1、实验三 油镜使用和细菌形态观察1、显微镜油镜的使用2、细菌形态的观察（示教）（示教）3、革兰氏染色4、芽胞染色一、实验目的一、实验目的学习并掌握普通光学显微镜的构造和油镜学习并掌握普通光学显微镜的构造和油镜的使用技术及维护的基本知识的使用技术及维护的基本知识（一）显微镜油镜的使用（一）显微镜油镜的使用二、二、显微镜及油镜使用原理显微镜及油镜使用原理显微镜的构造显微镜的构造 1.1.光学部分光学部分目镜目镜 、物镜物镜 、照明装置照明装置(聚光镜、聚光镜、虹彩虹彩光圈、光圈、反光镜等反光镜等)。它使。它使检视物放大检视物放大,生成物象。生成物象。2.2.机械部分机械部分:镜座、镜镜座、镜臂、镜筒
2、、物镜转换臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载物台器、载物台、载物台转移器、粗调节器、转移器、粗调节器、细调节器等部件细调节器等部件.它它起着支持、调节、起着支持、调节、固定等作用固定等作用.图图1-1-2 光学显微镜的成像原理光学显微镜的成像原理倒立的虚像倒立的虚像显微镜的放大倍数和分辨率显微镜的放大倍数和分辨率 1.1.放大倍数：物镜放大倍数目镜放大倍放大倍数：物镜放大倍数目镜放大倍数数 2.2.显微镜的分辨率显微镜的分辨率:是表示显微镜辨析两是表示显微镜辨析两点之间距离的能力。可用公式表示为：点之间距离的能力。可用公式表示为：D=D=/2nsin(/2)/2nsin(/2)式中式中D D：物
3、镜分辨出物体两点间的最短距：物镜分辨出物体两点间的最短距离。离。：可见光的波长（平均可见光的波长（平均0.550.55 m)m)n:n:物镜和被检标本间介质的折射率。物镜和被检标本间介质的折射率。：镜口角（即入射角）。镜口角（即入射角）。D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰油镜使用的原理油镜使用的原理 油镜，即油浸接物镜。当光线由油镜，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的降
4、低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（介质是一层油（其折射率与玻片其折射率与玻片的相近的相近），则几乎不发生折射，），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从而使物增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。象更加清晰。u根据公式根据公式D=D=/2nsin(/2)/2nsin(/2)，增大分母，使得，增大分母，使得D D值减小，分辨率增大值减小，分辨率增大。1.1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件,以免损坏。以免损坏。2.2.镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度镜面只能用擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.3.观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，
5、最后用油镜。当目视观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜，最后用油镜。当目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。碎玻片或损伤镜面。4.4.拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更拿显微镜时，一定要右手拿镜臂，左手托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。不可倾斜拿。5.5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油；第二遍擦镜纸蘸上二甲苯再擦镜头；第三遍再用干净的擦油；第二遍擦镜纸蘸上二甲苯再擦镜头；第三遍再用干净的擦镜纸擦去多
6、余的二甲苯。镜纸擦去多余的二甲苯。6.6.显微镜应存放在阴凉用擦镜纸擦干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐显微镜应存放在阴凉用擦镜纸擦干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片蚀镜片。显微镜保养和使用中的注意事项显微镜保养和使用中的注意事项三三.显微镜油镜观察操作方法显微镜油镜观察操作方法 在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域滴加香柏滴加香柏油油，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几，从侧面注视，用粗调节器使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到乎
7、与标本相接。然后用细调节器调节，在目镜下找到最合适的观察点。最合适的观察点。p油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭油镜使用毕后：上升镜筒，取下载玻片，用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹，最后用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。的擦镜纸擦去残留的二甲苯。本实验室按学号使用固定编号的显微镜，显微镜的保本实验室按学号使用固定编号的显微镜，显微镜的保养由对应学号的同学负责。实验过程中如果所用显微养由对应学号的同学负责。实验过程中如果所用显微镜不能使用
8、，自行与其他同学调节。但显微镜如果出镜不能使用，自行与其他同学调节。但显微镜如果出现问题，由对应学号的同学承担责任。现问题，由对应学号的同学承担责任。一、实验目的一、实验目的 进一步熟悉使用油镜观察微生物的方法，初进一步熟悉使用油镜观察微生物的方法，初步认识细菌的基本形态和特殊结构特征步认识细菌的基本形态和特殊结构特征（二）细菌形态的观察（二）细菌形态的观察二、观察内容二、观察内容基本形态：杆菌，球菌基本形态：杆菌，球菌（注意大小、染色性、（注意大小、染色性、排列）排列）特殊结构：鞭毛，芽胞，荚膜特殊结构：鞭毛，芽胞，荚膜（先找到菌体，（先找到菌体，再仔细观察特殊结构）再仔细观察特殊结构）以画
9、图的方式完成该实验的报告以画图的方式完成该实验的报告杆菌（大肠杆菌，杆菌（大肠杆菌，G G-）画图注意事项：画图注意事项：1 1、以圆圈表示视野、以圆圈表示视野 2 2、注意菌体大小比例合适、注意菌体大小比例合适 3 3、标出菌体颜色，显示典型排列方式、标出菌体颜色，显示典型排列方式 4 4、特殊结构标出菌体和特殊结构所在位置、特殊结构标出菌体和特殊结构所在位置（三）革兰氏染色（三）革兰氏染色一、实验目的一、实验目的学习微生物涂片、革兰氏染色的基本技术学习微生物涂片、革兰氏染色的基本技术二、二、革兰氏染色的工作原理革兰氏染色的工作原理革兰氏染色法是细菌学中重要的鉴别染色法。有芽革兰氏染色法是细
10、菌学中重要的鉴别染色法。有芽孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌孢的杆菌和绝大多数球菌以及所有的放线菌和真菌都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病都呈革兰氏阳性反应；弧菌，螺旋体和大多数致病性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。性的无芽孢杆菌都呈现阴性反应。根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的结根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁的结构差异来达到染色的目的的。构差异来达到染色的目的的。先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的蓝先用结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的蓝紫色；紫色；然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫然后用碘媒染，它与结晶紫结合成结晶紫碘复合碘复合物，从而增强
