1、专业：矿物加工工程姓名：邵雪嫚导师：张明旭教授安徽理工大学安徽理工大学1313级硕士研究生级硕士研究生 学位论文学位论文答辩答辩报告报告1报告主要内容报告主要内容n课题来源课题来源n立题依据立题依据n国内外研究进展国内外研究进展n本研究的目的和意义本研究的目的和意义n研究内容研究内容 n研究方法和技术路线研究方法和技术路线n预期目标预期目标n新颖之处新颖之处 n所需解决的主要问题所需解决的主要问题n研究基础和条件研究基础和条件 n研究进度及经费预算研究进度及经费预算2选题背景选题背景n最近几年，由于煤炭的降解机理及降解酶有着直接的关系，所以煤炭的生物降解研究主要集中在白腐菌所产生的一系列降解酶
2、，由此也联想到通过提高酶活性和产酶量来达到高降解转化率的目的。一般来说，MnP氧化大部分酚类、胺类等底物，LiP及其互为补充，氧化相对应的物质，而漆酶不仅可以氧化胺类物质也可氧化酚类物质 9,10。微生物降解煤中有机硫研究已经取得很大的进展11-12，其中研究最多的属嗜硫菌对模型化合物DBT的降解，并且其确定了4S途径的降解机理13，对于其他含硫模型化合的研究较少，因此本课题研究了DBTO2的脱硫情况。31.课题来源课题来源n基于基因工程构建煤炭降解工程菌基于基因工程构建煤炭降解工程菌降解转化煤炭的机理研究降解转化煤炭的机理研究(51374014)n生物酶脱除煤炭中有机硫的机理研生物酶脱除煤炭
3、中有机硫的机理研究究（51474012）42.立题依据立题依据 橡胶橡胶是我国重要的战略物资是我国重要的战略物资。国内外国内外已从橡胶中已从橡胶中克隆了近克隆了近420420种基因或种基因或cDNAcDNA，然而这些基因基本，然而这些基因基本均是从均是从橡胶树橡胶树cDNAcDNA文库或其总基因组中获得文库或其总基因组中获得，无法确定其在无法确定其在橡胶树染色体上的位置和分布特点，从而导致无法进橡胶树染色体上的位置和分布特点，从而导致无法进一步确定其所在的连锁群。研究者也先后发表了利用一步确定其所在的连锁群。研究者也先后发表了利用各种各种分子标记构建的橡胶树连锁遗传图分子标记构建的橡胶树连锁遗
4、传图，但均是但均是从总从总基因组中获得基因组中获得，并存在着不同程度的连锁群不稳定，并存在着不同程度的连锁群不稳定，丰度小而且分布不均匀，许多功能基因在染色体组上丰度小而且分布不均匀，许多功能基因在染色体组上的连锁关系和位置都不清楚，的连锁关系和位置都不清楚，直接利用分子标记辅助直接利用分子标记辅助橡胶树育种难度较大。橡胶树育种难度较大。53.国内外研究进展国内外研究进展目前木质素降解酶已成为国内研究的热点，石开仪等人目前木质素降解酶已成为国内研究的热点，石开仪等人发现白腐真菌通过发现白腐真菌通过Lac和和Lip的催化作用可以使百里酚的催化作用可以使百里酚脱酚基、脱甲基、开环、氧化等。何宝燕、
5、尹华、彭脱酚基、脱甲基、开环、氧化等。何宝燕、尹华、彭辉等人研究了黄孢原毛平革菌辉等人研究了黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)对十溴联苯醚对十溴联苯醚(BDE209)的降解；发现的降解；发现在含在含1mg/LBDE209的降解体系中，生物量为的降解体系中，生物量为1.74g降解降解率达到最大率达到最大(86.76%)；卢永等利用黄抱原毛平革菌对；卢永等利用黄抱原毛平革菌对焦化废水进行降解研究，找到了降解的最优条件焦化废水进行降解研究，找到了降解的最优条件19；曾斌等研究了白腐真菌对五氯酚的降解情况曾斌等研究了白腐真菌对五氯酚的降解情况 20；这；这些都为进
