1、资料仅供参考,不当之处，请联系改正。实验目的实验目的1、学习层析技术学习层析技术2、掌握氨基酸纸层析掌握氨基酸纸层析 法的基本原理法的基本原理2022-10-151资料仅供参考,不当之处，请联系改正。层析技术层析技术2022-10-152资料仅供参考,不当之处，请联系改正。基本原理基本原理2022-10-153资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纸层析的分离原理纸层析的分离原理l纸层析是分配层析，是利用混纸层析是分配层析，是利用混合物在二种或者二种以上的溶合物在二种或者二种以上的溶剂中总分配系数的不同而使物剂中总分配系数的不同而使物质分离的方法。质分离的方法。2022-10-154资料仅供参考
2、,不当之处，请联系改正。纸层析原理l以滤纸为支持物，滤纸上纤维为载体，以滤纸为支持物，滤纸上纤维为载体，滤纸上结合水为固定相，有机溶剂作为滤纸上结合水为固定相，有机溶剂作为流动相。流动相。l滤纸纤维与水亲合力强，能吸收滤纸纤维与水亲合力强，能吸收20-22%20-22%的水，且其中的水，且其中6-7%6-7%的水是以氢键形式与的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合，在一般情况下很难纤维素的羟基结合，在一般情况下很难脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力脱去，而滤纸纤维与有机溶剂的亲和力甚弱。甚弱。2022-10-155资料仅供参考,不当之处，请联系改正。纸层析法分类纸层析法分类l按操作方式分成两类按操
3、作方式分成两类：垂直型和水平型。：垂直型和水平型。顾名思义垂直型是将滤纸条垂直悬挂，顾名思义垂直型是将滤纸条垂直悬挂，使流动相向上或者向下扩散。水平型是使流动相向上或者向下扩散。水平型是将圆形滤纸置于水平位置，使流动相溶将圆形滤纸置于水平位置，使流动相溶剂由中心向四周扩散。剂由中心向四周扩散。2022-10-156资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2022-10-157资料仅供参考,不当之处，请联系改正。实验原理实验原理 转氨基反应转氨基反应是由专一是由专一转氨酶转氨酶催化的催化的-氨基与氨基与-酮酸之间基团酮酸之间基团互换反应互换反应,广泛存在于机体各组广泛存在于机体各组织器官，是体内氨基
4、酸代谢的重织器官，是体内氨基酸代谢的重要途径。要途径。2022-10-158资料仅供参考,不当之处，请联系改正。实验原理实验原理 本实验以本实验以丙氨酸和丙氨酸和-酮戊二酮戊二酸为底物酸为底物，加含有，加含有谷丙转氨酶谷丙转氨酶（ALTALT）的的肝匀浆肝匀浆，保温后用纸层，保温后用纸层析法检查谷氨酸的出现，以证明析法检查谷氨酸的出现，以证明转氨基作用。转氨基作用。2022-10-159资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2022-10-1510资料仅供参考,不当之处，请联系改正。实验原理实验原理 本实验设立实验组和对照组。本实验设立实验组和对照组。实验组实验组发生了上述转氨基作用，体系中存在
5、发生了上述转氨基作用，体系中存在两种氨基酸；而两种氨基酸；而对照组对照组由于用煮沸的由于用煮沸的方法使肝匀浆中方法使肝匀浆中ALTALT失活，不能发生转失活，不能发生转氨基作用，体系中只存在一种氨基酸。氨基作用，体系中只存在一种氨基酸。2022-10-1511资料仅供参考,不当之处，请联系改正。实验原理实验原理l在本实验中，由于丙氨酸和谷氨酸在酚和水在本实验中，由于丙氨酸和谷氨酸在酚和水二相中的分配系数不同，各有自己特定的迁二相中的分配系数不同，各有自己特定的迁移率。极性弱的移率。极性弱的丙氨酸丙氨酸易溶于有机溶剂酚中，易溶于有机溶剂酚中，在水中分配系数小，随在水中分配系数小，随流动相流动相(
6、酚酚:水水=8:2)移移动较快，而极性强的动较快，而极性强的谷氨酸谷氨酸则相反，最终彼则相反，最终彼此分离。此分离。2022-10-1512资料仅供参考,不当之处，请联系改正。比移率Rf计算l衡量某种被分离物质在滤纸上的移动衡量某种被分离物质在滤纸上的移动速率我们可以用比移率速率我们可以用比移率RfRf表示：表示：2022-10-1513资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【器材】【器材】l匀浆器、水浴锅、恒温水浴箱、匀浆器、水浴锅、恒温水浴箱、圆滤纸圆滤纸(9cm)(9cm)、吹风机、组织剪刀、吹风机、组织剪刀l离心管、试管、培养皿、表面皿、离心管、试管、培养皿、表面皿、等等2022-10-
