1、1、微生物工程下游工程的特点 1 1）发酵液是复杂的多相系统）发酵液是复杂的多相系统2 2）所需产物在培养液中浓度较低）所需产物在培养液中浓度较低3 3）普遍存在下游工程代价高，回收率较低等问题）普遍存在下游工程代价高，回收率较低等问题2、微生物工程下游工程的一般程序成品加工发酵液的预处理和过滤提取精制采用凝聚和絮凝技术加速固、采用凝聚和絮凝技术加速固、液分离；如产物在细胞内，还液分离；如产物在细胞内，还要进行细胞破碎要进行细胞破碎提取（初步纯化）目的是除去与目标产提取（初步纯化）目的是除去与目标产物性质差异大的杂质物性质差异大的杂质精制（高度纯化）是采用对产品有高度精制（高度纯化）是采用对产
2、品有高度选择性的分离技术，除去与产物化学性选择性的分离技术，除去与产物化学性质和物理性质相近的杂质质和物理性质相近的杂质最终获得质量合格的产品最终获得质量合格的产品3、主要操作单元：絮絮凝凝离心离心过滤过滤细胞破碎细胞破碎萃取萃取沉淀沉淀层析层析结晶结晶干燥干燥二、发酵液预处理和过滤二、发酵液预处理和过滤一）发酵液的预处理1、目的：发酵液中杂质多且成分复杂，其中对纯化影响最大的是高发酵液中杂质多且成分复杂，其中对纯化影响最大的是高价价无机离子(Ca Ca 2+2+、Mg Mg 2+2+、Fe Fe 3+3+等等)和和杂蛋白等等 改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；改变发酵液的物
3、理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中；能够除去部分杂质。尽可能使产物转入便于以后处理的相中；能够除去部分杂质。2、高价无机离子的去除镁离子的去除：镁离子的去除：常用草酸常用草酸 与钙离子生成草酸钙沉淀与钙离子生成草酸钙沉淀 草酸为弱酸，对发酵产物的破坏较小，草酸钙沉淀草酸为弱酸，对发酵产物的破坏较小，草酸钙沉淀还能促进蛋白质凝固，有利于提高滤液的过滤速度；还能促进蛋白质凝固，有利于提高滤液的过滤速度；草酸的溶解度较小，需大用量时，可用草酸钠取代；草酸的溶解度较小，需大用量时，可用草酸钠取代；草酸价格较高，生产上一般需回收草酸价格较高，生产上一般需回收钙离子的
4、去除：钙离子的去除：铁离子的去除铁离子的去除：常用三聚磷酸钠常用三聚磷酸钠 与镁离子形成可溶性络合物与镁离子形成可溶性络合物 NaNa5 5P P3 3O O1010+Mg +Mg 2+2+=MgNa =MgNa3 3P P3 3O O1010+2Na+2Na+常用黄血盐常用黄血盐 与铁离子形成普鲁氏蓝沉淀与铁离子形成普鲁氏蓝沉淀3 3K K4 4Fe(CN)Fe(CN)6 6+4Fe +4Fe 3+3+=Fe =Fe4 4Fe(CN)Fe(CN)6 6 3 3+12K+12K+3、可溶性杂蛋白的去除 杂蛋白的存在会降低离子交换树脂和大网格树脂的吸附杂蛋白的存在会降低离子交换树脂和大网格树脂的
5、吸附量，如采用溶剂萃取，会发生乳化，影响两相分离。此外，量，如采用溶剂萃取，会发生乳化，影响两相分离。此外，在常规过滤和膜过滤时，还会使滤速下降，使膜受到污染在常规过滤和膜过滤时，还会使滤速下降，使膜受到污染。1 1）沉淀法）沉淀法 调等电点 因羧基的电离度比氨基大，所以大多数蛋白质的等电点因羧基的电离度比氨基大，所以大多数蛋白质的等电点都在酸性范围都在酸性范围(pH4.0-5.5)pH4.0-5.5)但仅靠调等电点还不能使大部分蛋白质沉淀蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子物质蛋白质是两性物质，在酸性溶液中，能与一些阴离子物质如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐和如三氯
6、乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐和过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如过氯酸盐等形成沉淀；在碱性溶液中，能与一些阳离子如AgAg+、Cu Cu 2+2+、Zn Zn 2+2+、Fe Fe 3+3+、PbPb 2+2+等等 形成沉淀形成沉淀2 2）变性法）变性法 变性蛋白溶解度较小 最常用加热法 加热不仅能使蛋白变性，还可降低液体黏度，提高过滤速率；加热不仅能使蛋白变性，还可降低液体黏度，提高过滤速率；其他方法：大幅度调节大幅度调节pHpH，加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂 变性法存在一定的局限 如加热法只适用于对热较稳定的目的产物；极
