1、基因治疗医学知识培基因治疗医学知识培训训1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫（C.elegans）中的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本是利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA（sense RNA）以期观察到基因表达的增强。但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反的。该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。直到1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学医学院的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦
2、的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference,简称RNAi)。在随后的短短一年中，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的早期阶段。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐
3、步阐明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具，RNAi也越来越为人们所重视。基因治疗医学知识培训22000年，RNA的研究进展被美国科学杂志评为重大科技突破；2001年“RNA干扰”作为当年最重要的科学研究成果之一，再次入选“十大科技突破”；2002年12月20日，Science杂志将“Small RNA&RNAi”评为2002年度最耀眼的明星。同时，Nature杂志亦将Small RNA评为年度重大科技成功之一。2003年，小核糖核酸的研究第四次入选“十大科技突破”，排在第四位。RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20年来，可与HGP（人类基因组计划，生物通网站注）相提并论的最重大成
4、果之一。基因治疗医学知识培训3三、基因干预三、基因干预 Gene Interference基因治疗医学知识培训4基因干预的种类：基因干预的种类：1.1.反义反义RNA(antisense RNA)RNA(antisense RNA)2.2.干扰干扰RNA(RNA interference)RNA(RNA interference)3.3.核酶核酶 (ribozyme)基因治疗医学知识培训5反义RNA:与靶核酸（如mRNA或有义DNA）链互补的RNA分子，可抑制核酸的功能反义RNA，根据反义RNA的作用机制可将其分为3类：类反义RNA直接作用于靶mRNA的S D序列和(或)部分编码区，直接抑制翻
5、译，或与靶mRNA结合形成双链RNA，从而易被RNA酶 降解；类反义RNA与mRNA的非编码区结合，引起mRNA构象变化，抑制翻译；类反义RNA则直接抑制靶mRNA的转录。基因治疗医学知识培训6 （一）反义（一）反义RNARNA 1.1.反义反义RNARNA与基因表达调控与基因表达调控 利用反义利用反义RNARNA对体外培养的细胞进行基因对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：表达调控，通常采用的方法有两种：（1 1）体外合成反义）体外合成反义RNARNA，直接作用于培养，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞，细胞吸收RNARNA后，发挥作用。后，发挥作用。（2 2）构建能转录反义
6、）构建能转录反义RNARNA的重组质粒，将的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义质粒转入细胞，转录出反义RNARNA而发挥作用。而发挥作用。基因治疗医学知识培训7 反义反义RNARNA的关键技术问题：的关键技术问题：反义反义RNARNA进入靶细胞前的降解问题进入靶细胞前的降解问题 专一性转移问题：专一性转移问题：基因治疗医学知识培训82.2.受体介导反义受体介导反义RNARNA技转移术技转移术 受体介导的受体介导的RNARNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高；被转移的被转移的RNARNA是被保护的，与周围环境之间存是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层在多聚赖氨酸的
7、保护层,可以抵抗环境中的可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。核酸酶的降解作用。将将脱唾液酸血清类粘蛋白脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGPASGP）与多聚赖氨酸（）与多聚赖氨酸（PLPL）共价连接，得到共价连接，得到ASGP-PLASGP-PL复合物，成为运载核酸的工具。复合物，成为运载核酸的工具。ASGP-PLASGP-PL反义反义RNARNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGPASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNARNA进入肝细胞后，进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。可被逐渐释放出来发挥作用。借助受体介导借助受体
