1、Summary from Global Micro Training Material -培养基和配制学习目的Identify the different categories of media used in the lab/识别用于不同实验的培养基Identify the specific media used in each category/识别不同试验中的各种培养基Explain how typical media are made/学习培养基的准备方法Explain how to store media/学习培养基的储存主要内容1.介绍2.实验室使用的培养基3.一般培养基4.选择培
2、养基5.培养基的配制6.培养基的储存微生物实验的重要性充分理解哪些微生物会影响我们的产品只是我们保护我们产品和品牌的第一步;同时,我们必须通过对我们的原料,半成品和最终产品的微生物检测来确保符合公司有关质量和安全的要求.进行微生物实验最重要的手段之一就是是微生物生长的营养培养基.我们会一一介绍 可口可乐公司微生物实验室使用的各种不同种类的培养基,它们的配制和储存,它们如何使用以识别不同的微生物等等第一章培养基我们可能会肉眼看见或者直接闻到一些腐败的现象,我们也可以在显微镜下识别一些微生物,然而,为了了解哪些微生物需要更复杂一些的实验,我们还需要更大的样本量.一般来说,我们通过营养培养基让微生物
3、在实验室 生长.简单来说,培养基就是一种物质,液态的或者固态的,包含一系列微生物生长的营养物质.由于微生物种类繁多,我们有很多不同种类的培养基,每一种都有不同的混合的营养物质或者化学品.培养基让微生物学家能够判断特定微生物种群是否存在或者数量多少.营养培养基分为三个主要类型:一般培养基,选择培养基,差异培养基第二章培养基的分类按照培养基的用途分按照培养基的用途分:普通培养基选择性培养基差异培养基氮源:肉汤提取物,植物提取物,使微生物能获得足够的营养生长碳源:葡萄糖,用以合成所需要的有机物质 缓冲液:中和细菌产生的酸除了氮源,碳源和缓冲液外,还包含一些能够抑制某些生长的化学物质.比如:1)End
4、o琼脂中含有亚硫酸钠可以抑制革兰氏阳性细菌的生长;2)酸化的橙血清琼脂可以减缓非嗜酸细菌的生长可以帮助超过一种目标微生物生长.微生物在这样的培养基上的形态或者颜色是不一样的.在日常操作中,普通培养基和选择性培养基用的比较多按照培养基的形态分按照培养基的形态分:肉汤:常用于增加微生物的数量以达到可检测的水平琼脂(固态)碳水化合物,维生素,矿物质,酸化剂等各种旨在促进微生物生长的物质加入了多聚糖(琼脂).为不同需求而制备,比如:1)商业无菌肉汤用于浓缩液厂来检测主剂,这个配方抑制细菌而让酵母菌正常生长;2)橙血清肉汤包含了橙的组分而使嗜酸的微生物能很好生长琼脂是理想的固化剂:1)大多数微生物不能消
5、化;2)可以和许多营养成分混合;3)也可以通过加入不同的原料满足不同的测试需要第二章普通培养基普通培养基可以用于增菌和计数的检测.增菌是定性的,用于判断微生物的存在与否;而计数则是定量的,可以得到存在微生物的数量.M-TGE and PCA:最常用的普通培养基,可通过薄膜过滤,倾倒平板,或者扩散平板用于固态的琼脂中以计数.pH值在7.0能使非嗜酸微生物很好的生长第三章TTC指示剂M-TGE和PCA都可以用于获得瓶装水中的异养菌和糖样品中的总菌.需要的话,可以使用TTC指示剂,用来改变菌落颜色成红色.第三章选择性培养基选择性培养基能够培养特定的微生物,举例来说,当需要得知酵母菌数量时候,可以选择
6、相应的培养基选择性培养基包含了营养成分和其他某种”允许”生长物质,可能包含一些抑制剂来防止可能影响实验的微生物的生长.选择性培养基可以用来识别酵母菌和霉菌,嗜酸细菌,和其他细菌,比如大肠菌群.第四章霉菌和酵母菌M-Green:含有丰富的蛋白胨非常有利于微生物生长 pH 4.6抑制了大部分细菌的生长溴甲酚绿(pH=3.8时呈黄色，pH=5.4时呈蓝绿色，pH=4.5时开始有颜色的明显变化)是指示剂,大部分菌落被里面的色素变成率绿色,酸性物质扩散到培养基把它变成黄色.第四章霉菌和酵母菌培养基酸化培养基酸化培养基RBCA橙血清琼脂(OSA),土豆葡萄糖琼脂(PDA),麦芽提取物琼脂(MEA)孟加拉红