6、一步探索微生物对有机物的降解打下了基础。些都为进一步探索微生物对有机物的降解打下了基础。6研究内容n （1）紫外诱变对黄孢原毛平革菌酶活性的）紫外诱变对黄孢原毛平革菌酶活性的影响以及酶活性及降解率之间的关系。影响以及酶活性及降解率之间的关系。n （2）微波诱变后的诱变菌的酶活性变化以及）微波诱变后的诱变菌的酶活性变化以及对低阶煤的降解状况。对低阶煤的降解状况。n （3）紫外，微波处理的球红假单胞菌对）紫外，微波处理的球红假单胞菌对DBT的降解状况及最适诱变时间。的降解状况及最适诱变时间。n（4）利用响应面处理的方法探索影响）利用响应面处理的方法探索影响DBT降降解效果的因素。解效果的因素。n
7、（5）球红假单胞菌对其他含硫模型化合物的）球红假单胞菌对其他含硫模型化合物的降解。降解。7创新点创新点 n （1）目前，对于利用紫外、微波诱变方法，筛选诱变菌种已做了大量的研究工作，但是这两种处理方法对降解酶系的活性和产量有无影响，以及降解酶活性及降解转化率之间的关系还有待于进一步探索。n（2）球红菌可以降解转化DBT已被我们所熟知，但是紫外或是微波处理后的菌种对其降解效果还未被探究。n（3）球红菌对其他的含硫模型化合有无降解能力，降解效果如何，降解产物具体是那些等问题还未被探究。n（4）首次利用响应面的方法探索了球红菌降解DBT的影响因素的最佳组合n（5）结合生物酶提纯技术，首次探索了紫外，
8、微波诱变处理后降解酶的浓度变化及酶活性变化。.8 已发表的已发表的采用高通量测序采用高通量测序的的植物全基因组植物全基因组 De nove 测测序序:黄瓜黄瓜(Cucumis sativus)（Huang S等等,2009）苹果苹果(MalusdomesticaBorkhMalusdomesticaBorkh)()(Velasco R等等,2010)野生大豆野生大豆(Glycine soja)()(Kim M Y等等,2010)森林草莓（森林草莓（Shulaev V等等,2011)、可可树可可树(Argout X等等,2011)麻风树麻风树(Jatropha curcas)(Sato S)(S
9、ato S等等,2011),2011)枣椰树枣椰树(Phoenix dactylifera)()(Al-Dous E K等等,2011)马铃薯马铃薯(Solanum tuberosum)(Xu X等等,2011)白菜白菜(Brassica rapa)()(Wang X等等,2011)大麻大麻(Cannabis sativaCannabis sativa)()(van Bakel H等等,2011)木豆木豆(Cajanus cajan)()(Varshney R K等等,2012)蒺藜苜蓿蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)()(Young N 等等,2011)橡胶树的橡胶树的全基
10、因组全基因组 DeDe nove nove 测序测序目前还为发布。目前还为发布。在植物方面对植物单条染色体进行高通量测序仅在小在植物方面对植物单条染色体进行高通量测序仅在小麦的单条染色体臂（聂小军等麦的单条染色体臂（聂小军等,2013）的研究中有过报）的研究中有过报道，在橡胶树中尚未见报道。道，在橡胶树中尚未见报道。9 基因组测序只能测出整个基因组测序只能测出整个DNADNA的碱基对排列顺序，的碱基对排列顺序，不能直接测出不能直接测出DNADNA上的基因及其功能，必须上的基因及其功能，必须通过生物信通过生物信息学方法，结合蛋白组学、转录组学，对测出来的序息学方法，结合蛋白组学、转录组学，对测出