8、介导DNADNA转移方法把转移方法把DNADNA换成反义换成反义RNARNA，就，就可以实现受体介导的反义可以实现受体介导的反义RNARNA的转移。的转移。基因治疗医学知识培训9 3.3.反义反义RNARNA的应用前景的应用前景 受体介导的反义受体介导的反义RNARNA基因治疗有其自身的优点，而在基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。一定程度上补充了转基因治疗的不足。（l l）安全性高）安全性高 （2 2）反义）反义RNARNA设计和制备方便设计和制备方便 （3 3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒 反
9、义反义RNARNA只作用于特异的只作用于特异的mRNAmRNA分子，不分子，不改变所调节基因的结构。反义改变所调节基因的结构。反义RNARNA分子无论怎分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣残渣”。在治疗在治疗RNARNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNARNA基基因治疗比一般的因治疗比一般的DNADNA基因治疗有更大的优势。利用反义基因治疗有更大的优势。利用反义RNARNA可以直接作用于病毒可以直接作用于病毒RNARNA，阻断，阻断RNARNA病毒的繁殖。病毒的繁殖。基因治疗医学知识培训10（二）干扰（二）
10、干扰RNARNA 实验结果显示，有义链实验结果显示，有义链RNARNA（sense RNAsense RNA）或反义链）或反义链RNARNA（antisense RNAantisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链）均能抑制线虫基因的表达，双链RNARNA比单链比单链RNARNA更为有效。将特异的双链更为有效。将特异的双链RNARNA注入线虫体内注入线虫体内可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链RNARNA和反义链和反义链RNARNA都同样阻断基因表达途径。这与传统上都同样阻断基因表达途径。这与传统上对反义对反义RNARNA技
11、术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义效率比反义RNARNA至少高至少高2 2个数量级。个数量级。1.RNA1.RNA干扰现象干扰现象 RNA RNA干扰干扰（RNA interferenceRNA interference，RNAi RNAi）是一种由双链是一种由双链RNARNA诱诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNARNA有同源序列的有同源序列的信使信使RNARNA（mRNAmRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。）被降解，从而抑制该基因的表达。对对RNARNA干扰的认识来源于用线虫（干扰的认识来源
12、于用线虫（C.elegansC.elegans）和果）和果蝇所进行的实验。蝇所进行的实验。http:/ 2.RNA2.RNA干扰的机制干扰的机制 RNARNA干扰过程主要有干扰过程主要有2 2个步骤：个步骤：（1 1）小干扰性）小干扰性RNARNA（siRNAsiRNA）（2 2）siRNAsiRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为体，称为RNARNA诱导的沉默复合体（诱导的沉默复合体（RNA-induced RNA-induced silencing complex,RISC)silencing complex,RISC)。该复合体可识别与该复合体可识
13、别与siRNAsiRNA有同源序列的有同源序列的mRNAmRNA，并在特异的位点将该，并在特异的位点将该mRNAmRNA切断。切断。长双链长双链RNARNA被细胞内的双链被细胞内的双链RNARNA特异性核特异性核酸酶酸酶DicerDicer切成切成21-2321-23个碱基对的短双链个碱基对的短双链RNARNA，称为小干扰性，称为小干扰性RNARNA（small small interfering RNAinterfering RNA，siRNAsiRNA）。）。基因治疗医学知识培训12A.贾第鞭毛虫Dicer的晶体结构；RNA干扰机制示意图 基因治疗医学知识培训13 1.1.体外化学合成体外
14、化学合成;2.2.用质粒载体或病毒载体可在细胞用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。内稳定地生成。siRNAsiRNA的产生的产生基因治疗医学知识培训143.RNA3.RNA干扰的应用前景干扰的应用前景 RNA RNA干扰研究目前已经在功能基因组干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。的前景。基因治疗医学知识培训15（1 1）研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具 由于由于 RN
15、A RNA干扰技术具有高度的序列专一性干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。有力的研究工具。RNARNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因产生类似基因敲除的效应敲除的效应。基因治疗医学知识培训16 （2 2）肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗 传统反义传统反
