1、工作流程实验实验理论知识讲解理论知识讲解仪器使用说明书仪器使用说明书安全注意事项安全注意事项Company Logo工作流程提提交交报报告告Company Logo 当环境受到污染后，环境的当环境受到污染后，环境的 物理性质物理性质 化学性质化学性质 生物学特性生物学特性 如：如：v重金属离子、重金属离子、NO3-浓度增加；浓度增加；v水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝；水体污染变质，水生生物种类减少，甚至灭绝；发生变化发生变化理论知识Company Logo如何监测？如何监测？v化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，化学方法：快速、定性定量反映污染物浓度，但为瞬时值；但为瞬时值；v生
2、物学方法：利用生物种类、数量的变化，生生物学方法：利用生物种类、数量的变化，生物学特性的改变来监测污染物对环境的影响。物学特性的改变来监测污染物对环境的影响。v可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精可监测到污染物对环境的综合影响，但不易精确反映污染物的性质、浓度和数量。确反映污染物的性质、浓度和数量。Company Logo生活饮用水卫生标准生活饮用水卫生标准v2006年12月29日，卫生部、国家标准化委员会发布2006年第12号文件，批准发布生活饮用水卫生标准及检测方法国家标准。标准自2007年7月1日起实施，其中生活饮用水卫生标准中非常规指标的实施项目和日期由省级人民政府根据当地实际情况
3、确定。v全部指标最迟于2012年7月1日实施。Company Logo饮用水中微生物指标饮用水中微生物指标项目单位限值说明总大肠菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得检出一般性污染耐热大肠菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得检出指示粪便污染大肠埃希氏菌MPN/100mL或CFU/100mL不得检出指示粪便污染菌落总数CFU/mL100一般性污染贾第鞭毛虫个/10 L1肠道原虫隐孢子虫个/10 L1肠道原虫Company Logo新国标常规项目限值变化新国标常规项目限值变化原国标新国标砷0.05 mg/L0.01 mg/L镉0.01 mg/L0.005 mg/L铅0.05 mg
4、/L0.01 mg/L硝酸盐（以N计）20 mg/L10 mg/L浊度3度1NTUCompany Logo 检品检品 胆盐乳糖发酵管胆盐乳糖发酵管 伊红美兰平板伊红美兰平板 大肠杆菌菌落纯培养大肠杆菌菌落纯培养 乳糖复发酵管（乳糖复发酵管（-）乳糖复发酵管（乳糖复发酵管（）大肠菌群的检测流程大肠菌群的检测流程Company Logo总大肠菌群总大肠菌群v当饮用水受到粪便等污染，就有可能带有沙门氏菌、志贺氏菌、弧菌、肠道病毒等，且它们均可以水为媒介引起肠道传染病。v总大肠菌群含量可表明水体被污染的程度，并且间接地表明肠道病菌存在的可能，以及对人体健康具有潜在危险性。Company Logo粪大肠
5、菌群粪大肠菌群v粪大肠菌为总大肠菌群的一个亚种；直接来自粪便，除了它耐热，在44-44.5的高温条件下仍可生长繁殖并将色氨酸代谢成吲哚，其他特性均与总大肠菌群相同。v由于总大肠菌群既包括粪便污染，同时也包括非粪便污染的大肠菌总数，因此，有必要在饮用水标准中增加粪大肠菌群这个指标，以便直接反映出水体是否受到粪便污染的信息，进一步确保流行病学的安全。Company Logo粪大肠菌群检测方法注解粪大肠菌群检测方法注解 总大肠菌群中的细菌除生活在肠道中外，在自然环境中的水与土壤中也经常存在，但此等在自然环境中生活的大肠菌群培养的最合适温度为25左右，如在37培养则仍可生长，但如将培养温度再升高至44
