1、2.2.3 2.2.3 化学发光分析法化学发光分析法一概述一概述二基本原理二基本原理三化学发光测量仪三化学发光测量仪四化学发光分析技术四化学发光分析技术五.五.化学发光分析的特点及应用化学发光分析的特点及应用六.六.六生物发光分析简介六生物发光分析简介 化学发光分析法化学发光分析法一概述一概述1.化学发光化学发光(chemi-luminescence,CL)：由反应产物：由反应产物吸收该反应的化学能而被激发，并发射出光子，吸收该反应的化学能而被激发，并发射出光子，或化学能转移至受体分子上，由受体分子发射出或化学能转移至受体分子上，由受体分子发射出光子的现象。光子的现象。2.化学发光分析法化学发
2、光分析法：根据：根据受激发分子发射光谱及发受激发分子发射光谱及发射光强度射光强度对物质进行定性、定量分析的方法。对物质进行定性、定量分析的方法。(与与磷光相似磷光相似)是超微量分析技术。是超微量分析技术。二基本原理二基本原理(一一)化学发光反应及激发态分子的产生化学发光反应及激发态分子的产生1.化学发光反应的产生化学发光反应的产生：化学能转变为光能。：化学能转变为光能。a.化学反应必须产生足够的化学能化学反应必须产生足够的化学能 b.反应速度快。反应速度快。2.反应机制反应机制：a.电子转移反应，电子转移反应，b.化学键断裂反应。化学键断裂反应。3.激发态分子的产生激发态分子的产生：直接化学发
3、光直接化学发光，敏化发光敏化发光分子光谱分析法分子光谱分析法化学发光分析法化学发光分析法A+BC*+DC+hA+BC*+DC+hA+BC*+DC+hA+BC*+DC+hA+BC*+DC+hA+BI*+DC+hA+BI*+DC+hA+BC*+DC+hA+BI*+DC+h2.混合速度混合速度：CL分析检测是在混合反应中进行，分析检测是在混合反应中进行，可用发光强度可用发光强度-时间曲线反映混合的动力学过程，时间曲线反映混合的动力学过程，Io(t)=Icl(t)混合份数混合份数 式中：式中：Icl(t)-在时间在时间t时的发光强度（光子时的发光强度（光子/秒）；秒）；Io(t)-由此可见，化学发光强
4、度受混合方式由此可见，化学发光强度受混合方式的影响。的影响。分子光谱分析法分子光谱分析法化学发光分析法化学发光分析法三化学发光测量仪三化学发光测量仪 化学发光仪化学发光仪：将反应的发射：将反应的发射光光照到高灵敏度的照到高灵敏度的光电倍光电倍 增管增管上，上，光信号光信号变为变为电信号电信号，经信号处理系统放，经信号处理系统放 大后，从指示器上得到光强度的记录图或数字显大后，从指示器上得到光强度的记录图或数字显 示的装置。示的装置。分子光谱分析法分子光谱分析法化学发光分析法化学发光分析法（一）化学发光仪主要部件（一）化学发光仪主要部件 1.样品室（即反应室）：样品室（即反应室）：提供化学发光物
5、质的反应提供化学发光物质的反应 室，又叫流通池室，又叫流通池2.检测器：用于检测和定量光强度。检测器：用于检测和定量光强度。3.稳定的负高压：增大负高压可增加测量的灵敏度。稳定的负高压：增大负高压可增加测量的灵敏度。4.信号处理系统：将光电倍增管检测光信号用电子学方信号处理系统：将光电倍增管检测光信号用电子学方 法进行处理法进行处理5.数据处理数据处理 显示和记录处理结果。显示和记录处理结果。分子光谱分析法分子光谱分析法化学发光分析法化学发光分析法（二）化学发光仪的类型（二）化学发光仪的类型按信号和数据处理的不同方式分为三类；按信号和数据处理的不同方式分为三类；特点：特点：1.电流电压型发光仪
6、：测定光电流或光电压。电流电压型发光仪：测定光电流或光电压。2.数字式发光仪：数字式发光仪：测定光电压（或光电流）转换测定光电压（或光电流）转换 的脉冲数或光子数的脉冲数或光子数3.智能发光仪：发光仪与计算机连接，控制发光智能发光仪：发光仪与计算机连接，控制发光 仪工作，提高发光仪的自动化程度。仪工作，提高发光仪的自动化程度。分子光谱分析法分子光谱分析法化学发光分析法化学发光分析法四化学发光分析技术四化学发光分析技术 化学发光反应可在气相、火焰、液相中（大多数）化学发光反应可在气相、火焰、液相中（大多数）进行，为了提高灵敏度和选择性，需选合适的发光体进行，为了提高灵敏度和选择性，需选合适的发光
