1、实验七实验七 大肠菌群的测定大肠菌群的测定一一 实验目的实验目的n1、掌握大肠杆菌的鉴定和计数、掌握大肠杆菌的鉴定和计数方法方法n2、巩固无菌操作技术巩固无菌操作技术二二 大肠杆菌鉴定原理大肠杆菌鉴定原理n大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需大肠菌群：一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否染肠道致病菌的可能。有否染肠道致病菌的可能。n 样品中大肠菌群系以样品中大肠菌群系以1
2、00mL100mL（g g）检样内大）检样内大肠菌群最大可能数（肠菌群最大可能数（MPN)MPN)表示。表示。细细 菌菌 学学 检检 验验 程程 序序 样品样品 细菌总数细菌总数 大肠菌群大肠菌群 水样稀释或不稀释水样稀释或不稀释 水样稀释或不稀释水样稀释或不稀释 第一步第一步-初步发酵试验初步发酵试验 倾注平板培养倾注平板培养 （乳糖发酵）（乳糖发酵）37 24小时小时 37 24小时小时 菌落计数菌落计数 第二步第二步-平板分离培养平板分离培养（取平均数报告）（取平均数报告）（转种鉴别培养基）（转种鉴别培养基）37 24小时小时 革兰染色镜检革兰染色镜检 第三步第三步-乳糖复发酵试验乳糖复
3、发酵试验 报告结果报告结果 三、实验器材三、实验器材 1 1、恒温培养箱（、恒温培养箱（36361 1）、高压灭菌）、高压灭菌锅锅、天平、灭菌培养皿、试管。、天平、灭菌培养皿、试管。2 2、培养基及试剂：、培养基及试剂：n 乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板（EMBEMB）四、实验步骤四、实验步骤大肠菌群的检测大肠菌群的检测 检品检品 胆盐乳糖发酵管胆盐乳糖发酵管 伊红美兰平板伊红美兰平板 大肠杆菌菌落纯培养大肠杆菌菌落纯培养 乳糖复发酵管（乳糖复发酵管（-）乳糖复发酵管（乳糖复发酵管（）n1、检样稀释、检样稀释n以无菌操作将检样以无菌操作将检样1mL1mL放于含
4、有放于含有9mL9mL灭菌生理盐水或灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1 1：1010的均匀稀释液。的均匀稀释液。n用用1ml1ml灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1 1：1010稀释液稀释液1mL1mL，注入含有，注入含有9mL9mL生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成成1 1：100100的稀释液。的稀释液。n另取另取1ml1ml灭菌吸管，按上述操作依次作灭菌吸管，按上述操作依次作1010倍递增稀倍递增稀释液。释液。n根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选根据食品
5、卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度，接种择三个稀释度，每个稀释度，接种3 3管，每支试管接管，每支试管接种种1ml1ml。n2.乳糖发酵试验乳糖发酵试验n 将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL1mL以上者，用以上者，用双料乳糖胆盐发酵管双料乳糖胆盐发酵管；1mL1mL及及1mL1mL以以下者，用下者，用单料乳糖发酵管单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种。每一个稀释度接种3 3管，管，置置363611温箱内，培养温箱内，培养24h24h2h2h，如所有乳糖，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，胆盐发酵管
6、都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行。如有产生者，则按下列程续进行。3.3.分离培养分离培养n 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36361 1温箱内，培养温箱内，培养18h24h18h24h，然后取出，观察菌，然后取出，观察菌落形态并做革兰氏染色和证实试验。落形态并做革兰氏染色和证实试验。4.4.证实试验证实试验n在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1212个进行革兰个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36361 1的温箱内的温箱内培养培养24
7、h24h2h2h，观察产气情况。，观察产气情况。n凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠菌群阳性。为大肠菌群阳性。5.5.报告报告n根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPNMPN检索表，报告检索表，报告每每100mL100mL（g g）食品中大肠菌群的）食品中大肠菌群的MPNMPN 值。表1 大肠菌群最可能数（MPN）检索表 阳性管数 MPN 100mL(g）95%可信限 1mL(g)3 0.1mL(g)3 0.01mL(g)3 下限 上限 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2 3 30 30
8、60 90 5 90 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 2 3 30 60 90 120 5 130 0 0 0 0 2 2 2 2 0 1 2 3 60 90 120 160 0 0 0 0 3 3 3 3 0 1 2 3 90 130 160 190 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 2 3 40 70 110 150 5 10 200 210 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 70 110 150 190 10 30 230 360 1 1 1 1 2 2 2 2 0 1 2 3 110 150 200 240 30 360 1 1 1 1 3 3 3 3 0
9、1 2 3 160 200 240 290 2 2 2 200000123901402002601030360370 2 2 2 2111101231502002703403070440890 2 2 2 22222012321028035042040100470150022223333012329036044053033330000012323039064095040701501200130038003333111101234307501200160070140300210023003800333322220123930150021002900150300350380044004700333
10、3333301232400460011000240003607101500130002400048000大肠菌群测定大肠菌群测定 挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；挑选菌落特征：黑紫色、有光泽或无光泽菌落；红色、粉红色菌落。红色、粉红色菌落。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。抑制剂：胆盐、煌绿、十二烷基硫酸钠。产酸判断：紫色培养液变成黄色产酸判断：紫色培养液变成黄色产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试产气判断：发酵导管内有小气泡，如轻轻打动试管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，管有气泡沿管壁上浮，应考虑可能有气体产生，需进一步试验。需进一步试验。饮用饮用水、乳、冷饮食品卫
11、生标准的细菌指标水、乳、冷饮食品卫生标准的细菌指标 指指 标标 细菌总数细菌总数 大肠菌群大肠菌群 饮用饮用水水 100个个/ml 3个个/L 消毒牛奶消毒牛奶 30，000个个/ml 40个个/100ml 瓶装瓶装汽水、果味水汽水、果味水 及果汁类饮料及果汁类饮料 品品 种种 100个个/ml 5个个/100ml五、实验报告五、实验报告（一）、列表记录并计算实验结果（一）、列表记录并计算实验结果（二）、思考题（二）、思考题1 1、怎样判断分离到的微生物是大肠杆菌？、怎样判断分离到的微生物是大肠杆菌？2 2、接种了微生物的培养皿为什么要倒置、接种了微生物的培养皿为什么要倒置培养？培养？实验准备（实验准备（2个样品个样品/组）组）n培养皿培养皿：1010套套/组组n无菌水：无菌水：1010支（支（9 9毫升毫升/支）支）n乳糖胆盐发酵培养基：乳糖胆盐发酵培养基：100ml 18 100ml 18支试管、支试管、5ml/5ml/支支n伊红美蓝琼脂培养基（伊红美蓝琼脂培养基（EMBEMB）:200ml 8-10 200ml 8-10个平板个平板下周实验下周实验实验八实验八 化学药剂对微生物生长的影响化学药剂对微生物生长的影响