6、.5，则不再生长，而直接来自粪便的大肠菌群细菌，习惯于37左右生长，如将培养温度升高至44.5仍可继续生长。因此，可用提高培养温度方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分。在37培养生长的大肠菌群，包括在粪便内生长的大肠菌群称为“总大肠菌群”(Total coliform)；在44.5仍能生长的大肠菌群，称为“粪大肠菌群”(Fecal coliform)，粪大肠菌群细菌在卫生学上具有重要的意义。Company Logo目的：目的：v1.学习水样的采取方法和水样总大肠菌菌群测定的方法；v2.了解水源水的平板菌落计数的原则。Company Logo水中总大肠菌群的测定水中总大肠菌群的测定一
7、、测定意义一、测定意义 作为水体受粪便污染的指标。作为水体受粪便污染的指标。二、总大肠菌群的特征二、总大肠菌群的特征 v在在37 48h之内发酵乳糖产酸产气之内发酵乳糖产酸产气 v是革兰氏阴性无芽孢杆菌是革兰氏阴性无芽孢杆菌 v在特殊培养基上能够长出具有典型特征的菌落在特殊培养基上能够长出具有典型特征的菌落 Company Logo实验原理实验原理：v目前检测大肠菌群的标准分析法是多管发酵法。v多管发酵法包括初步发酵试验，平板划线分离和复发酵试验三部分。Company Logo 水中总大肠菌群的测定水中总大肠菌群的测定 v总大肠菌群总大肠菌群:指那些能在指那些能在37 48h37 48h之内发
8、酵乳糖产之内发酵乳糖产酸产气的、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽酸产气的、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽孢杆菌。孢杆菌。v主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌主要包括有埃希氏菌属、柠檬酸杆菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。属、克雷伯氏菌属等菌属的细菌。生活饮用水的总大肠菌群数每升不得超过生活饮用水的总大肠菌群数每升不得超过3个个Company Logo水中总大肠菌群的测定水中总大肠菌群的测定一、多管发酵法一、多管发酵法(1)生活饮用水生活饮用水 初发酵试验初发酵试验 平板分离平板分离 复发酵试验复发酵试验 阳性管接种在伊红美兰阳性管接种在伊红美兰培养基上，培养基上，37培养培养
9、1824h，挑选典型特，挑选典型特征的菌落，涂片、革兰征的菌落，涂片、革兰氏染色、镜检氏染色、镜检 各100mL原水样原水样各10mL3724hG-G-G+3718-24h3724hCompany Logov(2)水源水：将水样作1：10稀释 水样2 5 mL225mL 无菌水各1mL各1mL各10mL10-13724h水源水大肠菌群的测定水源水大肠菌群的测定Company Logov(3)地表水和废水：水样应作地表水和废水：水样应作1:10，1:100，1:1000或更高的稀释或更高的稀释 MPN值值=MPN指数指数 mlml接种量最大的一管）（10水源水大肠菌群的测定水源水大肠菌群的测定C
10、ompany Logo水源水大肠菌群的测定水源水大肠菌群的测定1.1.初发酵试验初发酵试验 水样水样25mL2 2 5 m L无菌水各1mL各1mL各10mL10-1EC培养液培养液3724h44.52448hCompany Logo2.复发酵试验复发酵试验 阳性管接到阳性管接到EC培养液中。在培养液中。在37温度下培养温度下培养24h2h，立，立即观察，发酵管产气则证实为大肠菌群阳性即观察，发酵管产气则证实为大肠菌群阳性 3.计算和报告结果计算和报告结果 查查MPN表，按总大肠菌群的计算方法计算每升水中粪大肠表，按总大肠菌群的计算方法计算每升水中粪大肠菌群细菌的菌群细菌的MPN值值 水源水大
11、肠菌群的测定水源水大肠菌群的测定Company Logo检测操作方法检测操作方法检品取样检品取样培养基配制培养基配制灭菌与消毒灭菌与消毒接种接种培养与计数培养与计数Company Logo检品取样v1.水体取样：应取距水面1015cm的深层水样。先将灭菌的带玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水立即流入瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出。v2.自来水取样：打开自来水龙头，让水流流出1min左右，用烧杯接取自来水。Company Logov3.将河水水样分别稀释成10-1、10-2、10-3三个连续稀释浓度（注意：在稀释前后一定要充分混匀）、自来水样不稀释。注意：河水样的稀
