1、基因治疗的原理专基因治疗的原理专业知识业知识基因治疗的原理专业知识2一、基因治疗的策略一、基因治疗的策略 内容提要内容提要二、基因转移技术二、基因转移技术 三、基因干预三、基因干预基因治疗的原理专业知识3基因治疗的原理专业知识4 目的目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。：将缺陷基因的异常序列进行桥正。对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。不涉及基因组的任何改变。基因治疗的原理专业知识5要实现基因置换，需要采用同源重组技术要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因使相应的正常基因定向定向导入受体细胞的基导入受体细胞的基因
2、缺陷部位。因缺陷部位。定向定向导入的发生率约导入的发生率约1/1001/100万，采用胚万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达检出率最高可达1/101/10。基因治疗的原理专业知识6（二）（二）基因添加基因添加 基因添加或称基因增补基因添加或称基因增补（gene augmentationgene augmentation）:通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。的基因。类型类型:n在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过
3、导入正常而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；n向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。用其表达产物达到治疗疾病的目的。基因治疗的原理专业知识7（三）基因干预（三）基因干预l基因干预基因干预（gene interferencegene interference）:采用特定的方式抑制某个基因的表达，或采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。以达到治疗疾病的
4、目的。基因治疗的原理专业知识8基因治疗的原理专业知识9基因治疗的原理专业知识10基因治疗的原理专业知识11基因治疗的两种途径基因治疗的两种途径载体载体目的基因目的基因in vivoex vivo靶细胞基因治疗的原理专业知识12基因治疗的原理专业知识13 1.1.病毒介导的基因转移系统病毒介导的基因转移系统 病毒载体病毒载体介导的基因转移效率较高，介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有据统计，有72%72%的临床实验计划和的临床实验计划和71%71%的的病例使用了病毒载体，其中用得最多的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒
5、载体。是逆转录病毒载体。基因治疗的原理专业知识14Retrovirus逆转录病毒逆转录病毒 基因治疗的原理专业知识15逆转录病毒介导的基因转移系统逆转录病毒介导的基因转移系统由两部分组成：由两部分组成：(1)(1)逆转录病毒载体逆转录病毒载体 (2)(2)辅助细胞株辅助细胞株(如如PA317)PA317)基因治疗的原理专业知识16 逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒包膜上由逆转录病毒包膜上由envenv编码的糖蛋白，能够被许编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录
6、病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。逆转录病毒结构基因逆转录病毒结构基因gaggag、envenv和和polpol的缺失不影响的缺失不影响其他部分的活性。其他部分的活性。前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。外源基因在靶细胞中的永久表达。包装好的假病毒颗粒包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。于分离制备。基因治疗的原理专业知识17 逆转录病毒载体的主要缺点逆转录病毒载体
7、的主要缺点 随机整合，有插入突变、激活癌基随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险；因的潜在危险；逆转录病毒载体的容量较小，只能逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳容纳7 kb7 kb以下的外源基因。以下的外源基因。基因治疗的原理专业知识18 （2 2）腺病毒）腺病毒(adenovirus(adenovirus，AV)AV)载体载体 腺病毒是一种大分子腺病毒是一种大分子(36 kb)(36 kb)双链无包膜双链无包膜DNADNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色
8、体外，不整合进入宿主细胞基因组中。体外，不整合进入宿主细胞基因组中。腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。基因治疗的原理专业知识19基因治疗的原理专业知识20基因治疗的原理专业知识21AAV Virus Particles基因治疗的原理专业知识22基因治疗的原理专业知识23基因治疗的原理专业知识24基因治疗的原理专业知识25 2.2.非病毒载体介导的基因转移系统非病毒载体介导的基因转移系
9、统 （1 1）脂质体介导的基因转移技术）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。成本低廉。基本原理基本原理:利用阳离子脂质体单体与利用阳离子脂质体单体与DNADNA混合后，可以自动形成包埋外源混合后，可以自动形成包埋外源DNADNA的的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源细胞内吞作用将外源DNADNA（即目的基因）（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。转移至细胞内，并进行表达。基因治疗的原理专业知识26（2 2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将将DNADNA与细胞或组织
10、亲和性的配体偶联，与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使可使DNADNA具有靶向性。这种偶联通常通过多具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的互作用与带负电荷的DNADNA结合，将结合，将DNADNA包围，包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源而将外源DNADNA导入靶细胞。导入靶细胞。基因治疗的原理专业知识27 （3 3）基因直
11、接注射技术）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因因DNADNA注入动物肌肉或某些器官组织内。注入动物肌肉或某些器官组织内。动物实验表明：接受注射外源动物实验表明：接受注射外源DNADNA的小鼠能够按的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。1.1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%30%40%40%；2.2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌将胰