11、来的序列进行分析，将基因及其功能加以挖掘、注释，列进行分析，将基因及其功能加以挖掘、注释，这称这称作作基因注释基因注释。基因组注释主要包括四个研究方向：。基因组注释主要包括四个研究方向：重重复序列的识别；非编码复序列的识别；非编码RNARNA的预测；基因结构预测和基的预测；基因结构预测和基因功能注释因功能注释。在国内外。在国内外在植物方面在植物方面已有对已有对花生花生(陈华陈华等等,2009)、水稻、水稻(王宏斌等王宏斌等,2010)、大豆大豆(王茵茵王茵茵等等,2010)、杜仲杜仲(李铁柱李铁柱,2012)、构树、构树(彭建军彭建军,2013)，拟南芥拟南芥(张翔张翔,2012,2013)等
12、等进行基因注释的相关报道。进行基因注释的相关报道。在橡胶树上的基因注释比较少。在橡胶树上的基因注释比较少。104.本研究目的和意义本研究目的和意义 本研究采用本研究采用显微玻璃针分离技术显微玻璃针分离技术对巴西橡胶树部分染色体进对巴西橡胶树部分染色体进行单染色体显微分离，再利用行单染色体显微分离，再利用单细胞全基因组扩增法对橡胶树部单细胞全基因组扩增法对橡胶树部分单染色体进行体外扩增，分单染色体进行体外扩增，并对其第二轮并对其第二轮PCR产物采用产物采用Illumina/Solexa高通量测序高通量测序技术进行测序，进而对相应染色体的技术进行测序，进而对相应染色体的序列进行序列进行序列分析序列
13、分析、功能注释功能注释，从而进一步，从而进一步明确橡胶树已知的重明确橡胶树已知的重要功能基因和预测功能的基因在橡胶树染色体组上的位置要功能基因和预测功能的基因在橡胶树染色体组上的位置，初步，初步对现有的对现有的橡胶树连锁群进行归类橡胶树连锁群进行归类。本项目可为筛选橡胶树染色体特异片段、单染色体或其区段本项目可为筛选橡胶树染色体特异片段、单染色体或其区段的特异探针或特异标记，为构建橡胶树单条染色体功能基因的分的特异探针或特异标记，为构建橡胶树单条染色体功能基因的分离和定位及基因组物理图谱构建提供有效工具，从而有效的应用离和定位及基因组物理图谱构建提供有效工具，从而有效的应用于橡胶树分子辅助育种
14、。于橡胶树分子辅助育种。115.研究内容研究内容5.1巴西橡胶树热研巴西橡胶树热研7-33-97单染色体分离技单染色体分离技术体系的建立。术体系的建立。主要通过借助主要通过借助显微操作仪的显微操作仪的玻璃针分离法玻璃针分离法，进行巴西橡胶树热研进行巴西橡胶树热研7-33-97部分部分单条染色体分单条染色体分离和技术体系的优化。离和技术体系的优化。125.2单条染色体体外扩增及鉴定单条染色体体外扩增及鉴定 采用采用单细胞全基因组扩增法单细胞全基因组扩增法对已分离出的对已分离出的巴 西 橡 胶 树 染 色 体 进 行 体 外 扩 增，通 过巴 西 橡 胶 树 染 色 体 进 行 体 外 扩 增，通
15、 过SouthernSouthern杂交鉴定杂交鉴定扩增产物来自巴西橡胶树基扩增产物来自巴西橡胶树基因组，经因组，经荧光原位杂交荧光原位杂交（FISH)验证验证并结合并结合核核型分析确定型分析确定染色体染色体序序号号。135.3巴西橡胶树单染色体巴西橡胶树单染色体PCR产物高通量测序及产物高通量测序及序列的功能注释序列的功能注释 对已鉴定的对已鉴定的单染色体第二轮的单染色体第二轮的PCRPCR产物产物进行进行Illumina/Solexa高通量高通量测序测序，并对，并对测序结果测序结果通过相应生通过相应生物信息学分析物信息学分析进行其功能注释。进行其功能注释。如单条染色体测得的如单条染色体测得
16、的序列片段进行编号、片段大小分析，通过序列片段进行编号、片段大小分析，通过BLASTBLAST在线进在线进行各橡胶树序列及基因库中橡胶树已知功能基因或未行各橡胶树序列及基因库中橡胶树已知功能基因或未知基因知基因序列比对序列比对，进一步，进一步明确橡胶树重要功能基因在明确橡胶树重要功能基因在橡胶树染色体组上的位置橡胶树染色体组上的位置，同时对同源染色体的序列，同时对同源染色体的序列进行比对，进而分析同源染色体之间在进行比对，进而分析同源染色体之间在DNADNA水平上可能水平上可能存在的差异等。存在的差异等。146.研究方法及技术路线研究方法及技术路线6.1实验材料实验材料 本研究的主要实验材料是