7、体系、有效的分离手段和灵敏的检测方法。系、有效的分离手段和灵敏的检测方法。(一一)发光剂的选择发光剂的选择1.发光量子效率：发光量子效率：u=光子数光子数/反应物的分子数反应物的分子数*100%2.常用的发光体系：常用的发光体系：分子光谱分析法分子光谱分析法化学发光分析法化学发光分析法p鲁米诺体系鲁米诺体系p过氧化草酸酯类过氧化草酸酯类p光泽精光泽精p氨基苯二胱肼类氨基苯二胱肼类p吖啶酯类吖啶酯类p喽唑类喽唑类p苯酚类化合物（邻苯三酚）。苯酚类化合物（邻苯三酚）。(二二)测定条件的选择测定条件的选择 1.混合方式和混合时间混合方式和混合时间：混合和测定同步进行；混合和测定同步进行；混合时流速快
8、且混合均匀。混合时流速快且混合均匀。2.反应条件的选择反应条件的选择：流动相（载体）的选择，缓冲：流动相（载体）的选择，缓冲液的选择，发光反应试剂浓度的选择，试剂纯度，液的选择，发光反应试剂浓度的选择，试剂纯度，蠕动泵。蠕动泵。3.检测器的选择检测器的选择：应选背景小、灵敏度高、使用寿：应选背景小、灵敏度高、使用寿命长的检测器。命长的检测器。分子光谱分析法分子光谱分析法化学发光分析法化学发光分析法(三三)定量分析方法定量分析方法 Icl(t)=KC 常用方法：常用方法：1、标准曲线法。、标准曲线法。2、直接比较法。、直接比较法。3、标准加入法。、标准加入法。(四四)化学发光分析体系的特殊颜色化
9、学发光分析体系的特殊颜色1.发光体系不同发光体系不同反应机制不同反应机制不同激态复合物不同激态复合物不同 发射不同颜色的光。发射不同颜色的光。2.发光体系发射光谱可用快速脉冲光谱仪测得。发光体系发射光谱可用快速脉冲光谱仪测得。分子光谱分析法分子光谱分析法化学发光分析法化学发光分析法五、化学发光分析的特点及应用五、化学发光分析的特点及应用(一一)化学发光分析的特点化学发光分析的特点1.灵敏度高；灵敏度高；2.线性范围宽；线性范围宽；3.操作简便、快速；操作简便、快速；4.无放射性；无放射性；5.价格低廉价格低廉;但发光体系的选择性较差。但发光体系的选择性较差。(二二)化学发光分析的应用化学发光分
10、析的应用1.铬的测定；铬的测定；2.NO2-的测定的测定3.化学发光标记法：用化学发光物质标记抗原。如果化学发光化学发光标记法：用化学发光物质标记抗原。如果化学发光 物质标记在抗体上就称为免疫化学发光分析。物质标记在抗体上就称为免疫化学发光分析。(三三)展望展望分子光谱分析法分子光谱分析法化学发光分析法化学发光分析法应用：应用：海洋发光菌制备生物芯片测定水体生化耗氧量海洋发光菌制备生物芯片测定水体生化耗氧量（排污（排污BOD60mgL;(COD15mgL，)Chemiluminescence Determination of 6-Mercaptopurine in the Luminol-Po
11、tassium Ferricyanide System，Spect roscopy and Spect ral Analysis，Vol128,No1 5,pp1026-1029，May,2008Chemiluminescence from singlet oxygen that was detected at two wavelengths and effects of biomolecules on it.Talanta.2009 Jan 15;77(3):1223-7.Epub 2008 Sep 3 六生物发光分析简介六生物发光分析简介(一一)生物发光原理生物发光原理生物发光是生物体内产