7、端如加热法只适用于对热较稳定的目的产物；极端pHpH也会导致某些目也会导致某些目的产物失活，且需消耗大量酸碱，而有机溶剂法通常只适用于所处理的的产物失活，且需消耗大量酸碱，而有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。液体数量较少的场合。3 3）吸附法）吸附法 加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而将其除去 如四环素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚如四环素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化钾的胶状沉淀来吸附蛋白；铁氰化钾的胶状沉淀来吸附蛋白；在枯草芽孢杆菌发酵中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者在枯草芽孢杆菌发酵中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌
8、体及其他不溶性粒子吸附并生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中而除去包裹在其中而除去二）发酵液的过滤1、质量比阻力（rB）单位滤饼厚度的阻力系数；与滤饼的结构特性有关，单位滤饼厚度的阻力系数；与滤饼的结构特性有关，衡量过滤特性的主要指标。衡量过滤特性的主要指标。对于不可压缩滤饼，比阻力值是常数；对于可压缩性滤饼，比阻力是操作压力差的函数 rB=r(P)mrr不可压缩滤饼的比阻（对一定料液其值为常数）；不可压缩滤饼的比阻（对一定料液其值为常数）；mm压缩性指数，一般为压缩性指数，一般为0.5-0.80.5-0.8；不可压缩滤饼为；不可压缩滤饼为0 0；PP压力差压力差 发
9、酵液多为非牛顿流体，滤渣为可压缩性的；发酵液多为非牛顿流体，滤渣为可压缩性的；发酵液滤饼的比阻与一般可压缩滤饼相比，有其特殊性发酵液滤饼的比阻与一般可压缩滤饼相比，有其特殊性。一般可压缩滤饼的比阻是操作压力差的函数，在不变的一般可压缩滤饼的比阻是操作压力差的函数，在不变的压差之下，滤饼比阻力是一定值，即在不变压差下过滤时，压差之下，滤饼比阻力是一定值，即在不变压差下过滤时，过滤速度的逐渐下降是由于滤饼厚度的逐渐增加所致，而过滤速度的逐渐下降是由于滤饼厚度的逐渐增加所致，而作为单位滤饼厚度的过滤阻力即滤饼比阻力是不变的；作为单位滤饼厚度的过滤阻力即滤饼比阻力是不变的；但发酵液滤饼，即使在恒定的操
10、作压差下，当滤饼中所但发酵液滤饼，即使在恒定的操作压差下，当滤饼中所含固形物浓度达到某一界限值时，滤饼的比阻力就不是一含固形物浓度达到某一界限值时，滤饼的比阻力就不是一定值，而会突然升高，因此过滤速度不但随滤饼厚度的增定值，而会突然升高，因此过滤速度不但随滤饼厚度的增加而下降，还会因滤饼比阻力的突然升高而额外下降。这加而下降，还会因滤饼比阻力的突然升高而额外下降。这是由于有机物质的胶体粒子借静电吸引而结合的水分子所是由于有机物质的胶体粒子借静电吸引而结合的水分子所致；对发酵液进行预处理，可以降低结合水的比率，使发致；对发酵液进行预处理，可以降低结合水的比率，使发酵液滤饼更接近一般可压缩性滤饼的
11、性质。酵液滤饼更接近一般可压缩性滤饼的性质。2、常用过滤设备1）板框(plate and frame)压滤机板框过滤机结构图（曹军卫（曹军卫 320 320页）页）1-1-尾板尾板 2-2-滤框滤框 3-3-滤板滤板 4-4-主梁主梁 5-5-头板头板 6-6-紧压装置紧压装置2）带式压滤机 发酵后期要少加消泡剂和少进行补料，防止消泡剂和发酵后期要少加消泡剂和少进行补料，防止消泡剂和未用完的培养基增加过滤难度；未用完的培养基增加过滤难度；菌体自溶前放罐可防止因菌体自溶释放出的代谢产物菌体自溶前放罐可防止因菌体自溶释放出的代谢产物增加发酵液黏度增加发酵液黏度3、影响发酵液过滤的因素1 1）菌体细
12、胞体积）菌体细胞体积 真菌菌丝体较粗大，质量比阻小，发酵液不需经特殊真菌菌丝体较粗大，质量比阻小，发酵液不需经特殊处理就很容易过滤；处理就很容易过滤；放线菌菌丝细而分支，交织成网格状，质量比阻力大，放线菌菌丝细而分支，交织成网格状，质量比阻力大，较难过滤，发酵液需经预处理，凝固蛋白质等胶体物质，较难过滤，发酵液需经预处理，凝固蛋白质等胶体物质，提高过滤速度；提高过滤速度；细菌菌体更小，发酵液如不经絮凝等预处理，很难用细菌菌体更小，发酵液如不经絮凝等预处理，很难用常规过滤设备进行过滤操作。常规过滤设备进行过滤操作。2 2）培养基组成）培养基组成黄豆饼粉、花生饼粉等会增加过滤难度黄豆饼粉、花生饼粉