7、1514资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【试剂】【试剂】l1 1磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液。l2 20.2mol/L 0.2mol/L 丙氨酸溶液丙氨酸溶液 l3 30.1mol/L 0.1mol/L 酮戊二酸酮戊二酸 l4 40.1mol/L 0.1mol/L 谷氨酸溶液谷氨酸溶液 l5 50.5%0.5%茚三酮溶液茚三酮溶液 l6 6层析溶剂层析溶剂 酚饱和水溶液酚饱和水溶液2022-10-1515资料仅供参考,不当之处，请联系改正。实验步骤1.测定管上清液测定管上清液 2.0.1 mol/L丙氨酸丙氨酸 3.对照管上清液对照管上清液 4.0.1 mol/L谷氨酸谷氨酸 2022-10
8、-1516资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【实验步骤】l 1 1匀浆制备匀浆制备l 2 2酶促反应过程酶促反应过程 l（1 1）取离心管两支，编号：测定管、对）取离心管两支，编号：测定管、对照管。各管加肝匀浆照管。各管加肝匀浆1010滴。测定管于滴。测定管于3737水浴水浴10min10min，对照管放沸水浴中加热，对照管放沸水浴中加热10min10min，取出冷却。取出冷却。2022-10-1517资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【实验步骤】（2 2）各管加丙氨酸溶液）各管加丙氨酸溶液1010滴滴,-酮戊二酸酮戊二酸1010滴滴,磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液1.5 ml,1.5 ml,摇
9、匀，置摇匀，置 3737保温保温30min30min，取出。，取出。2022-10-1518资料仅供参考,不当之处，请联系改正。【实验步骤】（3 3）测定管取出后立即放沸水浴中煮）测定管取出后立即放沸水浴中煮 10min(10min(终止反应终止反应)，取出后冷却，取出后冷却，过滤，滤液备用。过滤，滤液备用。2022-10-1519资料仅供参考,不当之处，请联系改正。3层析层析 取直径取直径9cm9cm圆形滤圆形滤纸一张，用圆规作纸一张，用圆规作半径半径1cm1cm同心圆，同心圆，通过圆心做两条相通过圆心做两条相互垂直的线，找到互垂直的线，找到4 4个位点。个位点。2022-10-1520资料
10、仅供参考,不当之处，请联系改正。在滤纸圆心处打一小孔，取在滤纸圆心处打一小孔，取滤纸一条，下半剪成须状，卷成滤纸一条，下半剪成须状，卷成灯芯状捻灯芯状捻,上端插入滤纸中心孔上端插入滤纸中心孔中（不要突出滤纸面）。中（不要突出滤纸面）。2022-10-1521资料仅供参考,不当之处，请联系改正。l用毛细管在纸上用毛细管在纸上1 1、3 3处分别点测定和处分别点测定和对照管上清液对照管上清液(斑斑点直径约点直径约0.5cm)0.5cm)，2 2、4 4处各点丙氨处各点丙氨酸和谷氨酸溶液。酸和谷氨酸溶液。2022-10-1522资料仅供参考,不当之处，请联系改正。层析层析l把滤纸平放在盛有层析液的培
11、养皿上，把滤纸平放在盛有层析液的培养皿上，使纸芯下浸入层析液中，可见酚液沿使纸芯下浸入层析液中，可见酚液沿纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散，纸芯上升到滤纸中心，渐向四周扩散，盖上培养皿盖。盖上培养皿盖。l当酚液前缘到离滤纸边缘约当酚液前缘到离滤纸边缘约1cm1cm时时（约（约25-3025-30分钟）取出滤纸，用镊子分钟）取出滤纸，用镊子小心取下纸芯，在烤箱中烘吹干滤纸。小心取下纸芯，在烤箱中烘吹干滤纸。2022-10-1523资料仅供参考,不当之处，请联系改正。4、显色、显色l在层析滤纸上滴在层析滤纸上滴0.5%0.5%茚三酮溶液茚三酮溶液,在烤在烤箱中烘吹干滤纸箱中烘吹干滤纸,可见同心弧状
12、色斑。可见同心弧状色斑。l用铅笔圈下各色斑。比较各色斑的位置用铅笔圈下各色斑。比较各色斑的位置及颜色深浅，并按下列公式计算各色斑及颜色深浅，并按下列公式计算各色斑的的RfRf值，分析是否发生了转氨基反应。值，分析是否发生了转氨基反应。2022-10-1524资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1 1点样时手要洗净，操作中手尽可点样时手要洗净，操作中手尽可 能少接触滤纸，以免污染。能少接触滤纸，以免污染。2.2.点样点不宜过大，直径应小于点样点不宜过大，直径应小于 0.5cm 0.5cm，为什么？为什么？3.3.层析液有腐蚀性，操作时注意安层析液有腐蚀性，操作时注意安 全，防止溅到皮肤或者眼睛。全，防止溅到皮肤或者眼睛。2022-10-1525资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2022-10-1526