17、：本研究的主要实验材料是：黄孢原毛黄孢原毛平革菌，球红假单胞菌，平革菌，球红假单胞菌，DBTDBT。156.2研究方法研究方法n1紫外诱变n（1）首先打开紫外灯预热）首先打开紫外灯预热30min稳定光波稳定光波 取制备好的孢子悬液各取制备好的孢子悬液各6ml于于9ml的平的平板培养平皿中，放在磁力搅拌器上，边搅拌边照射控制照射距离板培养平皿中，放在磁力搅拌器上，边搅拌边照射控制照射距离30cm。辐射处理。辐射处理时间梯度为：时间梯度为：0s；20s；40s；80s；120s；160s；200s；250s。所有操作必须在红。所有操作必须在红灯下进行，照射后的菌体不可直接接到平板培养基上，必须转入
18、无菌试管中并立灯下进行，照射后的菌体不可直接接到平板培养基上，必须转入无菌试管中并立即放入无光照的冰水中即放入无光照的冰水中1-2h，防止细胞修复，影响实验效果。，防止细胞修复，影响实验效果。n（2）取上述诱变处理的菌悬液）取上述诱变处理的菌悬液0.5ml均匀涂布于平板固体培养基上，四天后观察均匀涂布于平板固体培养基上，四天后观察菌落生长状况，图片记录。将上述各自生长状况良好的菌落同上制成菌落生长状况，图片记录。将上述各自生长状况良好的菌落同上制成106/ml的孢的孢子悬液，接子悬液，接1ml菌悬液于菌悬液于50ml的发酵液中，摇床培养的发酵液中，摇床培养7天后，分别取天后，分别取10ml样品
19、装入样品装入小锥形瓶，加入各种酶提取用缓冲溶液（小锥形瓶，加入各种酶提取用缓冲溶液（LiP采用缓冲液采用缓冲液A，MnP采用缓冲液采用缓冲液B，漆酶采用漆酶采用100mmol/L的醋酸钠缓冲液，的醋酸钠缓冲液，PH5.0）振荡提取）振荡提取1h，150rpm。离心。离心（4200rpm,20min），取上清液用），取上清液用0.45um滤膜过滤，滤液用于测定酶活。滤膜过滤，滤液用于测定酶活。n2微波诱变n打开微波炉，选取中档功率，取制备好的打开微波炉，选取中档功率，取制备好的106/ml孢子悬液孢子悬液30ml及锥形瓶中，取及锥形瓶中，取1000ml大烧杯，其中加入蒸馏水适量，将锥形瓶放入，确
20、保蒸馏水液面淹没锥形大烧杯，其中加入蒸馏水适量，将锥形瓶放入，确保蒸馏水液面淹没锥形瓶中孢子悬液的液面。每照射瓶中孢子悬液的液面。每照射20S后取出锥形瓶，用移液枪取后取出锥形瓶，用移液枪取1ml于配置好的发酵于配置好的发酵液中，然后用温度测量仪检测蒸馏水的温度，当超过液中，然后用温度测量仪检测蒸馏水的温度，当超过40时必须换掉烧杯中的蒸时必须换掉烧杯中的蒸馏水，如此反复操作，直到照射时间达到馏水，如此反复操作，直到照射时间达到160S，预先设置的最大时间梯度。将处，预先设置的最大时间梯度。将处理好的发酵液放在摇床培养箱中理好的发酵液放在摇床培养箱中30,120转，培养一周，取出测其酶活性转，
21、培养一周，取出测其酶活性49-51。16研究方法研究方法n2.3.3酶活性测定方法n(1)LiP活性测定活性测定52：采用藜芦醇法，一个酶活力单位定义为：采用藜芦醇法，一个酶活力单位定义为(U)每分钟氧化藜芦醇产生每分钟氧化藜芦醇产生1mol藜芦藜芦醛所需的酶量。取醛所需的酶量。取0.6ml藜芦醇溶液（藜芦醇溶液（10mmol/L）加入）加入1.2ml缓冲液缓冲液A及及1.2ml粗酶液混匀，得反应液粗酶液混匀，得反应液3ml，向，向反应液中加入反应液中加入60LH2O2溶液（溶液（2mmol/L）启动反应，在）启动反应，在310nm下测定反应下测定反应1min吸光度值的变化。吸光度值的变化。n