13、等会增加过滤难度3 3）放罐时机）放罐时机当发酵液中有不溶性多糖时，会使发酵液的黏度增大而影响当发酵液中有不溶性多糖时，会使发酵液的黏度增大而影响过滤速度；可用酶将其转化成可溶性单糖，提高滤速。过滤速度；可用酶将其转化成可溶性单糖，提高滤速。4、提高过滤性能的方法1 1）加助滤剂）加助滤剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，从助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，能使滤饼疏松，从而增加滤速；而增加滤速；常用硅藻土、珍珠岩等；常用硅藻土、珍珠岩等；加入方法有两种：加入方法有两种：a)a)预先在滤布上铺上一层预先在滤布上铺上一层1-21-2mmmm厚的厚的助滤剂；助滤剂；b)b)直接把助滤剂
14、加入发酵液中。直接把助滤剂加入发酵液中。2 2）添加填充凝固剂）添加填充凝固剂如如CaSOCaSO4 4、AlPOAlPO4 4等本身就是助滤剂，且能使胶状物和等本身就是助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固悬浮物凝固3 3）酶解法）酶解法三）细胞破碎 目的代谢产物并非都是分泌型的，许多是存在于细胞目的代谢产物并非都是分泌型的，许多是存在于细胞内的，特别是基因工程菌在细胞内形成的包含体是不分泌内的，特别是基因工程菌在细胞内形成的包含体是不分泌的，故需进行细胞破碎。的，故需进行细胞破碎。大规模破碎细胞常用方法；大规模破碎细胞常用方法；利用高压使细胞悬液通过针型阀，由于突然减压和高利用高压使细胞悬液通过
15、针型阀，由于突然减压和高速冲击撞击环，造成细胞破碎。速冲击撞击环，造成细胞破碎。影响破碎的主要因素是压力、温度和循环次数影响破碎的主要因素是压力、温度和循环次数1、细胞破碎方法1 1）高压匀浆法）高压匀浆法高压匀浆器排出阀高压匀浆器排出阀2 2）高速球磨法）高速球磨法高速球磨机高速球磨机1-物料进口物料进口 2-物料出口物料出口 3、4-冷却水进、出口冷却水进、出口 5、6-夹套冷却水进、出口夹套冷却水进、出口由于圆盘的高速旋转，细胞悬浮液与极细的玻璃由于圆盘的高速旋转，细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使细胞得以破碎。细胞
16、得以破碎。3 3）超声波法）超声波法 常用超声波频率常用超声波频率15-2515-25kHzkHz；细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，由于这种空穴泡又细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，由于这种空穴泡又受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生极为强烈的冲击波受到超声波的迅速冲击而闭合，从而产生极为强烈的冲击波压力，由此引起的黏滞性旋涡在介质中的细胞上造成了剪切压力，由此引起的黏滞性旋涡在介质中的细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，造成细胞破碎；应力，促使细胞内液体发生流动，造成细胞破碎；超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作是需冷却；超声波振荡易引起温度的剧烈上升，操作是需冷却；通常杆菌比球
17、菌易破，阴性菌比阳性菌易破通常杆菌比球菌易破，阴性菌比阳性菌易破4 4）酶解法）酶解法 专一性强，条件温和；但费用较高 酶解法的另一方式是利用微生物的自溶作用 即溶胞的酶是微生物自身产生的；大多数微生物都能产即溶胞的酶是微生物自身产生的；大多数微生物都能产生一种可以水解自身细胞壁上聚合结构的酶；当改变一定生一种可以水解自身细胞壁上聚合结构的酶；当改变一定的环境条件时，可诱发这种酶的过量产生或激发其他自溶的环境条件时，可诱发这种酶的过量产生或激发其他自溶酶产生，而发生自溶现象。酶产生，而发生自溶现象。5 5）渗透压冲击法）渗透压冲击法 将细胞先放入高渗透压的介质中，如高浓度的甘油或将细胞先放入高
18、渗透压的介质中，如高浓度的甘油或蔗糖液，在达到平衡后，介质突然被稀释，或将细胞转入蔗糖液，在达到平衡后，介质突然被稀释，或将细胞转入水或缓冲液中，水就会迅速进入细胞内，致使细胞膨胀，水或缓冲液中，水就会迅速进入细胞内，致使细胞膨胀，引起细胞壁的破裂；引起细胞壁的破裂；此法适用于细胞壁较脆弱的，或者细胞壁预先用酶处此法适用于细胞壁较脆弱的，或者细胞壁预先用酶处理的，或细胞壁合成受到抑制的微生物；理的，或细胞壁合成受到抑制的微生物；6 6）反复冻结）反复冻结-融化法融化法 将细胞反复在低温下突然冷冻后在室温下融化，引起将细胞反复在低温下突然冷冻后在室温下融化，引起细胞破裂；低温冷冻一方面能使细胞膜