12、生的化学发光现象，通常是指由酶参与生物发光是生物体内产生的化学发光现象，通常是指由酶参与的化学发光现象，很多机制与化学发光类似。例如的化学发光现象，很多机制与化学发光类似。例如1.萤火虫生物发光。萤火虫生物发光。2.腔肠动物生物发光。腔肠动物生物发光。(二二)超微弱发光超微弱发光(三三)生物发光分析的应用及前景生物发光分析的应用及前景1.发光细菌及其发光系统的应用发光细菌及其发光系统的应用2.吞噬细胞化学发光分析吞噬细胞化学发光分析3.活性氧的发光分析活性氧的发光分析4.血清的超弱发光与疾病诊断：疾病与血清发光有相依关系，脂血清的超弱发光与疾病诊断：疾病与血清发光有相依关系，脂质化合物与氧发生
13、脂质过氧化反应。细胞、组织、器官存在的与质化合物与氧发生脂质过氧化反应。细胞、组织、器官存在的与新陈代谢相关的发光现象是由脂质过氧化所影响，可发射极微弱新陈代谢相关的发光现象是由脂质过氧化所影响，可发射极微弱的光，自发的化学发光。的光，自发的化学发光。分子光谱分析法分子光谱分析法化学发光分析法化学发光分析法多功能微孔板液闪仪（液闪计数器）多功能微孔板液闪仪（液闪计数器）芬兰Hidex 型号 Chameleon 液体闪烁计数器：液体闪烁计数器：测定发生测定发生核衰变的放核衰变的放射性核素，尤其对低能射性核素，尤其对低能更为有效。更为有效。基本原理基本原理：依据射线与物质相互作用产：依据射线与物质
14、相互作用产生荧光效应。生荧光效应。应用应用：探测低能：探测低能核素示踪原子的放射性，核素示踪原子的放射性，液闪计数器组成液闪计数器组成：光电倍增管、收光系统、放：光电倍增管、收光系统、放大器、脉冲幅度分析器、样品系统组成大器、脉冲幅度分析器、样品系统组成 产品特点产品特点同一台仪器可实现同一台仪器可实现LUM、FI、TRF、FP、ABS及及LSC等六种不同功能等六种不同功能首创放射性检测与非放射性检测整合首创放射性检测与非放射性检测整合PMT检测器拥有检测器拥有Filter和和Direct两种工两种工作模式作模式能用于野外实时采样作业能用于野外实时采样作业特点特点u 高灵敏度的液闪计数、高灵敏
15、度的液闪计数、计数、化学发计数、化学发光计数检测，三种功能合一光计数检测，三种功能合一u生物、医药、生命科学、环境检测方面生物、医药、生命科学、环境检测方面放射性检测放射性检测u单样品检测，可使用不同型号的样品瓶单样品检测，可使用不同型号的样品瓶u实验室、野外实地检测实验室、野外实地检测 性能性能1.化学发光化学发光:70%（125I）5.样品类型样品类型:适用于适用于LSC样品瓶、微型试管、样品瓶、微型试管、样品管样品管6.检测器检测器:PMT型检测器型检测器7.操作软件操作软件:单独操作，也可单独操作，也可CommFiler控制控制软件通过电脑来控制、输出结果软件通过电脑来控制、输出结果8
16、.数据输出数据输出:标准标准RS232接口连电脑控制接口连电脑控制9.尺寸尺寸:9 kg;25 cm(w)33 cm(d)19 cm(h)功能功能1.放射性污染物放射性污染物2.测定如测定如222Rn等元素的等元素的射线量射线量3.3H、14C、32P放射性标记放射性标记4.用于诊断研究的用于诊断研究的125I放射性免疫测定放射性免疫测定5.ATP发光检测、基因检测、免疫、毒发光检测、基因检测、免疫、毒理学检测理学检测3.应用应用3.1 细胞与分子生物学：细胞与分子生物学：3H、14C、32P等放射性核素进等放射性核素进行体内或体外标记。生物大分子的合成与降解代谢及行体内或体外标记。生物大分子
17、的合成与降解代谢及其转化途径。其转化途径。3.2 生物医学：放射免疫分析激素等体内内分泌和其它生生物医学：放射免疫分析激素等体内内分泌和其它生理代谢行为。理代谢行为。3.3 动植物营养：对元素标记测定，研究动物、植物对营动植物营养：对元素标记测定，研究动物、植物对营养元素、矿质元素的吸收利用率、生理代谢及其缺素养元素、矿质元素的吸收利用率、生理代谢及其缺素症症3.4 环境科学：标记示踪原子，研究有毒有害物质在环境环境科学：标记示踪原子，研究有毒有害物质在环境体系的行为、去向和污染程度。体系的行为、去向和污染程度。3.5 生物体中发光测定：单光子监测了测定生物体内发光生物体中发光测定：单光子监测了测定生物体内发光与单光子事件和环境变化关系的研究。与单光子事件和环境变化关系的研究。