12、岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；糖尿病所缺少的胰岛素；3.3.肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。的凝血因子等等。基因治疗的原理专业知识28基因治疗的原理专业知识30基因治疗的原理专业知识31 （一）反义（一）反义RNARNA 1.1.反义反义RNARNA与基因表达调控与基因表达调控 利用反义利用反义RNARNA对体外培养的细胞进行基因对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：表达调控，通常采用的方法有两种：（1 1）体外合成反义）体外合成反义RNARNA，直接作用于培养，直接作用于培养细胞，细胞吸
13、收细胞，细胞吸收RNARNA后，发挥作用。后，发挥作用。（2 2）构建能转录反义）构建能转录反义RNARNA的重组质粒，将的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义质粒转入细胞，转录出反义RNARNA而发挥作用。而发挥作用。基因治疗的原理专业知识32基因治疗的原理专业知识33 3.3.反义反义RNARNA的应用前景的应用前景 受体介导的反义受体介导的反义RNARNA基因治疗有其自身的优点，而在基因治疗有其自身的优点，而在一定程度上补充了转基因治疗的不足。一定程度上补充了转基因治疗的不足。（l l）安全性高）安全性高 （2 2）反义）反义RNARNA设计和制备方便设计和制备方便 （3 3）具有剂量调
14、节效应）具有剂量调节效应 （4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒 反义反义RNARNA只作用于特异的只作用于特异的mRNAmRNA分子，不分子，不改变所调节基因的结构。反义改变所调节基因的结构。反义RNARNA分子无论怎分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣残渣”。在治疗在治疗RNARNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNARNA基基因治疗比一般的因治疗比一般的DNADNA基因治疗有更大的优势。利用反义基因治疗有更大的优势。利用反义RNARNA可以直接作用于病毒可以直接作用于病毒RNA
15、RNA，阻断，阻断RNARNA病毒的繁殖。病毒的繁殖。基因治疗的原理专业知识34基因治疗的原理专业知识35基因治疗的原理专业知识363.RNA3.RNA干扰的应用前景干扰的应用前景 RNA RNA干扰研究目前已经在功能基因干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。有着广阔的前景。基因治疗的原理专业知识37基因治疗的原理专业知识38基因治疗的原理专业知识39 （3 3）病毒性疾病的基因治疗病毒性
16、疾病的基因治疗 RNARNA干扰可以被看成是一种与免疫系统类干扰可以被看成是一种与免疫系统类似的防御机制。用似的防御机制。用siRNAsiRNA抑制人类免疫缺陷病抑制人类免疫缺陷病毒（毒（HIVHIV）某些基因的表达，如）某些基因的表达，如P24P24、VifVif、nefnef、tattat或或revrev，阻碍阻碍HIVHIV在细胞内复制在细胞内复制。用。用RNARNA干扰干扰技术抑制技术抑制HIVHIV的受体（的受体（CD4CD4）或辅助受体）或辅助受体（CXCR4CXCR4或或CCR5CCR5）在细胞内表达，可）在细胞内表达，可阻碍阻碍HIVHIV感感染细胞染细胞。也可通过。也可通过R
17、NARNA干扰抑制其他病毒在细干扰抑制其他病毒在细胞内复制，如脊髓灰质炎病毒、人乳头状瘤病胞内复制，如脊髓灰质炎病毒、人乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。基因治疗的原理专业知识40 siRNAsiRNA在病毒感染的在病毒感染的早期阶早期阶段能有效地抑制病毒的复制段能有效地抑制病毒的复制，病，病毒感染能被针对病毒基因和相关毒感染能被针对病毒基因和相关宿主基因的宿主基因的siRNAsiRNA所阻断，所阻断，RNARNA干干扰技术将成为一种有效的抗病毒扰技术将成为一种有效的抗病毒治疗手段。这对于许多严重的病治疗手段。这对于许多严重的病毒性疾病的防治具有十分
18、重大的毒性疾病的防治具有十分重大的意义。意义。基因治疗的原理专业知识41（三）核酶（三）核酶(ribozyme)天然核酶多为单一的天然核酶多为单一的RNARNA分子，具有自我剪切作分子，具有自我剪切作 用。但核酶也可以由两个用。但核酶也可以由两个RNARNA分子组成。分子组成。在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNARNA分子中分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNARNA分子切断，分子切断，通过破坏靶通过破坏靶RNARNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNARNA）的目的。）的目的
19、。只要两个只要两个RNARNA分子通过互补序列相结合，形成锤头分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（状的二级结构（3 3个螺旋区），并能组成核酶的核心序个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（列（1313个或个或1111个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。产生剪切反应。基因治疗的原理专业知识42 1.核酶的设计核酶的设计 核酶是通过靶核酶是通过靶RNARNA分子与核酶分子共同组成酶活性结构分子与核酶分子共同组成酶活性结构域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。域，要从靶分子和核酶分子两个方面来设计核酶。（1 1）选择合适的靶部位，该部位
20、具有核酶切割位点，）选择合适的靶部位，该部位具有核酶切割位点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2 2）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由）核酶的基本组成：用于基因治疗的核酶分子由三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构三个部分组成，中间是保守序列（能够组成酶活性结构域），两端是引导序列。域），两端是引导序列。在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的在基因治疗中，主要是根据治疗的靶基因序列的特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是特点，设计和合成特定的核酶。设计的基本原则是核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。核酶分子与靶部位结合后能形成酶活性结构域。基因治疗的原理专业知识43核酶的作用机制 基因治疗的原理专业知识44 2.2.核酶的应用核酶的应用 与一般的反义与一般的反义RNARNA相比，核酶具有较稳相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到定的空间结构，不易受到RNARNA酶的攻击。更酶的攻击。更重要的是，核酶在切断重要的是，核酶在切断mRNAmRNA后，又可从杂后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNAmRNA分子。分子。基因治疗的原理专业知识45Good Good night!night!46