19、的疏水键结构断细胞破裂；低温冷冻一方面能使细胞膜的疏水键结构断裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶使裂，从而增加细胞的亲水性能；另一方面胞内水结晶使细胞内外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨胀而破裂。细胞内外溶液浓度发生变化，引起细胞突然膨胀而破裂。该法适用于细胞壁较脆弱的细胞该法适用于细胞壁较脆弱的细胞2、细胞破碎率测定 当细胞内含物释放到水相时，会引起导电率的变化；随当细胞内含物释放到水相时，会引起导电率的变化；随破碎率的增加而增加，有线性关系；破碎率的增加而增加，有线性关系；因导电率的读数取决于微生物的种类、处理条件、细胞因导电率的读数取决于微生物的种类、处理条件、细胞浓度等，应
20、先用其他方法标准化浓度等，应先用其他方法标准化1 1）直接测定法）直接测定法观察计数（必要时配合染色技术）观察计数（必要时配合染色技术）2 2）测定释放的蛋白或酶活力）测定释放的蛋白或酶活力3 3）测定导电率）测定导电率三、沉淀法（三、沉淀法（PrecipitationPrecipitation）沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液中的溶质由液沉淀是通过改变条件或加入某种试剂，使溶液中的溶质由液相转变为固相析出的过程。相转变为固相析出的过程。方法简单、成本低、使用广泛，一般作为初步分离的手段；方法简单、成本低、使用广泛，一般作为初步分离的手段；盐析法有机溶剂沉淀法等电点沉淀法非离子型聚合物
21、沉淀法聚电解质沉淀法生成盐复合物沉淀法热变性及酸碱变性沉淀法 中性盐的加入能破坏蛋白、酶等的胶体性质，中中性盐的加入能破坏蛋白、酶等的胶体性质，中和微粒上的电荷，促使蛋白质等沉淀。和微粒上的电荷，促使蛋白质等沉淀。一）盐析法 (Salting out)1、盐析原理Cohn方程蛋白质的溶解度与盐浓度间的关系可用蛋白质的溶解度与盐浓度间的关系可用CohnCohn方程式表示：方程式表示：logS/S0=KsI S S 离子强度为离子强度为I I时的蛋白溶解度时的蛋白溶解度(g/L);g/L);S S0 0 纯溶剂（即纯溶剂（即I=0I=0）时蛋白的溶解度；时蛋白的溶解度；Ks Ks 盐析常数，与温度
22、和盐析常数，与温度和pHpH无关；无关；I I 离子强度离子强度盐析法分离蛋白质时，可分两类：1 1）在一定的）在一定的pHpH值和温度下，改变离子强度或盐浓度的沉淀值和温度下，改变离子强度或盐浓度的沉淀方法方法“K”分级盐析法2 2）在一定离子强度下，改变溶液的）在一定离子强度下，改变溶液的pHpH值及温度的沉淀方值及温度的沉淀方法法“”分级盐析法 当温度一定时，当温度一定时，S S0 0对于某一溶质是一常数，即对于某一溶质是一常数，即logSlogS0 0=是溶质的特征常数，对于蛋白质而言，其大小主要取决是溶质的特征常数，对于蛋白质而言，其大小主要取决于不同蛋白质的性质，它也与溶液的温度和
23、于不同蛋白质的性质，它也与溶液的温度和pHpH值有关，但与值有关，但与盐的种类无关。盐的种类无关。2、影响盐析的主要因素盐溶(salting in)：许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象许多蛋白在低盐浓度下发生盐溶现象（比在纯水中的溶解度大大增加）；（比在纯水中的溶解度大大增加）；高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；高盐浓度则盐析，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低；盐析剂种类很多，不同种类的盐对蛋白溶解度的影响是不盐析剂种类很多，不同种类的盐对蛋白溶解度的影响是不同的；离子半径小且电荷高的离子对盐析作用的影响较强，同的；离子半径小且电荷高的离子对盐析作用的影响较强，离子半径较大而电荷
24、低的离子影响较弱；不同种类的盐对溶离子半径较大而电荷低的离子影响较弱；不同种类的盐对溶解度的影响，主要是对解度的影响，主要是对KsKs值的影响，值的影响，KsKs值越大，该盐的盐值越大，该盐的盐析效果越好。析效果越好。1 1）蛋白质浓度）蛋白质浓度 高浓度的蛋白溶液，可减少盐的用量；但共沉现象严高浓度的蛋白溶液，可减少盐的用量；但共沉现象严重重用低浓度蛋白溶液进行盐析，需用较多的盐，共沉作用用低浓度蛋白溶液进行盐析，需用较多的盐，共沉作用较轻较轻2 2）离子强度和种类）离子强度和种类3 3）温度）温度 温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以增加温度是影响溶质溶解度的重要因素，升高温度可以