22、（2）MnP活性测定活性测定53：一个酶活力单位：一个酶活力单位(U)定义为每分钟氧化定义为每分钟氧化Mn2+产生产生1molMn3+所需酶量。取所需酶量。取2.4ml含含MnSO4(1.25mmol/L)的酒石酸缓冲液的酒石酸缓冲液B加入加入0.6ml粗酶液混匀得到粗酶液混匀得到3ml反应液，加入反应液，加入60LH2O2溶液溶液（2mmol/L）启动反应在）启动反应在290nm下测定反应下测定反应1min吸光度值的变化。吸光度值的变化。n（3）Lac活性方法见文献活性方法见文献54：一个酶活力单位定义：一个酶活力单位定义(U)为为1mol的的ABTS所需的酶量，以不加启动因子的混所需的酶量
23、，以不加启动因子的混合液为空白样。以合液为空白样。以ABTS为底物在为底物在420nm下测定下测定3min内吸光度的变化。内吸光度的变化。3ml反应液包括：缓冲液反应液包括：缓冲液C，0.4ml粗粗酶液，酶液，0.6mlABTS(1.0mmol/L)55。n2.3.4降解率的测定n用紫外诱变后的平板制成用紫外诱变后的平板制成106/ml的菌悬液，分别取的菌悬液，分别取1ml于于50ml的发酵液中，置于摇床培养的发酵液中，置于摇床培养2天后分别加入天后分别加入0.4g处理过的内蒙褐煤煤样，摇床培养一周，取发酵液处理过的内蒙褐煤煤样，摇床培养一周，取发酵液3500rpm离心，将离心后的上清液加盐酸
24、，出现絮状沉淀，离心，将离心后的上清液加盐酸，出现絮状沉淀，将沉淀干燥后称重，计算降解率将沉淀干燥后称重，计算降解率56，即：，即：n=M1/M0100%(3)n式中：式中：nM0加入的每样质量加入的每样质量gn M1煤炭降解后上清液中的质量煤炭降解后上清液中的质量gn煤炭降解转化率煤炭降解转化率%n2.3.5 2-HBP测试方法nGibbs 试剂在弱碱性条件下可及酚羟基对位的活泼氢缩合成蓝色络合物，可用来检测酚羟基对位无取代基的试剂在弱碱性条件下可及酚羟基对位的活泼氢缩合成蓝色络合物，可用来检测酚羟基对位无取代基的化合物，化合物，0.2g的的2.6二氯醌亚胺溶于二氯醌亚胺溶于200ml的乙醇
25、溶液中，备用。的乙醇溶液中，备用。nGbbs试剂方法为：将菌液离心后，取上清液试剂方法为：将菌液离心后，取上清液1ml加入加入2ml的的pH9.0的缓冲液中，加入的缓冲液中，加入12滴滴20%的的Na2CO3以以保证反应体系中的保证反应体系中的pH9,最后加入最后加入60ul的的Gibbs试剂，混匀后加入试剂，混匀后加入30水浴锅振荡水浴锅振荡30min,以不加上清液的作为以不加上清液的作为对照，在对照，在610nm下测定光密度下测定光密度57。17紫外诱变白腐菌酶紫外诱变白腐菌酶酶活性检测酶活性检测褐煤降解率检测褐煤降解率检测微波诱变白腐菌微波诱变白腐菌酶活性检测酶活性检测酶活性大小对比，最
26、适诱变时间酶活性大小对比，最适诱变时间6.3 技术路线技术路线红外分析红外分析扫描电镜分析扫描电镜分析降解率对比，最适诱变时间降解率对比，最适诱变时间紫外，微波诱变效果大小对比分析紫外，微波诱变效果大小对比分析褐煤降解率检测褐煤降解率检测红外分析红外分析扫描电镜分析扫描电镜分析18技术路线技术路线紫外诱变白腐菌降解紫外诱变白腐菌降解DBT紫外诱变球红菌降解紫外诱变球红菌降解DBT2-HBP检测检测2-HBP检测检测脱硫效果对比分析脱硫效果对比分析球红假单胞菌降解球红假单胞菌降解DBT的响应面实验的响应面实验 响应面结果分析响应面结果分析197.研究成果研究成果n1）1）在紫外诱变条件下，白腐菌