16、义RNARNA技术诱发的单一癌基因的阻断，不可技术诱发的单一癌基因的阻断，不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而RNARNA干扰技术可以利干扰技术可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性序列这一特性，设计针对这一区段序列的双链，设计针对这一区段序列的双链RNARNA分子，分子，只使用一种双链只使用一种双链RNARNA即可以产生多个基因同时剔除的表即可以产生多个基因同时剔除的表型，也可以同时使用多种双链型，也可以同时使用多种双链RNARNA而将多个序列不相关而将多个序列不相关的基因同时剔除。的基因
17、同时剔除。RNARNA干扰技术可用于治疗有异常基因干扰技术可用于治疗有异常基因表达的恶性肿瘤。表达的恶性肿瘤。K-RAS K-RAS蛋白为肿瘤发生所必需，蛋白为肿瘤发生所必需，bcr/ab1bcr/ab1融合基因与人融合基因与人白血病有关，用白血病有关，用RNARNA干扰技术可以阻碍干扰技术可以阻碍K-RASK-RAS蛋白的表达从蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1bcr/ab1的人白血病细胞系。的人白血病细胞系。通过通过RNARNA干扰抑制某些内源性基因的表达，能促进白干扰抑制某些内源性基因的表达，能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。
18、血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。应用应用RNARNA干扰技术成功地阻断了干扰技术成功地阻断了MCF-7MCF-7乳腺癌细胞中一乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1Sp1的功能。的功能。“沉默”真的是金 基因治疗医学知识培训17 （3 3）病毒性疾病的基因治疗病毒性疾病的基因治疗 RNARNA干扰可以被看成是一种与免疫系统类干扰可以被看成是一种与免疫系统类似的防御机制。用似的防御机制。用siRNAsiRNA抑制人类免疫缺陷病抑制人类免疫缺陷病毒（毒（HIVHIV）某些基因的表达，如）某些基因的表达，如P2
19、4P24、VifVif、nefnef、tattat或或revrev，阻碍阻碍HIVHIV在细胞内复制在细胞内复制。用。用RNARNA干扰干扰技术抑制技术抑制HIVHIV的受体（的受体（CD4CD4）或辅助受体）或辅助受体（CXCR4CXCR4或或CCR5CCR5）在细胞内表达，可）在细胞内表达，可阻碍阻碍HIVHIV感感染细胞染细胞。也可通过。也可通过RNARNA干扰抑制其他病毒在细干扰抑制其他病毒在细胞内复制，如脊髓灰质炎病毒、人乳头状瘤病胞内复制，如脊髓灰质炎病毒、人乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。“沉默”真的是金 基因治疗医学知识培训18 s
20、iRNAsiRNA在病毒感染的在病毒感染的早期阶段早期阶段能有效地抑制病毒的复制能有效地抑制病毒的复制，病毒感，病毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基染能被针对病毒基因和相关宿主基因的因的siRNAsiRNA所阻断，所阻断，RNARNA干扰技术将干扰技术将成为一种有效的抗病毒治疗手段。成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的病毒性疾病的防这对于许多严重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意义。治具有十分重大的意义。基因治疗医学知识培训19siRNA的输送（siRNA delivery)基因治疗医学知识培训20siRNA的输送（siRNA delivery)基因治疗医学知识培训21T.Cech
21、S.Altman 1989年，核酶的发现者T.Cech和S.Altman被授予 诺贝尔化学奖。（三）核酶三）核酶(ribozyme)核酶（ribozyme）是具有催化功能的RNA分子 基因治疗医学知识培训22（三）核酶（三）核酶(ribozyme)天然核酶多为单一的天然核酶多为单一的RNARNA分子，具有自我剪切作分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由两个用。但核酶也可以由两个RNARNA分子组成。分子组成。在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNARNA分子中分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNARNA分子切断，分子
22、切断，通过破坏靶通过破坏靶RNARNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNARNA）的目的。）的目的。只要两个只要两个RNARNA分子通过互补序列相结合，形成锤头分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（状的二级结构（3 3个螺旋区），并能组成核酶的核心序个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（列（1313个或个或1111个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。产生剪切反应。基因治疗医学知识培训23 1.核酶的设计核酶的设计 核酶是通过靶核酶是通过靶RNARNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构分子与核酶分子共同组