25、增加许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；许多无机盐和小分子有机化合物的溶解度；但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随但在高盐浓度中，蛋白质等生物大分子物质的溶解度随温度的升高反而减小温度的升高反而减小 这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热；这主要是因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热；温度升高有利于蛋白质失水沉淀。温度升高有利于蛋白质失水沉淀。4 4）pHpH 值除与蛋白质和温度有关外，还与值除与蛋白质和温度有关外，还与pHpH有关；有关；盐析盐析pHpH的选择要以不降低产物的活性为原则；的选择要以不降低产物的活性为原则；由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等
26、电点的由于蛋白质在等电点时最易沉淀，故可选择等电点的pHpH作为盐析作为盐析pHpH二）等电点沉淀法原理：利用两性电解质在电中性时溶解度最低利用两性电解质在电中性时溶解度最低优点：许多蛋白的等电点都在偏酸范围内，而许多无机酸许多蛋白的等电点都在偏酸范围内，而许多无机酸的价格低廉，并能为食品标准允许；的价格低廉，并能为食品标准允许；缺点：酸化时易引起蛋白失活酸化时易引起蛋白失活 不少蛋白质与金属结合后会发生等电点偏移，如胰岛不少蛋白质与金属结合后会发生等电点偏移，如胰岛素的等电点为素的等电点为5.35.3，在与，在与Zn Zn 2+2+结合形成胰岛素锌盐，其等结合形成胰岛素锌盐，其等电点升为电点
27、升为6.26.2；故加入金属离子后选择等电点沉淀时，要；故加入金属离子后选择等电点沉淀时，要注意调整注意调整pHpH。三）有机溶剂沉淀法 许多有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物质以及许多有机溶剂如丙酮、乙醇、甲醇等能使溶于水的小分子生物物质以及核酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。这种沉淀作用是多种效核酸、多糖、蛋白质等生物大分子发生沉淀作用。这种沉淀作用是多种效应的结果，但主要作用是降低水溶液的介电常数。应的结果，但主要作用是降低水溶液的介电常数。当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白等分子表面上荷电基团或亲水基团的当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白等分子表面上荷电基团或亲水基团
28、的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸引力增大，带电水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸引力增大，带电溶质互相吸引而聚集。溶质互相吸引而聚集。对于具有表面水层的生物分子，有机溶剂与水的作用，使这些分子表面对于具有表面水层的生物分子，有机溶剂与水的作用，使这些分子表面水层厚度不断压缩，最后使这些分子脱水而相互聚集析出。水层厚度不断压缩，最后使这些分子脱水而相互聚集析出。不同浓度的有机溶剂可使不同的溶质沉淀，即分步沉淀法，达到分离纯不同浓度的有机溶剂可使不同的溶质沉淀，即分步沉淀法，达到分离纯化的目的。化的目的。1、原理2、优缺点优点：分辨能力较高，一种溶质只在一个比较
29、窄的有机溶剂范分辨能力较高，一种溶质只在一个比较窄的有机溶剂范围内沉淀；沉淀无需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密围内沉淀；沉淀无需脱盐；有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，易进行固液分离；有机溶剂易挥发，不会在成品度差大，易进行固液分离；有机溶剂易挥发，不会在成品中残留。中残留。缺点：易引起蛋白变性；易燃、易爆易引起蛋白变性；易燃、易爆 用于生物物质沉淀的有机溶剂须能与水互溶，但对蛋白无作用于生物物质沉淀的有机溶剂须能与水互溶，但对蛋白无作用；用；例如：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、氯例如：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、氯仿、乙醚等；仿、乙醚等；乙醇是核酸、糖类、氨基
30、酸和核苷酸等物质最常用的沉淀剂；乙醇是核酸、糖类、氨基酸和核苷酸等物质最常用的沉淀剂；在沉淀过程中，乙醇与水混合时放出大量的稀释热，使溶液在沉淀过程中，乙醇与水混合时放出大量的稀释热，使溶液的温度显著升高，这对热稳定性较差的产物影响较大（少量多次、的温度显著升高，这对热稳定性较差的产物影响较大（少量多次、搅拌）搅拌）3、影响有机溶剂沉淀的因素1 1）有机溶剂的种类）有机溶剂的种类2 2）温度）温度多数生物物质在有机溶剂与水的混合液中的溶解度是随温度多数生物物质在有机溶剂与水的混合液中的溶解度是随温度的降低而降低的，因此降低温度可增加收率；低温沉淀还能的降低而降低的，因此降低温度可增加收率；低温