7、氯霉素选择性培养基是最常用的检测果汁里的总嗜酸菌的培养基.pH5.5的OSA和5.6的PDA&MEA比较高,不能有效抑制大部分细菌,所以使用酸化的方法来有效的分析嗜酸菌一般酒石酸用来酸化OSA和PDA,而对于MEA,乳酸和酒石酸都可以用最终的pH为4.2-4.4仅限于霉菌测试,一般用于空气样品.含有氯霉素以抑制细菌生长孟加拉红抑制霉菌的大小和扩散,并且把菌落染成粉红色第四章耐热霉菌/耐热细菌耐热霉菌耐热霉菌 (HRM)(HRM)耐热细菌耐热细菌 (TAB)(TAB)一些霉菌孢子能够抵抗巴氏灭菌过程而存活于饮料中.为了了解耐热霉菌是否存在,我们需要取少量样品到肉汤培养基并加热灭活,通过一定的培养
8、(时间温度),观察霉菌存在与否;需要计数的话,酸化的MEA,PDA,OSA都可以使用.有时候样品中会存在耐热细菌,一般称为嗜热嗜酸菌(TAB).根据样品的不同,薄膜法或扩散平板法都可以用来测试TAB.合适的培养基是BAT和YSGBAT:主要用来检测脂环酸芽胞杆菌.通过支持脂环酸芽胞杆菌的生长,低pH值和高的培养温度有效抑制了其他细菌的生长第四章大肠菌群Endo,Tergitol-7,Chormocult,Colilert 和Readycult 都可以用来定性或定量地检测大肠菌群.大肠菌群的存在表示了糟糕的卫生情况,可能是由不充分的消毒或者没有很好执行GMP的要求.这些细菌有三个主要来源:水植物
9、性物质动物动物污染产生粪大肠,能出现在水体或者植物中如果数量较大,种类又特别,大肠菌群的存在可能会引起公共卫生事件第四章大肠菌群的培养基-EndoEndo培养基使用乳糖作为碳源,硫酸品红还区别不同的微生物,亚硫酸钠和品红来抑制其他微生物的生长.M-Endo则含有十二烷基硫酸盐和脱氧胆盐作为抑制剂.当使用Endo培养基时,菌落显示带有绿色金属光泽的红色.如果结果呈阳性,则需要进一步确定其存在和种类在一些情况下,在Endo培养基上会有假阳性或者假阴性出现.比如:阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)在培养基上不会出现特征的金属光泽(假阴性);而食酸丛毛单胞菌(Comamonas a
10、cidovorans)会发出金属光泽(假阳性)第四章大肠菌群的培养基 Tergitol-7/Chromocult Tergitol-7 with TTCChromocult 可用于定性或者定量实验 碳源:乳糖 pH指示剂:溴百里酚蓝,pH6.0(黄)7.6(蓝)抑制剂:Tergitol-7,能够减缓革兰氏阳性菌和阴性菌的生长 菌落呈现黄色,桔色或者砖红,并在薄膜底部有黄色环.如果是阳性结果,需要进一步确定其存在和种类 可用于定性或者定量实验 抑制剂:Tergitol-7,能够减缓革兰氏阳性菌和阴性菌的生长 差异试剂:半乳糖苷和葡糖苷酸 大肠菌群存在时呈现红色 假如存在大肠埃希菌,则呈现深蓝或者
11、紫色 如果是阳性结果,需要进一步确定其存在和种类第四章大肠菌群的培养基Colilert(R)Readycult定性试验,用于水的测试可以用于同时检测大肠菌群和大肠埃希氏菌差异试剂:-D-半乳糖苷酶(galactosidase)and-D-葡萄糖醛酸苷酶(glucuronidase)抑制剂:ONGP(o-Nitrophenyl-D-Galactopyranoside,邻硝基苯-D-半乳吡喃糖苷)和MUG(nitrophenyl-D-glucuronide,(4-硝基苯基)-D-葡糖苷酸)大肠菌群生长会把ONGP变成黄色,同时,大肠埃希氏菌会代谢MUG产生荧光.定性试验,用于水的测试可以发光/荧光