12、释，取1个灭菌空试管，加入9mL灭 菌水。用取过灭菌水的移液管取1mL河水样，放入试管中，振荡试管混合均匀。检品取样检品取样Company Logo或者是品红亚硫酸钠培养基。生长特征菌落。发酵（产酸产气）EC肉汤配方：胰蛋白胨20g/l乳糖5g/l3号胆盐1.5g/lK2HPO4 4g/lKH2PO4 1.5g/lNaCl 5g/lpH：7.0初发酵（产酸产气）EC肉汤肉汤伊红美兰培养基伊红美兰培养基3倍倍EC肉汤肉汤培养基配制Company Logo品红亚硫酸钠培养基品红亚硫酸钠培养基（Endo AgarEndo Agar）（远藤琼脂培养基）（远藤琼脂培养基）Company Logo品红亚硫
13、酸钠培养基平板及典型菌落Company Logo伊红美蓝培养基伊红美蓝培养基 v 蛋白胨 10gv 乳糖 10gv 磷酸氢二钾 2gv 琼脂 2030gv 蒸馏水 1000mlv 2%伊红水溶液 20mlv 0.5%美蓝水溶液 13ml Company Logo灭菌与消毒灭菌1.无菌操作中需要用到的器具需灭菌，如取样瓶、培养皿、涂布棒等；2.培养基需灭菌；3.无菌水需灭菌。消毒1.接种前，空气环境需紫外线消毒；2.无菌操作时，手需酒精消毒Company Logol 1.加热已经配制好的固体培养基（牛肉膏蛋白胨琼脂培养基），使固体培养基溶化。l 2.倒制平板：每个空平皿中倒约20mL的培养基，放
14、置桌面待其凝固。l 3.用移液管吸取0.1mL水样，滴于平板中；将玻璃涂布棒于酒精灯的外焰上加热，杀死表面微生物，待其冷却后用涂布棒将水滴均匀的涂满整个平板表面，尽量将水涂干。5.倒置于37度培养箱中培养24h。涂布平板接种法：Company Logo涂布平板接种法：Company Logov 1.挑取无片状菌苔生长的平板作为计数平板，若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布很均匀时，可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数。l 2.选择平均菌落数在30-300之间的平板来计算该水样的菌落总数。如果所有的平板的菌落总数都不在30-300范围之内，则取最靠近30-300的平板进行计
15、数l 3.如果有两个稀释浓度的总菌落数落在了30-300范围之内，则先计算两个浓度下每ml水体中细菌总数，如果两个数值的比值大于2则取小的浓度，如若小于2则取两值的平均值。菌落计数菌落计数Company LogoCompany Logo10-110-210-3细菌总数（个/mL)156215213246822640261321856无法计数354731928104无法计数30312试一试试一试 Company Logo例次不同稀释度的平均菌落数两个稀释度菌落数之比菌落总数/CFUmL-1报告方式/CFUmL-110-110-210-31234561 3652 7602 890无法计算27无法计
16、算1642952711 650113052046605135121.62.216 40037 75027 100513 00027030 50016 000或1.610438 000或3.810427 000或2.7104510 000或5.1105270或2.710231 000或3.1104计算和报告计数结果计算和报告计数结果 Company Logo计算v根据证实有大肠菌群存在的阳性发酵管，查MPN检索表，求出每100ml水样中的大肠菌群数。vMPN表见P192Company Logo大肠菌群测定 国家标准采用三步法 大肠菌群大肠菌群 需氧及兼性厌氧、在需氧及兼性厌氧、在37能分解乳糖产