31、沉淀还能更好地保护生物物质的活性更好地保护生物物质的活性3 3）pHpH 在结构稳定范围内，选择溶解度最低时的在结构稳定范围内，选择溶解度最低时的pHpH，有助于有助于提高沉淀效果；在接近等电点处，引起沉淀所需有机溶提高沉淀效果；在接近等电点处，引起沉淀所需有机溶剂的量最小；剂的量最小；合适的合适的pHpH还可大大提高分离的分辨能力还可大大提高分离的分辨能力4 4）样品浓度和分子质量）样品浓度和分子质量 低浓度样品需要使用有机溶剂的量较大，但共沉作用小，低浓度样品需要使用有机溶剂的量较大，但共沉作用小，有利于提高分离的效果；但低浓度样品损失较大，回收率有利于提高分离的效果；但低浓度样品损失较大
32、，回收率低；低；高浓度样品使用有机溶剂的量较小，减少了变性的危险；高浓度样品使用有机溶剂的量较小，减少了变性的危险；但共沉作用大，分离效果较差。但共沉作用大，分离效果较差。蛋白质分子质量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量蛋白质分子质量越大，产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少。越少。5 5）金属离子和离子强度）金属离子和离子强度 MnMn 2+2+、Fe Fe 2+2+、Co Co 2+2+、Cu Cu 2+2+、Zn Zn 2+2+等离子能与蛋白质的羧等离子能与蛋白质的羧基、氨基和含有氮杂环的化合物结合；基、氨基和含有氮杂环的化合物结合；Ca Ca 2+2+、BaBa 2+2+、Mg Mg 2+
33、2+、PbPb 2+2+能与羧基结合；能与羧基结合；Ag Ag+、Hg Hg 2+2+、PbPb 2+2+能与巯基结合形成复合物；能与巯基结合形成复合物；某些有机化合物能与生物大分子形成难容的复合物某些有机化合物能与生物大分子形成难容的复合物.这类复合物在水或有机溶剂中的溶解度都大大降低，而不影这类复合物在水或有机溶剂中的溶解度都大大降低，而不影响蛋白质的生物活性，同时还能降低有机溶剂的用量。响蛋白质的生物活性，同时还能降低有机溶剂的用量。四）非离子型多聚物沉淀法 聚乙二醇聚乙二醇(PEG)PEG)、葡聚糖右旋糖酐硫酸钠等葡聚糖右旋糖酐硫酸钠等 沉淀效能高；操作条件温和，不易引起生物大分子变性
34、；沉沉淀效能高；操作条件温和，不易引起生物大分子变性；沉淀后易除去；无毒、不可燃；广泛用于核酸、蛋白等的分离纯淀后易除去；无毒、不可燃；广泛用于核酸、蛋白等的分离纯化。化。机制：可能降低生物大分子水化度，与大分子发生共沉作用；可能降低生物大分子水化度，与大分子发生共沉作用；与生物大分子形成复合物；或通过空间位置排斥，使液体中的与生物大分子形成复合物；或通过空间位置排斥，使液体中的微粒被迫聚集而沉淀。微粒被迫聚集而沉淀。常用常用PEG6000-20000PEG6000-20000；PEG PEG的沉淀效果除与沉淀剂的浓度有关外，还受离子强度、的沉淀效果除与沉淀剂的浓度有关外，还受离子强度、pHp
35、H和温度的影响和温度的影响离子型的多糖化合物：酸性多糖用的较多，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸酸性多糖用的较多，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、果胶酸盐、卡拉胶等盐、卡拉胶等阴离子聚合物：如聚丙烯酸如聚丙烯酸阳离子聚合物：如聚乙烯亚胺等如聚乙烯亚胺等 可沉淀蛋白，作用方式类似于絮凝剂，兼有一定的盐析和水化作用五）聚电解质沉淀法四、溶剂萃取法四、溶剂萃取法 (Solvent extraction)一）溶剂萃取原理分配定律 溶剂萃取法是以分配定律为基础的，即利用各种物质在不溶剂萃取法是以分配定律为基础的，即利用各种物质在不同溶剂中具有不同的溶解度的原理，达到将不同物质分离纯同溶剂中具有不同的溶解度的原
36、理，达到将不同物质分离纯化的目的。化的目的。分配定律（distribution law;Nester,1891distribution law;Nester,1891）在一定温度和压力下，溶质分配在两不相溶的溶剂中，在一定温度和压力下，溶质分配在两不相溶的溶剂中，达到平衡时，溶质在两相的浓度之比为一常数。达到平衡时，溶质在两相的浓度之比为一常数。K=CK=CL L/C/CR R=萃取液浓度萃取液浓度/萃余液浓度萃余液浓度K K为分配常数（分配系数、分配比），其大小反映出溶质在为分配常数（分配系数、分配比），其大小反映出溶质在不同溶剂中溶解度的差异，及在此系统中的选择性不同溶剂中溶解度的差异，及