27、三种降解酶的浓度及酶活性均出现了规律的变化，酶浓度变化为LiP浓度随着诱变时间的增加，呈现先增大后减小，在40-160S之间LiP生成量较大，继续增加诱变时间时。浓度下降，推测诱变时间太长，杀死了大量的菌株，从而使产酶量下降。MnP浓度开始阶段无太大变化，但是随着时间的增加出现大幅度上升，推测此诱变时间段为最适诱变时间，得到的诱变菌产酶量最大，120S酶浓度最大。Lac浓度整体呈下降趋势，诱变菌的浓度均低于对照组，由此推测对于Lac来说，紫外诱变为负突变。酶活性测试结果及酶浓度大体相同，说明酶活性及浓度有着直接的线性关系，即酶浓度基本上决定着酶活性的大小n2）在微波诱变条件下，1）随着微波诱变
28、时间的增加LiP酶活性整体上呈现先增大后下降的现象，这及紫外诱变相类似，并且酶活性均大于对照组，MnP酶的活性整体上变化幅度较小，在150S左右时酶活得到稍微提高，随着时间的增加，进而出现下降的趋势，Lac的活性基本上未出现变化。说明微波诱变对漆酶的产生没有影响。综合考虑降解酶活性的变化，微波诱变时间在150S时的酶活性最大，因此为了提高降解率，微波诱变时间应控制在120S到180。及紫外诱变相比，微波诱变时酶活性变化幅度较小，且微波诱变操作复杂。条件难以控制。误差较大，不建议使用。n3）通过两个不同浓度DBT的脱硫体系的对比发现，适当增加DBT的浓度可以提高降解数量，有利于充分利用降解体系的
29、降解作用，避免资源的浪费。从两个诱变体系，发现随着DBT浓度的增加，脱硫效率并没有呈现相应幅度的增加，推测高浓度DBT对菌种的发酵培养起到抑制的作用，因此后续的工作应该从解除抑制作用着手。微波诱变及紫外诱变对球红菌的脱硫能力仍有一定的影响，两者相比，紫外诱变的的效果较好，而微波诱变降解率基本无多大的波动，说明球红菌对于紫外诱变较敏感，而微波由于操作复杂，过程难以控制，实验误差较大，所以从本实验的结果得出，不建议使用。为解除DBT对菌种生长的抑制作用，设计了菌种的驯化实验，驯化菌的降解率均大于自然菌种，推测DBT作为诱导物起到了促进作用。n4）响应面实验筛选出了影响DBT降解的显著性因素，即pH
30、，接菌量，DBT含量，为以后含硫模型化合物的高效脱除提供了依据。n5)黄孢原毛平革菌及红球假单胞菌均有降解低阶煤的作用，但是黄孢菌的降解效果优于球红菌，而对于含硫模型化合物DBT及DBTO2的降解，球红菌的脱硫效果却明显高于黄孢菌。n6）综合两者的优缺点，使用混合菌种的实验设计，旨在先利用黄孢菌的降解作用，再进行脱硫，实验结果显示了优于球红菌单一菌种的脱硫效果。进一步完善橡胶树单染色体微分离技术体系，为功能基因的发现、分离及转化奠定基础。208.展望展望n1）为了克服木质素降解菌在煤炭降解体系中生长繁殖受限制的问题，采用原生质体融合技术，如利用黄孢原毛平革菌及哈慈木霉融合，不仅可以利用黄孢原毛
31、平革菌作为模式菌种的优势，又可以利用哈慈木霉适应性强、生长繁殖快的特点。n（2）为了提高酶产量，可以通过从高产酶的降解菌种中克隆出产酶基因，然后导入一些耐受性较强的菌种中，也可以利用DNA改组技术，定向改变菌种一些特性。n（3）要实现煤炭生物降解的工业化生产还必须解决生物降解底物的抑制问题，因此生物降解过程必须脱离活菌，这就要求我们在熟练掌握生物降解机理的同时，模拟其降解转化过程，研制出生物降解转化催化剂。n（4）此外我们也可以应用定向进化技术和快速比色筛选法获得突变基因，这些突变基因所编码的酶对一些底物有更好的稳定性以及更高的降解活性。n（5）为了提高降解效率和优化脱硫效率，以后的研究可以考
32、虑从混合菌种着手，充分利用各个菌种的优势，达到理想效果。n6)从本研究内容发现，无论是低阶煤的降解还是模型化合物的脱硫均存在底物抑制，因此可以此为出发点寻找高效诱导物，进行菌种驯化，提高实验效果。219.拟解决的拟解决的关键性问题关键性问题 本项目的关键性问题之一是本项目的关键性问题之一是制备高质量橡胶染色体制备高质量橡胶染色体标本标本并从并从中期分裂中期分裂相中相中分离出分离出无污染的无污染的单条染色体单条染色体。在国内外有关高通量测序和基因注释方面的文献大多在国内外有关高通量测序和基因注释方面的文献大多是及全基因组和转录组相关，对于整条染色体进行测是及全基因组和转录组相关，对于整条染色体进