23、成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。（1 1）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2 2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。域），两端是引导序列。在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成
24、特定的核酶。设计的基本原则是特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。基因治疗医学知识培训24核酶的作用机制 基因治疗医学知识培训25 2.2.核酶的应用核酶的应用 与一般的反义与一般的反义RNARNA相比，核酶具有较稳相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到定的空间结构，不易受到RNARNA酶的攻击。更酶的攻击。更重要的是，核酶在切断重要的是，核酶在切断mRNAmRNA后，又可从杂后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNAmRNA分子。分子。基因治疗医学知识
25、培训26四、治疗基因的受控表达四、治疗基因的受控表达 Regulated Expression of Therapeutic Gene基因治疗医学知识培训27 时间时间:要实现治疗基因的受控表达，必须建立完善的基因表要实现治疗基因的受控表达，必须建立完善的基因表达调控体系。基因调控策略大致有以下几种：基因内部调达调控体系。基因调控策略大致有以下几种：基因内部调节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因节机制、基因外部调节机制、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。特异性表达以及治疗基因的诱导表达等。治疗基因的受控表达包括控制治疗基因表达的治疗基因的受控表达包括控制
26、治疗基因表达的时时间、空间和水平间、空间和水平三个方面。三个方面。空间空间:表达水平：表达水平：希望治疗基因能在一个适当的水平表达。希望治疗基因能在一个适当的水平表达。1.1.控制治疗的基因在患者需要实施治疗时才表控制治疗的基因在患者需要实施治疗时才表达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态；达，而平时不需要进行治疗时则处于关闭状态；2.2.根据不同疾病的治疗要求，控制治疗基因持根据不同疾病的治疗要求，控制治疗基因持续表达的时间跨度。续表达的时间跨度。是指为了提高基因治疗的专一性和安全性，严格是指为了提高基因治疗的专一性和安全性，严格限制治疗基因只在靶细胞中表达，避免治疗基因限制治疗基因只在靶
27、细胞中表达，避免治疗基因指导合成的蛋白质干扰非靶细胞的正常生活，产指导合成的蛋白质干扰非靶细胞的正常生活，产生毒副作用。生毒副作用。基因治疗医学知识培训28（一）基因内部的调节机制（一）基因内部的调节机制 使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件 使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件基因治疗医学知识培训29 1.1.使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件 例如，酪氨酸酶是皮肤细胞和黑色素瘤细胞产生色素途径例如，酪氨酸酶是皮肤细胞和黑色素瘤细胞产生色素途径中的
28、一种酶，可利用其启动子驱动治疗基因只在黑色中的一种酶，可利用其启动子驱动治疗基因只在黑色素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。不同类型的正常细胞或组织中往往存在某些特有的不同类型的正常细胞或组织中往往存在某些特有的蛋白质，它们的基因表达调控元件可用于驱动治疗基因蛋白质，它们的基因表达调控元件可用于驱动治疗基因的特异性表达，从而起到治疗作用。的特异性表达，从而起到治疗作用。前列腺特异性抗原前列腺特异性抗原(PSA)(PSA)是参与精液凝块中蛋白质是参与精液凝块中蛋白质降解、使精液液化的一种丝氨酸蛋白酶。它主要在前降解、使精液液化的一种丝氨酸蛋白酶
29、。它主要在前列腺中产生，而在前列腺癌细胞中含量很高，可以利列腺中产生，而在前列腺癌细胞中含量很高，可以利用用PSAPSA基因调控元件驱动治疗基因在基因调控元件驱动治疗基因在PSAPSA阳性的前列腺阳性的前列腺癌细胞中表达而发挥作用，而其在癌细胞中表达而发挥作用，而其在PSAPSA阴性细胞和非前阴性细胞和非前列腺癌细胞中不能使治疗基因表达。列腺癌细胞中不能使治疗基因表达。基因治疗医学知识培训30 2.2.使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件 某些病变的细胞或组织产生一些特殊的蛋白质，其基某些病变的细胞或组织产生一些特殊的蛋白质，其基因表达调节元件也
30、可以用来控制治疗基因的特异性表达。因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。甲胎蛋白甲胎蛋白(AFP)(AFP)基因正常情况下只在胚胎肝细胞中表达，基因正常情况下只在胚胎肝细胞中表达，不在成年肝脏细胞中表达。肝细胞腺癌细胞中不在成年肝脏细胞中表达。肝细胞腺癌细胞中AFPAFP基因异常基因异常激活，因此可利用该基因启动子驱动治疗基因激活，因此可利用该基因启动子驱动治疗基因(如自杀基因如自杀基因)在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。癌胚抗原癌胚抗原(CEA)(CEA)是膜糖蛋白家族的成员，在许多腺癌细是膜糖蛋白家族的成员，在许多腺癌细胞中表达很高