37、在此系统中的选择性 在溶剂萃取中，含有溶质的未被提取过的溶液称为在溶剂萃取中，含有溶质的未被提取过的溶液称为料液；用于进行萃取的溶剂称为用于进行萃取的溶剂称为萃取剂；经萃取后含有溶质的萃取；经萃取后含有溶质的萃取剂称为剂称为萃取液；被萃取过失去溶质的料液称为；被萃取过失去溶质的料液称为萃余液。分离因素（分离系数）若在同一体系中有两种溶质若在同一体系中有两种溶质A A和和B B，它们在相同条件下的分它们在相同条件下的分配常数分别为配常数分别为K KA A、K KB B，则分离系数则分离系数 的定义为：的定义为：=KA/KB=(CLA/CLB)/(CRA/CRB)二）有机溶剂的选择1 1）选择萃取
38、用的溶剂应考虑对产物有较大的溶解度和较）选择萃取用的溶剂应考虑对产物有较大的溶解度和较好的选择性。好的选择性。分离因素可以表征溶剂的选择性如何，溶解度则由相分离因素可以表征溶剂的选择性如何，溶解度则由相似相溶的分子极性所决定。似相溶的分子极性所决定。介电常数是一个化合物摩尔极化程度的量度；通过这介电常数是一个化合物摩尔极化程度的量度；通过这一数值，可预知一个化合物是极性化合物还是非极性化一数值，可预知一个化合物是极性化合物还是非极性化合物。合物。4 4）价格低廉，安全（如无毒、闪点高）价格低廉，安全（如无毒、闪点高）常用：乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇2 2）溶剂与被萃取液的互溶度要小，黏度低，界面
39、张力适中，）溶剂与被萃取液的互溶度要小，黏度低，界面张力适中，对相的分散和相的分离有利；对相的分散和相的分离有利；3 3）溶剂的化学稳定性高，回收和再生容易；）溶剂的化学稳定性高，回收和再生容易；三）影响水相溶质溶解度的因素1 1）离子强度）离子强度 有些物质在高离子强度下溶解度增加，如有些物质在高离子强度下溶解度增加，如DNA-DNA-蛋白；蛋白；有些则在低离子强度下溶解度增加，如有些则在低离子强度下溶解度增加，如RNA-RNA-蛋白；蛋白；绝大多数蛋白质和酶存在绝大多数蛋白质和酶存在“盐溶盐溶”和和“盐析盐析”现象；现象；盐析作用可以降低许多生化产物在水中的溶解度，也盐析作用可以降低许多生
40、化产物在水中的溶解度，也能减少有机溶剂在水中的溶解度。能减少有机溶剂在水中的溶解度。例如：在例如：在V VB12B12的提取中，加入中性盐硫酸铵，有利于的提取中，加入中性盐硫酸铵，有利于V VB12B12自水相转移到有机溶剂中；在提取青霉素时加入自水相转移到有机溶剂中；在提取青霉素时加入NaClNaCl，也有利于青霉素从水相转移到有机溶剂中。也有利于青霉素从水相转移到有机溶剂中。2 2）pHpH3 3）温度温度 温度可改变物质的溶解度，影响分配系数；温度可改变物质的溶解度，影响分配系数；一般生物物质对温度敏感，萃取多在室温或低温下进行一般生物物质对温度敏感，萃取多在室温或低温下进行（通常（通常
41、0-100-10）；）；但也有采用热提取法的（但也有采用热提取法的（50-70 50-70 ），多用于一些小分子），多用于一些小分子生物物质生物物质4 4）带溶剂）带溶剂 带溶剂是一类能和所提取的生物物质形成复合物，而易溶是一类能和所提取的生物物质形成复合物，而易溶于溶剂的物质，且此复合物在一定条件下易分解形成原来的于溶剂的物质，且此复合物在一定条件下易分解形成原来的生物物质。生物物质。提取水溶性强、在常用的有机溶剂中溶解度小的物质时可提取水溶性强、在常用的有机溶剂中溶解度小的物质时可采用添加带溶剂；对于水溶性不强的物质，也可通过带溶剂采用添加带溶剂；对于水溶性不强的物质，也可通过带溶剂提高收
42、率和选择性；提高收率和选择性；例如：链霉素是水溶性较强的碱，可与脂肪酸（如月桂酸）例如：链霉素是水溶性较强的碱，可与脂肪酸（如月桂酸）形成复合物，该复合物能溶于乙醇、醋酸丁酯等，而被萃取形成复合物，该复合物能溶于乙醇、醋酸丁酯等，而被萃取到有机相；到有机相；在酸性条件下，又分解成链霉素而转溶于水相。在酸性条件下，又分解成链霉素而转溶于水相。四）乳化与去乳化 在萃取过程中，经常会出现一种液体分散到另一种本不相在萃取过程中，经常会出现一种液体分散到另一种本不相溶的液体中，即溶的液体中，即乳化现象。乳化现象会造成有机溶剂相和水相分层困难，出现两种夹乳化现象会造成有机溶剂相和水相分层困难，出现两种夹带
43、现象：带现象：一是发酵液提取废液中夹带有机溶剂微粒，导致产品损失；一是发酵液提取废液中夹带有机溶剂微粒，导致产品损失；二是有机溶剂相中夹带发酵液微粒，会将杂质带入产品中。二是有机溶剂相中夹带发酵液微粒，会将杂质带入产品中。油（有机溶剂）、水不溶油（有机溶剂）、水不溶分层分层表面活性剂存在表面活性剂存在 可发生乳化可发生乳化 这类表面活性剂称为乳化剂；这类表面活性剂称为乳化剂；1、乳浊液的成因及稳定条件乳浊液有两种：水包油型水包油型(O/WO/W型型)油滴分散在水中油滴分散在水中 油包水型油包水型(W/OW/O型型)水滴分散在油中水滴分散在油中 由于乳化剂的两性性质，能够将本不相溶的油与水连在一