17、酸产气的革能分解乳糖产酸产气的革 兰氏阴性无芽胞杆菌。兰氏阴性无芽胞杆菌。乳糖发酵试验乳糖发酵试验分离培养分离培养证实试验证实试验样品稀释后，选样品稀释后，选择三个稀释度，择三个稀释度，每个稀释度接种每个稀释度接种三管乳糖胆盐发三管乳糖胆盐发酵管。酵管。361培培养养482h，观察，观察是否产气。是否产气。将产气发酵管培将产气发酵管培养物转种于伊红养物转种于伊红美蓝琼脂平板上，美蓝琼脂平板上，361培养培养18-24h，观察菌落形，观察菌落形态。态。挑取平板上的可挑取平板上的可疑菌落，进行革疑菌落，进行革兰氏染色观察。兰氏染色观察。同时接种乳糖发同时接种乳糖发酵管酵管361培养培养242h，观
18、察产，观察产气情况。气情况。根据证实为根据证实为大肠杆菌阳大肠杆菌阳性的管数，性的管数，查查MPN表，表，报告每报告每100ml（g）大肠菌群的大肠菌群的MPN值。值。Company Logo较清洁样品的三步法图示 100mL100mL50mL50mL三倍三倍浓缩乳糖浓缩乳糖蛋白胨培蛋白胨培养液养液100mL100mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL水水样样10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL
19、10mLCompany Logo三步法图示 取产酸产气的发酵管取产酸产气的发酵管中培养液在伊红美兰中培养液在伊红美兰平板上进行划线平板上进行划线取有核心和带金取有核心和带金属光泽的深紫色属光泽的深紫色菌落进行革兰氏菌落进行革兰氏染色染色乳糖蛋白胨培养液乳糖蛋白胨培养液镜检（镜检（革兰氏阴性菌革兰氏阴性菌）37 培养培养48h证实产气证实产气（阳性）（阳性）结果与否结果与否37 培养培养24h37培养培养24h Company Logo大肠菌群测定 计算方法 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；红色、粉红色菌落。红色、粉红色菌落。抑制剂：胆盐、煌绿
20、、十二烷基硫酸钠。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。为阴性结果的水样体积（为阴性结果的水样体积（mLmL）全部水样体积（全部水样体积（mLmL）MPNMPN 10001000为阳性结果的发酵管（瓶）的数目为阳性结果的发酵管（瓶）的数目 产酸判断：紫色培养液变成黄色产酸判断：紫色培养液变成黄色产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁 上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。Company Logo美国FDA标准方法行业标准采用两步法：用于对出口食品中大肠菌群进行检验用于对出口食品
21、中大肠菌群进行检验 推测试验推测试验证实试验证实试验样品稀释后，选样品稀释后，选择三个稀释度，择三个稀释度，每个稀释度接种每个稀释度接种三管三管LST肉汤发酵肉汤发酵管。管。361培养培养482h，观察是，观察是否产气。否产气。将产气发酵管培将产气发酵管培养物转种于煌绿养物转种于煌绿乳糖胆盐（乳糖胆盐（BGLBBGLB）肉汤中，肉汤中，361培养培养482h ，观观察是否产气察是否产气。以以BGLBBGLB产气产气为阳性，查为阳性，查MPN表，表，报告每报告每ml（g）样品）样品中大肠菌群中大肠菌群的的MPN值。值。Company Logo 如对一自来水厂出水进行检验，初发酵一般在10支小发酵
22、管和两支大发酵瓶内进行，复发酵在5支小发酵管内进行。以300mL进行初发酵实验，其中100mL的水样2份（分装于2个大发酵瓶中），10mL水样10份，（分装于10支个小发酵管中）。实验结果：100mL的2份水样为阴性结果，无大肠杆菌存在；10mL的水样中有5份为阳性结果，存在大肠杆菌。则：MPN=?练习：Company Logo实验实验流程流程项目实施步骤Company LogoLOGO人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。