31、，采用其启动子可以使治疗基因只在胞中表达很高，采用其启动子可以使治疗基因只在CEACEA阳性阳性的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达。的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达。基因治疗医学知识培训31（二）基因外部的调节机制（二）基因外部的调节机制 除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。刺激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，可以通过对病灶局部进行热处理，达到使治疗基因特异性可以通过对病灶局部进行热处理
32、，达到使治疗基因特异性表达的目的。表达的目的。Egr-1 Egr-1基因是一种编码锌指转录因子的早期基因，包括基因是一种编码锌指转录因子的早期基因，包括电离辐射和细胞因子等在内的多种外部刺激都可以诱导其表电离辐射和细胞因子等在内的多种外部刺激都可以诱导其表达，将其调控序列启动的治疗基因达，将其调控序列启动的治疗基因(如肿瘤坏死因子基因如肿瘤坏死因子基因)导导入肿瘤组织，可在电离辐射等作用下，使治疗基因获得暂时入肿瘤组织，可在电离辐射等作用下，使治疗基因获得暂时性的局部表达，杀死肿瘤细胞。性的局部表达，杀死肿瘤细胞。组织纤溶酶原激活物组织纤溶酶原激活物(t-PA)(t-PA)作为溶解血栓的药剂，
33、在中作为溶解血栓的药剂，在中风和心肌梗死等疾病治疗中起着重要的作用。风和心肌梗死等疾病治疗中起着重要的作用。t-PAt-PA的活性在的活性在辐射后增加辐射后增加5050倍，表明其基因表达调控元件中存在受辐射诱倍，表明其基因表达调控元件中存在受辐射诱导的调控元件，故可利用其调控元件启动治疗基因的表达，导的调控元件，故可利用其调控元件启动治疗基因的表达，增强放疗效果。增强放疗效果。基因治疗医学知识培训32（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达 病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。些变化控
34、制治疗基因的表达。例如，例如，在肿瘤病灶处在肿瘤病灶处，常常出现葡萄糖缺乏等，常常出现葡萄糖缺乏等情况，葡萄糖调节蛋白情况，葡萄糖调节蛋白GRP78/BipGRP78/Bip的含量也随之增的含量也随之增加，使癌细胞能够抵御应激。当采用这种基因的启加，使癌细胞能够抵御应激。当采用这种基因的启动子来控制治疗基因时，可以使治疗基因在肿瘤细动子来控制治疗基因时，可以使治疗基因在肿瘤细胞中表达，使肿瘤组织坏死。胞中表达，使肿瘤组织坏死。肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供血肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供血不足，因此在肿瘤内部形成酸性、缺氧和营养缺乏的区域。不足，因此在肿瘤内部形
35、成酸性、缺氧和营养缺乏的区域。缺氧条件可以通过缺氧诱导因子缺氧条件可以通过缺氧诱导因子(HIF-1)(HIF-1)和缺氧响应元件和缺氧响应元件(HRE)(HRE)相互作用，调节一些基因的表达；如果采用缺氧响应元件相互作用，调节一些基因的表达；如果采用缺氧响应元件(HRE)(HRE)来控制治疗基因的表达，即可实现治疗基因只在缺氧的来控制治疗基因的表达，即可实现治疗基因只在缺氧的肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达。肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达。机体发炎时机体发炎时所可产生的许多急性期蛋白，其基所可产生的许多急性期蛋白，其基因的启动子可以控制发炎条件下治疗基因的表达；因的启动子可以控制发炎
36、条件下治疗基因的表达；而一旦炎症消失，治疗基因的表达也随之终止。而一旦炎症消失，治疗基因的表达也随之终止。基因治疗医学知识培训33（四）治疗基因的诱导表达（四）治疗基因的诱导表达 采用组织特异性启动子控制治疗基因的表达，采用组织特异性启动子控制治疗基因的表达，可能造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界可能造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界控制。为了避免这种情况发生，研究人员正在开控制。为了避免这种情况发生，研究人员正在开发和完善一些发和完善一些可诱导性基因表达系统可诱导性基因表达系统。这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，这种系统的必要成分：一种是转录激活剂，它只在诱导药物存在时才能与它只
37、在诱导药物存在时才能与DNADNA结合；另一种结合；另一种则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激则是特异性基因表达调控元件，仅对这种转录激活剂有所响应。活剂有所响应。基因治疗医学知识培训34四环素抗性操纵子系统四环素抗性操纵子系统原理原理 四环素抗性基因的转录受四环素抗性基因的转录受TetTet阻遏蛋白的负调控。阻遏蛋白的负调控。无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达；合阻断四环素抗性基因的表达；四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四