12、物质用于同时检测大肠菌群和大肠埃希氏菌同样的,差异试剂是-D-半乳糖苷酶和-D-葡萄糖醛酸苷酶 抑制剂:X-GAL(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside或5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside)和MUG总大肠菌群呈现蓝绿色,而大肠埃希氏菌则呈现蓝绿色并带有荧光第四章肠球菌肠球菌也是我们关心的一类微生物,常用来定性或者定量的培养基有:S&B(Slanetz and Bartley),BEA(Bile-Esculin-Azide),和Enterolert(R)第四章S&BBEA Enterolert(
13、R)抑制剂:叠氮化钠来抑制革兰氏阴性菌的生长差异试剂:TTC(氯化三苯基四氮唑)培养过程中,肠球菌会还原TTC成甲瓒(一种紫蓝色结晶物)如果是阳性结果,需要用BEA进一步确定 抑制剂:胆汁来抑制革兰氏阳性菌的生长,叠氮化钠来抑制革兰氏阴性菌的生长 差异试剂:七叶苷和柠檬酸铁铵 肠球菌能水解七叶苷为葡萄糖和七叶 而七叶,能与三价铁形成黄褐色或黑色的物质,从而在培养基上显现 含有-葡萄糖苷酶,当肠球菌存在时,酶代谢成为4-甲基-伞形-D-葡糖苷(4-methyl-umbelliferyl-D-glucoside),并产生荧光 对于原水,厂内用水,瓶装水中的肠球菌检测非常有效乳酸杆菌MRS medi
14、umRogosa medium 全称:de-Man,Rogosa,Sharpe medium抑制剂:乙酸钠来抑制其他细菌的生长,但是有些乳杆菌目的细菌可能会生长碳源/氮源:酵母肉汤提取物含有更高的醋酸含量以及低的pH值来压制其他乳酸菌的生长菌落呈现灰白色小点,平滑或者突起,或光滑,或粗糙.第四章其他培养基Cetrimide medium(溴棕三甲铵)tryptose sulfite agar绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌(sulfite-reducing clostridia)抑制剂:西曲溴胺和酮酸菌株呈现蓝绿色,即绿脓
15、菌素时,绿脓杆菌存在的可能性为90%;而当荧光存在时,有98%的可能性一般用来检测天然矿泉水差异试剂:亚硫酸盐和柠檬酸铁铵梭状芽胞杆菌产生硫化氢与亚硫酸盐和铁盐反应,产生黑色的菌落并把菌落边缘染成黑色第四章培养基的配制培养基可以是实验室配制的也可以是市售的(放在培养皿中),后者使用方便但是价格比较高必须从有着良好声誉的生产商采购并且根据供应商要求来储存,使用和安全注意事项混合干粉培养基:使用去离子水或者蒸馏水配制并调节pH值,或者加入所需要的抑制剂.严格按照供应商的说明来配制培养基,混合,灭菌(时间温度)等,并编好批号以方便使用严格按照供应商注明的规程使用,有些物质有刺激性,需要防尘口罩和手套
16、来防止吸入粉末以及皮肤接触有效期:使用前,必须保证日期没有超过瓶上注明的有效日期;一旦开瓶使用,建议6个月内用完质量管理:配置完成后,培养基批号,配制日期必须要记录,并且应与样品的分析相对应.另外,其他指标,比如pH,颜色,数量(体积)也应该被记录在案第五章培养基的储存培养基需要妥善保存以避免污染和失效,建议遵照供应商的说明.吸湿的和对于光和热敏感的培养基需要保持凉爽并避免接触水分和光线采购的培养基需要确认过期日期并记录实验室收货日期,以杜绝过期培养基.按照批号顺序使用并记录开瓶日期旧瓶用完再开新瓶储存于密闭容器,保持温度在300C以下,液体培养基,通常需要冷藏储存前,液体培养基需要冷却并盖紧瓶盖,需要加入热不稳定的物质时,培养基需要冷却到430Cto 470C加入培养基不能自由流动时,应抛弃不能使用固体培养基,配制完成应尽快使用额外多配的培养基应冷藏(不能冷冻),使用前溶解.琼脂培养基一般在密闭瓶中以避免水分流失,储存于30C to 70C第六章
