,low Mg2+leads to low yields(or no yield)high Mg2+leads to accumulation of nonspecific products(mispriming).The MgCl2 concentration in the final reaction mixture
9、is usually between 0.5 to 5.0mM,试剂原液浓度工作浓度50l体系PCR缓冲液 1015L上游引物10mol/L0.5mol/L2.5L下游引物10mol/L0.5mol/L2.5LdNTPs2.5mmol/L 200mol/L4LMgCl225mmol/L1.5mmol/L3LDNA模板 0.110ngddH2O补足47.5LTaq酶1U/L2.5U/50L体系2.5L循环参数 v变性温度和时间变性温度和时间 v复性温度和时间复性温度和时间 v延伸温度和时间延伸温度和时间 v循环数循环数 变性温度与时间变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下
10、，93941min足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。退火(复性)温度与时间v退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(210)v在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。v复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。延伸温度与时间vTaq DNA聚合酶的生物学活
11、性：7080 150核苷酸/S/酶分子70 60核苷酸/S/酶分子55 24核苷酸/S/酶分子vPCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。vPCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。0.0
12、00.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRnThreshold104103102PCR PARAMETERvPre-denature:94 3minvPCR Cycles:Denature 94 30sec1minAnnealing Tm-(210)30sec1minExtension72 based on the length of ampliconvTotally 30-40 cyclesvPost-extension:72 7min 无扩增产物 非特异性扩增 拖尾 假阳性无扩增产物1.1.模板模板:含有抑制物，含
13、量低含有抑制物，含量低2.2.BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生降引物设计不当或者发生降解解4.4.反应条件：反应条件：退火温度太高，延退火温度太高，延伸时间太短伸时间太短 原原因因对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂盒提取纯化模板或者使用试剂盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2.2.更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链间二聚重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一体和链内二级结构）或者换一管新引物管新引物4.4.降低退火温度、延长延伸时间降低退火温度、延长延伸时间现象：正
14、对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无；非特异性扩增 现象：现象：PCRPCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高3.3.酶量过多酶量过多4.4.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.重新设计引物或者使用巢重新设计引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.适当降低模板或引物浓度适当降低模板或引物
15、浓度3.3.适当减少酶量适当减少酶量4.4.降低镁离子浓度降低镁离子浓度5.5.适当提高退火温度或使用适当提高退火温度或使用二阶段温度法二阶段温度法6.6.减少循环次数减少循环次数 非特异性扩增 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态。M 1 21.1.模板不纯模板不纯2.2.BufferBuffer不合适不合适3.3.退火温度偏低退火温度偏低4.4.酶量过多酶量过多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6.6.循环次数过多循环次数过多 原原因因对对策策1.1.纯化模板纯化模板2.2.更换更换BufferBuffer3.3.适当提高退火温度适当提高
16、退火温度4.4.适量用酶适量用酶5.5.适当降低适当降低dNTPdNTP和和镁离子镁离子的的浓度浓度6.6.减少循环次数减少循环次数 拖尾 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况（筛选转基因、检测基因表达情况)原因：靶序列或扩增产物的交叉污染靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物 对策：1.1.操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2.2.除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头
17、等均应一次性使用。及加样枪头等均应一次性使用。3.3.各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。PCR的应用v高特异性v高灵敏度 防止污染v简便快速v用途广泛：DNA测序测序各对病毒特异性引物各对病毒特异性引物PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果产物琼脂糖凝胶电泳结果Bsendai；ChPIV 1；DhPIV 2；ESV 5；FhPIV 3；GhPIV 4；HINF A；IINF B；A为分子量为分子量Marker（2Kbp,1Kbp,750bp,500bp,250bp,100bp）ABCDEFGHI病原体检测病原体检测定量定量PCRPCRPCR PhasesTrad
18、itional PCR detectiony=x 2n转染转染p15质粒及质粒及SiRNA后后p15基因表达情况基因表达情况A：转染p15质粒及SiRNA后p15基因的表达情况M:分子Marker DL 2,000;1 Control;2 转空载体;3 转入p15质粒;4 转入p15质粒+p15 siRNA;5.转入p15质粒+无意义siRNA半定量半定量PCR“Semi-qPCR”实时定量实时定量PCR “Real-Time qPCR”cap PCR vesselthermal block samplelens0.000.100.200.300.400.500.600.700.800.900
19、510152025303540PCR cycle numberBaseline regionThresholdCTNo Template control SampleNormalised reporter fluorescence(Rn)Geometric PhasePCR Efficiency1CT:Threshold cycleThe calculated fractional cycle number at which the fluorescence passes the fixed thresholdCt值极具重现性PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图Ct与
20、初始模板的关系初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct 值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出样品中所含的模板量0.000.501.001.502.002.503.001416182022242628303234363840CycleRnThreshold104103102常用的荧光定量常用的荧光定量PCRPCR试剂试剂TaqMan probeHybridises with the target ampliconIs 3 terminally blocked(cannot be extended by the polymerase)Has two f
21、luorescent dyes attached:1.Reporter(R)2.Quencher(Q)35Fluorogenic 5 nuclease assay(TaqMan chemistry)RQforward primerreverse primer33553551.PolymerisationprobeRQ33553552.Strand displacementQ33553553.CleavageR3553554.Polymerisation completedQRR=ReporterQ=Quencher3v随着扩增循环数的增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强
22、度与扩增产物的数量呈正比关系vTaqMan探针应用基因检测、病毒定量、细胞因子基因定量、癌细胞基因微突变检测等v其结果都具有高特异性与高敏感性v但只适合于一个特定的目标SYBR Green Iv结合到双链DNA的小沟部位v只有和双链DNA结合后才发荧光SYBR Green I SYBR Green I 工作原理未结合的SYBR green I结合解离曲线识别不同的PCR产物95 15sec;60 20sec;95 15sec在60 95 之间的Ramp time设为19:59SYBR Green ISYBR Green I的特点的特点可以用于不同的模板使用方便，价格相对便宜灵敏度很高与非特异性
23、产物结合解离曲线选择良好的引物和探针并优化反应条件 定量定量 绝对标准曲线方法绝对标准曲线方法标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA 准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好分装后保存于-80 假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出 目的基因的量=2-Ct Ct=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照 2-Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线 更为简便省时，也是相当可靠的 定量定量 相对相对 Ct值方法值方法Expression of GPR30 in different prostate cellsEffect of siRNA on the expression of GPR30 in 293T cells transfected with pGPR30-IRES2-EGFP plasmid1.Control2.anti GPR30 siRNA3.Scramble siRNA