33、行测序分析和基因注释的，报道较少，因此对橡胶树单条序分析和基因注释的，报道较少，因此对橡胶树单条染色体测序后如何对测序结果进行基因注释是本实验染色体测序后如何对测序结果进行基因注释是本实验要解决的另一个关键性问题。要解决的另一个关键性问题。2210.研究基础和条件研究基础和条件n课题组主要成员长期从事作物遗传育种教学及研究工作，具有丰课题组主要成员长期从事作物遗传育种教学及研究工作，具有丰富的理论基础和实践经验，已研究了木薯染色体核型和带型，甘富的理论基础和实践经验，已研究了木薯染色体核型和带型，甘蔗基因组荧光原位杂交研究，正在开展橡胶树基因的原位蔗基因组荧光原位杂交研究，正在开展橡胶树基因的
34、原位PCRPCR研研究以及木薯基因的原位究以及木薯基因的原位PCRPCR研究。研究。n在植物单染色体方面本课题组成员已经开始对具有中、小染色体在植物单染色体方面本课题组成员已经开始对具有中、小染色体的巴西橡胶树热研的巴西橡胶树热研7-33-977-33-97进行了适合于分离其单染色体的染色进行了适合于分离其单染色体的染色体制片及单染色体的分离实验技术体系的摸索，并取得了一定的体制片及单染色体的分离实验技术体系的摸索，并取得了一定的进展。因此进展。因此具有坚实的工作基础和充分的技术储备具有坚实的工作基础和充分的技术储备，实现项目研，实现项目研究目标是有充分保证的。究目标是有充分保证的。n同时本实
35、验室本项目组所在的作物遗传育种学科是海南省、农业同时本实验室本项目组所在的作物遗传育种学科是海南省、农业部和教育部（国家级）重点学科，实验仪器齐全，试验条件良好。部和教育部（国家级）重点学科，实验仪器齐全，试验条件良好。开展本项目研究所需的仪器设备都已具备开展本项目研究所需的仪器设备都已具备。2311.研究进度及经费预算研究进度及经费预算11.1年度年度研究进度研究进度安排安排2014年年7月月2014年年10月：染色体标本制备；橡胶树单染色体分离技月：染色体标本制备；橡胶树单染色体分离技术体系的优化；尝试分离部分巴西橡胶树热研术体系的优化；尝试分离部分巴西橡胶树热研7-33-97单染色体。单
36、染色体。2014年年11月月2015年年7月：橡胶树基因组月：橡胶树基因组DNA的提取；单染色体的提取；单染色体DNA体外扩增，并对产物进行体外扩增，并对产物进行southern杂交检测；通过荧光定位及核杂交检测；通过荧光定位及核型分析确定染色体型分析确定染色体序号序号2015年年8月月2015年年12月：对分离出的单染色体进行测序，分析染色月：对分离出的单染色体进行测序，分析染色体测序拼接片段的大体测序拼接片段的大小，小，通过通过BLAST在线进行测序序列进行同源在线进行测序序列进行同源比对，确定序列为已知功能基因或未知功能基因，从而对染色体比对，确定序列为已知功能基因或未知功能基因，从而对染色体测序序列进行基因注释，进一步明确已知的重要功能基因在染色测序序列进行基因注释，进一步明确已知的重要功能基因在染色体组上的位置，初步对现有的橡胶树连锁群进行归类等。体组上的位置，初步对现有的橡胶树连锁群进行归类等。2016年年1月月-2016年年3月：总结、撰写硕士论文，准备论文答辩月：总结、撰写硕士论文，准备论文答辩。2411.2经费预算（单位：万元）经费预算（单位：万元）印刷费 0.5万元（发表论文版面费，学位论文出版）专用材料费 6.5万元（单条染色体测序、各种专用试剂盒、生化试剂及常规药品、耗材等）总计：7万元25n请各位老师专家指正！请各位老师专家指正！谢谢谢谢 ！26