11、了染料与细菌的结合力。物，从而增强了染料与细菌的结合力。然后再用乙醇脱色处理然后再用乙醇脱色处理由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、由于革兰氏阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩，结晶紫壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩，结晶紫碘碘不易被洗脱而保留在细胞内，复染时仍保持蓝紫色。不易被洗脱而保留在细胞内，复染时仍保持蓝紫色。而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含而革兰氏阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透性增大，结晶紫性增大，结晶紫碘复合物被洗脱，
12、复染时细胞被染碘复合物被洗脱，复染时细胞被染上复染剂的颜色（红色）。上复染剂的颜色（红色）。大肠杆菌大肠杆菌葡萄球菌葡萄球菌三、革兰氏染色的操作方法三、革兰氏染色的操作方法无菌操作无菌操作涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色 水洗水洗 干燥干燥 镜检镜检（1 1）涂片：）涂片：先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平先在载玻片上滴一滴生理盐水，再在菌平板上取一小环培养板上取一小环培养2424小时的大肠杆菌和金黄色葡萄球小时的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体于生理盐水中涂片（，分别于斜面上挑取少许菌菌体于生理盐水中涂片（，分别于斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开，菌苔于水滴中
13、，混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开，使其分布均匀。使其分布均匀。注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚菌不宜过多，涂片要均匀，不可过于浓厚载玻片水滴菌体涂片染色前染色前必须固定必须固定细菌，其目的是：细菌，其目的是：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上。二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。有的形态。干燥：把上面涂好的片于室温下自然干燥。干燥：把上面涂好的片于室
14、温下自然干燥。涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体（此操涂面朝上，在火焰上方过几次以热固定菌体（此操作的目的是使得细胞质凝固，以固定细胞形态，并作的目的是使得细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上）。固定时通过火焰使之牢固附着在载玻片上）。固定时通过火焰1212次即可。次即可。注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞形态。变甚至破坏细胞形态。初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌初染：滴数滴结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染膜为宜）初染1-21-2分钟分钟minmin，水洗。，水洗。媒染：滴加
15、碘液冲去残水，并覆盖约媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约1min1min，水洗。，水洗。脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾斜，脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾斜，用用9595酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约约2030s2030s，立即用水冲净酒精。，立即用水冲净酒精。注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。复染：用番红液染复
16、染：用番红液染12min,12min,水洗。水洗。镜检：干燥后（室温下晾干），置油镜观察（先在镜检：干燥后（室温下晾干），置油镜观察（先在低倍镜，然后在油镜下观察菌体细胞的形态）。革低倍镜，然后在油镜下观察菌体细胞的形态）。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。密集的细菌，常常呈假阳性。（9 9）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌）同法在一载玻片上以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合制片，作革兰氏染色对比。混合制片，作革兰氏染色对比。(
17、10).(10).实验结果的记录：实验结果的记录：要求在用显微镜观察要求在用显微镜观察（左眼观察）的同时在实验记录本上画下你所观（左眼观察）的同时在实验记录本上画下你所观察到的细菌的形态。察到的细菌的形态。本实验每人做一张。本实验每人做一张。实验报告中要画图表示结果。实验报告中要画图表示结果。思考题思考题1.1.涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样2.2.分析影响革兰氏染色结果的因素。分析影响革兰氏染色结果的因素。一、实验目的一、实验目的熟悉芽胞染色的方法熟悉芽胞染色的方法（四）芽胞染色（四）芽胞染色二、芽胞染色的原理二、芽胞染色的原理 细菌的芽胞具有厚
18、而致密的壁，透性低，不易着色，若细菌的芽胞具有厚而致密的壁，透性低，不易着色，若用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色用一般染色法只能使菌体着色而芽胞不着色(芽胞呈无色芽胞呈无色透明状透明状)。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染。芽胞染色法就是根据芽胞既难以染色而一旦染上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色上色后又难以脱色这一特点而设计的。所有的芽胞染色法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需法都基于同一个原则：除了用着色力强的染料外，还需要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，要加热，以促进芽胞着色。当染芽胞时，菌体也会着色，然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出
19、，而菌体会脱色。然后水洗，芽胞染上的颜色难以渗出，而菌体会脱色。然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现然后用对比度强的染料对菌体复染，使菌体和芽胞呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽胞，便于观察。三、芽孢染色法步骤三、芽孢染色法步骤(1)(1)取取3737培养培养24h 24h 3636h h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。(2)(2)于载片上滴入于载片上滴入3 35 5滴滴5 5孔雀绿水溶液。孔雀绿水溶液。(3)(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸用试管夹夹住载玻片
20、在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约汽时，开始计算时间约4 45min5min。加热过程中切勿使染料蒸干，。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。必要时可添加少许染料。(4)(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。止。(5)(5)用用0.50.5沙黄水溶液沙黄水溶液(或或0.050.05碱性复红碱性复红)复染复染1min1min，水洗。，水洗。(6)(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜分芽孢仍保留在菌体上为宜本实验每人做一张。本实验每人做一张。实验报告中画图表示结果。实验报告中画图表示结果。