44、由于乳化剂的两性性质，能够将本不相溶的油与水连在一起，但其分子处在任何一相都是不稳定的，只有处在两相界起，但其分子处在任何一相都是不稳定的，只有处在两相界面上时，亲水基团对着水，疏水基团对向油，在相的界面上面上时，亲水基团对着水，疏水基团对向油，在相的界面上形成单分子层时，比较稳定。乳化剂能够降低表面张力，液形成单分子层时，比较稳定。乳化剂能够降低表面张力，液体容易分散成微滴而发生乳化。体容易分散成微滴而发生乳化。影响乳浊液稳定性的因素包括是否在界面上形成保护膜，影响乳浊液稳定性的因素包括是否在界面上形成保护膜，液滴的带电性质以及介质的黏度；液滴的带电性质以及介质的黏度；在发酵液中，蛋白对表面
45、张力的影响最为显著，随着蛋白在发酵液中，蛋白对表面张力的影响最为显著，随着蛋白含量的增多，表面张力明显下降，由此引起的乳浊液是相当含量的增多，表面张力明显下降，由此引起的乳浊液是相当稳定的。稳定的。CaCOCaCO3 3可被水浸润，但不能被有机溶剂润湿；将乳浊液通可被水浸润，但不能被有机溶剂润湿；将乳浊液通过过CaCOCaCO3 3层层时，乳浊液中的水分则被吸附。时，乳浊液中的水分则被吸附。2、去乳化方法1 1）离心分离法）离心分离法2 2）提高温度）提高温度提高温度可使黏度下降，使乳浊液稳定性降低提高温度可使黏度下降，使乳浊液稳定性降低3 3）稀释法）稀释法4 4）电解质破乳法）电解质破乳法
46、 离子型乳化剂所形成的乳浊液的稳定性，是因其分散离子型乳化剂所形成的乳浊液的稳定性，是因其分散相带有电荷；相带有电荷；加入电解质，可中和其电性，促使聚沉；加入电解质，可中和其电性，促使聚沉；常用常用NaClNaCl、NaOHNaOH、HClHCl、Al Al 3+3+等等5 5）吸附法）吸附法6 6）顶替法）顶替法 加入表面活性更强但不能形成保护膜的物质，将原来的加入表面活性更强但不能形成保护膜的物质，将原来的乳化剂从界面上顶替出来。乳化剂从界面上顶替出来。常用顶替剂有戊醇，其表面活性很强，但碳链很短，不常用顶替剂有戊醇，其表面活性很强，但碳链很短，不能形成保护膜能形成保护膜7 7）转型法）转
47、型法 如果在如果在O/WO/W型乳浊液中加入亲脂性的乳化剂，则乳浊液型乳浊液中加入亲脂性的乳化剂，则乳浊液有从有从O/WO/W转变为转变为W/OW/O型的趋向；但因在转变过程中，其他型的趋向；但因在转变过程中，其他条件还不允许形成条件还不允许形成W/OW/O型乳浊液，而使乳浊液遭到破坏。型乳浊液，而使乳浊液遭到破坏。去乳化剂：去乳化剂：五）萃取方式1 1、单、单级级萃取萃取 多级逆流萃取包括若干萃取级，在第一级中加入料液，并多级逆流萃取包括若干萃取级，在第一级中加入料液，并逐渐向下一级移动，而在最后一级中加入萃取剂，并逐渐向逐渐向下一级移动，而在最后一级中加入萃取剂，并逐渐向前一级移动。前一级
48、移动。料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故得名。料液移动的方向和萃取剂移动的方向相反，故得名。2 2、多级错流萃取、多级错流萃取(multistage cross-flow extraction)multistage cross-flow extraction)由由几个萃取器串联组成，料液经第一级萃取后分离成两个几个萃取器串联组成，料液经第一级萃取后分离成两个相；萃余相流入下一个萃取器，再加入新鲜萃取剂继续萃相；萃余相流入下一个萃取器，再加入新鲜萃取剂继续萃取；萃取相则分别由各级排出，混合在一起，再进入回收取；萃取相则分别由各级排出，混合在一起，再进入回收器回收溶剂，回收得到的溶剂仍作萃取
49、剂循环使用器回收溶剂，回收得到的溶剂仍作萃取剂循环使用。3 3、多级逆流萃取（、多级逆流萃取（multistage counter-current extractionmultistage counter-current extraction）五、离子交换法五、离子交换法(Ion exchange)Ion exchange)一）离子交换树脂的分类 其活性基团一般是磺酸基其活性基团一般是磺酸基(-(-SOSO3 3H);H);由于是强酸性基团，电离程度不受外界由于是强酸性基团，电离程度不受外界pHpH的影响，在的影响，在pH1-14pH1-14范围内均能起交换作用，一般没有使用范围内均能起交换作
50、用，一般没有使用pHpH的限制。的限制。以与以与NaClNaCl的交换为例：的交换为例：R-SOR-SO3 3H+H+NaCl NaCl R-SO R-SO3 3Na+Na+HClHCl 其再生是用其再生是用NaOHNaOH处理并水洗至处理并水洗至pH8-9pH8-9。再用再用HClHCl处理并处理并用水洗至用水洗至pH5pH51 1、强酸性阳离子交换树脂、强酸性阳离子交换树脂2 2、弱酸性阳离子树脂、弱酸性阳离子树脂 以羧基以羧基(-(-COOH)COOH)、酚羟基酚羟基(-(-OH)OH)等为活性基团；等为活性基团；其交换性能与溶液的其交换性能与溶液的pHpH有有很大关系，因为这种树脂的电