38、环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。抗性基因的转录得以进行。基因治疗医学知识培训35五、基因治疗的应用研究五、基因治疗的应用研究The Application of Gene Therapy基因治疗医学知识培训36 世界上第一个正式被批准用于基因世界上第一个正式被批准用于基因治疗的病例是先天性腺苷脱氨酶（治疗的病例是先天性腺苷脱氨酶（ADAADA）缺乏症。缺乏症。19901990年年9 9月美国月美国BlaeseBlaese博士成功博士成功地将正常的人的地将正常的人的ADAADA基因植入基因植入ADAADA缺乏症缺乏症病人的淋
39、巴结内，完成世界上首例基因病人的淋巴结内，完成世界上首例基因治疗试验。治疗试验。基因治疗医学知识培训37（一）遗传病的基因治疗研究（一）遗传病的基因治疗研究 已知人类有已知人类有40004000多种遗传病，在人群中的发病率多种遗传病，在人群中的发病率约为约为40405050。但真正了解病因，能进行产前诊断。但真正了解病因，能进行产前诊断的仅限于那些为数不多的常见遗传病。的仅限于那些为数不多的常见遗传病。1.1.在在DNADNA水平明确其发病原因及机制；水平明确其发病原因及机制；2.2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.3.该基因的表达不需要精确调控；该
40、基因的表达不需要精确调控；4.4.该基因能在一种便于临床操作的组织细胞该基因能在一种便于临床操作的组织细胞(如皮肤细胞，如皮肤细胞，骨髓细胞等骨髓细胞等)中表达并发挥其生理作用；中表达并发挥其生理作用；5.5.该遗传病不经治疗将有严重后果该遗传病不经治疗将有严重后果(如不治疗难以存活等如不治疗难以存活等)。可供选择并符合上述可供选择并符合上述4 4条以上要求的不过只有条以上要求的不过只有3030余种遗传余种遗传病。病。遗传病基因治疗必须符合以下要求：遗传病基因治疗必须符合以下要求：基因治疗医学知识培训381 1腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 (PN
41、P)(PNP)缺乏症缺乏症 2 2珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 3 3血友病和其他血浆蛋白缺乏症血友病和其他血浆蛋白缺乏症 4 4苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 5 5莱莱-纳纳(Lesch-Nyhan)(Lesch-Nyhan)综合征综合征 6 6家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 7 7囊性纤维化病囊性纤维化病 基因治疗医学知识培训39（二）恶性肿瘤基因治疗研究（二）恶性肿瘤基因治疗研究 （1 1）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑）通过基因置换和基因补充，导入多种抑癌基因以抑制癌症的发生、发展和转移；制
42、癌症的发生、发展和转移；肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变肿瘤发生是一个极为复杂的过程，许多基因的突变会导致肿瘤的发生。会导致肿瘤的发生。（2 2）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，）抑制癌基因的活性，通过干扰癌基因的转录和翻译，发挥抑癌作用；发挥抑癌作用；（3 3）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细）增强肿瘤细胞的免疫原性，通过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和胞因子修饰，刺激免疫系统产生对肿瘤细胞的溶解和排斥反应；排斥反应；（4 4）通过导入）通过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞。杀伤癌细胞。基因治疗医学知识培训40 1.1.肿
43、瘤基因治疗的基本策略肿瘤基因治疗的基本策略 从实际应用于临床治疗的角度来看，肿瘤基从实际应用于临床治疗的角度来看，肿瘤基因治疗的策略包括：因治疗的策略包括：(1)(1)直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长。直接杀伤肿瘤细胞或抑制其生长。(2)(2)增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿增强机体免疫系统，间接杀伤或抑制肿瘤细胞。瘤细胞。(3)(3)改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效。改善肿瘤常规治疗方法，提高疗效。基因治疗医学知识培训41 2.2.肿瘤基因治疗的常用方法肿瘤基因治疗的常用方法 基因干预技术：通过基因干预，使得肿瘤细胞过基因干预技术：通过基因干预，使得肿瘤细胞过度表达的癌基因得到抑制，从而降低其恶
