1、实验三实验三 抗体的制备抗体的制备（PcAbPcAb/McAb/McAb）主讲：胡荣主讲：胡荣实验实验目的目的 1、掌握抗体制备方法(PcAb/McAb)（制备免疫原免疫动物血清分离纯化鉴定保存）2、理解弗氏佐剂的作用实验实验内容内容 1、伤寒沙门菌伤寒沙门菌“O O”抗体抗体的制备（讲述+实验）2、抗人血清抗人血清的制备（讲述）3、单克隆抗体的制备（视频）单克隆抗体（McAb）由单个B细胞克隆产生的仅针对一种抗原表位的高特异性抗体。（方法：杂交瘤技术）多克隆抗体（PcAb）由多个B细胞克隆针对抗原多个表位所产生的混合抗体。（方法：免疫动物）佐剂：先于抗原或与抗原一起注入机体，可增强机体对该抗
2、原的特异性免疫应答或改变免疫应答类型的物质。（一）、实验原理（一）、实验原理 用Ag刺激机体可以使机体产生Ab，根据Ab产生的一般规律，视抗原的性质选择不同的途径免疫动物，经初、再次免疫后，使动物血清中产生足量的特异性Ab，继而分离、纯化血清，得到相应的Ab。（PcAbPcAb）多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备（二）、试剂与器材1、抗原与免疫对象 Ag1：伤寒沙门菌“O”抗原；Ag2：混合人全血清；免疫对象：健康家兔（24只:12只/班）。2、试剂 生理盐水、碘酒、酒精、标记颜料、84消毒液等。3、设备与器材 剪刀、注射器（1ml）、棉签、烧杯（装半杯水：放兔毛）、一次性手套等。（三）、操作方
3、法 1、抗伤寒沙门菌“O”抗原抗血清的制备 2、抗人血清的制备（1）伤寒沙门菌“O”抗原的制备 第一种:自制伤寒沙门菌“O”抗原（流程见后）第二种:肥达氏反应诊断试剂（菌体“O”抗原：此次均为此种抗原）1、抗抗伤寒沙门菌伤寒沙门菌“O”抗原抗原抗血清的制备抗血清的制备自制伤寒沙门菌O抗原标准菌株标准菌株接种接种琼脂平板培养琼脂平板培养（37，2448h）N.S刮洗菌苔于三角烧瓶刮洗菌苔于三角烧瓶（清洁、无菌）清洁、无菌）滤纸过滤或移入离心管滤纸过滤或移入离心管4000r/min 1020min 60 水浴或隔水煮沸水浴或隔水煮沸1h（破坏细菌鞭毛）（破坏细菌鞭毛）N.S调菌液浓度至调菌液浓度至
4、109个个/ml，4 保存保存（2）伤寒沙门菌“O”抗原免疫方案 用于免疫动物的菌液浓度视种的不同而异，伤寒沙门菌、志贺痢疾菌等肠道杆菌，免疫浓度多为109个/ml左右。细菌性抗原的免疫方案大致相同，见下表：免免 疫疫 方方 案案（3）初次免疫 各组均注射伤寒沙门菌O抗原，5人一小组，每小组一只兔子（适龄、健壮），用剪刀剪去背部两侧毛（共四点），分别用碘酒、酒精消毒后，皮内注射1ml（分四点）菌体抗原，标记，归笼。（4）加强免疫 免疫途径、剂量、间隔时间见免疫方案。（5）试血 末次免疫7天后即试血，耳静脉采血，分离血清，与伤寒沙门菌O抗原作试管凝集试验，凝集效价在1：6003200之间时即可放
5、血，若效价较低可继续加强免疫。（6）放血 心脏采血（末次免疫后5-7d）。2、抗人血清的制备（1）弗氏佐剂的制备弗氏不完全佐剂：称取羊毛脂5g，逐滴加入石蜡油20ml（羊毛脂：石蜡油约为1：11：4），高压灭菌后4oC保存备用。弗氏完全佐剂：于不完全佐剂中加入220mg/ml卡介苗，研钵中乳化后即成为完全佐剂，冰箱保存备用。（2）抗原弗氏完全佐剂 取混合人全血清（20个以上），用N.S作1：4稀释。将稀释血清与完全佐剂1：1体积的比例混合，制成油包水状态。具体方法如下：研磨法：取完全佐剂置无菌和研钵中，然后逐滴加入稀释混合人血清，边加边研磨，直至滴一滴至水中不散开为止，此即完全乳化的油包水状态
6、。若系不完全佐剂，则像加入人血清那样，按220mg/ml的量加入卡介苗。（3）抗原弗氏完全佐剂免疫动物 取健康家兔，用剪刀剪去其双后足掌的毛，碘酒和酒精消毒。每只足掌注射抗原弗氏完全佐剂0.5ml、标记、归笼。（4）无佐剂的人血清加强免疫 上述免疫7天后，耳静脉注射人血清（1:2稀释）0.5ml左右以加强免疫，如此重复一两次，并于最后一次注射7天后采血。（5）试血 采血方法同伤寒沙门菌O抗原抗血清制备。试血时，双扩试验效价达1：16以上即可收集血清。如效价不高，可追加免疫。（6）抗血清采集 心脏采血。内容：效价、特异性、纯度、亲和力方法：颗粒性抗原效价凝集试验 可溶性抗原效价琼脂扩散试验、抗血清的鉴定 330-400g/L饱和度的硫酸铵溶液选择性沉淀IgG，也可采用离子交换色谱和亲和色谱法等方法提取。、抗血清纯化 4保存（36M）；低温保存（35Y）；真空干燥保存（510Y）。5、抗血清保存（四）、注意事项 1、正确抓握家兔、注意抚摸；2、做好自我保护，防止抓伤或咬伤；3、保持安静，不要大声喧哗；4、有团队合作精神！5、整理干净桌面（84消毒液消毒）！过程：1、细胞的选择与制备 2、细胞融合 3、杂交瘤细胞选择培养 4、杂交瘤细胞克隆化培养与冻存 5、单克隆抗体的大量制备 6、单克隆抗体的纯化和鉴定单克隆抗体的制备（看视频）单克隆抗体的制备（看视频）