44、性表型。度表达的癌基因得到抑制，从而降低其恶性表型。自杀基因治疗自杀基因治疗分子化疗：直接杀死分子化疗：直接杀死肿瘤细胞肿瘤细胞。肿瘤的免疫基因治疗：以激发机体肿瘤免疫效应肿瘤的免疫基因治疗：以激发机体肿瘤免疫效应或提高免疫效应细胞功能。或提高免疫效应细胞功能。提高化疗效果的辅助基因治疗：提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。耐药基因治疗。基因治疗医学知识培训42 3.3.自杀基因治疗：自杀基因治疗是目前自杀基因治疗：自杀基因治疗是目前肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。肿瘤基因治疗领域中的研究热点之一。基本原理：基本原理：向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不
45、存在向肿瘤细胞内导入某些真核细胞中不存在的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可的酶基因（自杀基因），这些基因表达的特异性酶可以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具以催化对真核细胞无毒或低毒的药物前体，转变为具有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将有抑制核酸合成效应的抗代谢药物，进而选择性地将转染了该基因的肿瘤细胞转染了该基因的肿瘤细胞“自杀自杀”。这些基因也相应。这些基因也相应地被称为地被称为“自杀基因自杀基因”。基因治疗医学知识培训43 自杀基因治疗的前提条件是自杀基因治疗的前提条件是“自杀基因自杀基因”的的表达必须局限于肿瘤细胞中，而不伤及正常细胞。表达必须局限于肿
46、瘤细胞中，而不伤及正常细胞。利用免疫脂质体、受体介导等技术利用免疫脂质体、受体介导等技术进行定向基因转移。进行定向基因转移。利用病毒载体进行基因转移。利用病毒载体进行基因转移。肿瘤特异性基因转录。肿瘤特异性基因转录。肿瘤内直接注射。肿瘤内直接注射。自杀基因转移常用方自杀基因转移常用方法法基因治疗医学知识培训445.5.提高化疗效果的辅助基因治疗：提高化疗效果的辅助基因治疗：临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两临床上对肿瘤患者进行化疗时，通常面临两大难题：大难题：（1 1）是患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感）是患者机体内的肿瘤细胞对化疗药物的敏感程度存在差异，特别是某些经过多次化疗的患者，
47、程度存在差异，特别是某些经过多次化疗的患者，其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多其体内的肿瘤细胞已经产生了多药耐药性，对多种化疗药物产生交差耐受，最终导致化疗失败。种化疗药物产生交差耐受，最终导致化疗失败。（2 2）是大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，）是大剂量的化疗可能导致患者的正常细胞，特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。特别是骨髓造血细胞的功能受到抑制。基因治疗医学知识培训46 (1)(1)药物增敏基因治疗：药物增敏基因治疗：将鸡钙调素（将鸡钙调素（calmodulin,CaMcalmodulin,CaM）基因导入小鼠乳）基因导入小鼠乳腺癌细胞株腺癌细胞株C127C127，结果仅需
48、低剂量的长春新碱或长春，结果仅需低剂量的长春新碱或长春花碱即可明显抑制该细胞株的生长。对其作用原理进花碱即可明显抑制该细胞株的生长。对其作用原理进行研究后发现，行研究后发现，CaMCaM基因的表达产物作为细胞内信号传基因的表达产物作为细胞内信号传导系统的重要物质，明显增加了肿瘤细胞对长春新碱导系统的重要物质，明显增加了肿瘤细胞对长春新碱或长春花碱的吸收量而相应减少了排出量，从而提高或长春花碱的吸收量而相应减少了排出量，从而提高了肿瘤细胞内化疗药物浓度，导致肿瘤细胞死亡。了肿瘤细胞内化疗药物浓度，导致肿瘤细胞死亡。为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细胞，可为了使化疗药物能够最大程度地杀死肿瘤细
49、胞，可以考虑将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化以考虑将某些药物增敏基因导入肿瘤细胞，特别是对化疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏疗药物原本不敏感的肿瘤细胞，使其对抗肿瘤药物的敏感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。感性大大增加，从而达到增强化疗效果的目的。基因治疗医学知识培训47 (2)(2)耐药基因治疗：耐药基因治疗：在解决化疗所致骨髓细胞造血功能受到严重抑制的在解决化疗所致骨髓细胞造血功能受到严重抑制的问题方面，通过向肿瘤患者的骨髓细胞导入某种耐药基问题方面，通过向肿瘤患者的骨髓细胞导入某种耐药基因，如因，如mdr-1mdr-1基因等，以增强骨髓细胞的抗药性，以便
50、耐基因等，以增强骨髓细胞的抗药性，以便耐受大剂量的化疗药物，以达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。受大剂量的化疗药物，以达到彻底杀灭肿瘤细胞的目的。肿瘤细胞耐药性的产生与多种糖蛋白或酶有关，包肿瘤细胞耐药性的产生与多种糖蛋白或酶有关，包括多药耐药（括多药耐药（mdr-1mdr-1）基因编码的）基因编码的P-P-糖蛋白、多药耐药相糖蛋白、多药耐药相关蛋白（关蛋白（MRPMRP）以及近年来发现的肺耐药相关蛋白等；还）以及近年来发现的肺耐药相关蛋白等；还有细胞内氧化和解毒作用的酶系统，包括细胞色素有细胞内氧化和解毒作用的酶系统，包括细胞色素P-450P-450（cytochrome P-450cytochr
