1、微生物培训教材微生物培训教材制制 作作 人：人：罗蝶影罗蝶影制作日期：制作日期：20152015年年4 4月月1 1日日微生物检测一般企业自检的微生物检验项目主要有：菌落总数大肠菌群霉 菌、酵母菌微生物名词解析菌落总数食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和时间）培养后，所得每检样中形成的微生物菌落总数（单位为cfu/g）。主要反映食品的新鲜度、被细菌污染的程度以及在加工过程中细菌繁殖状态，是判别食品卫生质量的依据。从食品卫生观点看，食品中菌落总数越多，说明食品质量越差，病原菌污染的可能性越大。但是菌落少不能代表食品质量好，曾报道，市面上售出的一批冰蛋制品中，检出菌落总数在5000
2、cfu/g以下的样品和菌落总数在380cfu/g的样品中，均可分离出沙门氏菌（致病菌）和测出大肠菌群。一些菌落总数低的食品（如腌制品），曾有细菌繁殖并产生毒素，由于食品环境限制细菌生长，但毒素因性状稳定不受影响，仍在食品保留。微生物名词解析大肠菌群大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要来源为人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。它反映了食品是否被粪便污染，同时推断食品中是否有肠道致病菌污染的可能。食品中的大肠菌群数是每100g检样内大肠菌群最可能数（The most probable number，简称MPN）表示，即MPN/100g（
3、2003年版本）微生物名词解析霉菌、酵母菌霉菌和酵母菌广泛存在于环境中，在食品中可以作为正常菌相的一部分或作为空气传播性污染物。部分加工食品中允许霉菌的存在。饼干霉菌50cfu/g，月饼霉菌100cfu/g。各类食品遭受霉菌和酵母菌的侵袭，常常发生霉坏变质，其有毒代谢物引起各种急性和慢性中毒，特别是一些霉菌毒素具有强烈的致癌性（如黄曲霉毒素）。实验证明，一次大量摄入或多次少量摄入，皆能诱发癌症。已知产毒霉菌类型有青霉、曲霉和镰刀霉等。霉菌和酵母菌是每1g检样中所含霉菌和酵母菌菌落总数。（单位为cfu/g）检测对应培养基菌落总数-平板琼脂-GB 4789.2-2010 食品安全国家标准 食品微生
4、物学检验 菌落总数测定大肠菌群-乳糖胆盐-4789.3-2003食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数生活水质大肠菌群-乳糖蛋白胨-GB 15979-1995 一次性使用卫生用品卫生标准霉菌、酵母菌-马铃薯培养基、孟加拉红培养基-GB 4789.15-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数生理盐水-0.85%微生物检测方法谨记一个原则无菌操作无菌操作所有检验操作尽量减少被细菌污染的可能性，检验前，无菌室、操作平台和空间必须经过灭菌，所有与样品接触的用具均要经过灭菌，食品的外包装也需经过消毒。检验过程要求快速、准确，减少被空气中或检验员自身的物质污染微生物检测方法
5、一）样品分类一）样品分类大样：一整批样品。中样：整批样品中采集代表性混合样品，一般约为200g。小样：做分析用样品，也称“检样”，一般为25g。二）采样工具二）采样工具药匙、剪刀、采样袋、试管、广口瓶、镊子、棉签，平皿必须是无菌；应放在特定容器或用合适材料（如牛皮纸、铝箔纸等）包裹或加塞，保证灭菌效果；三）无菌室消毒（依据三）无菌室消毒（依据GB/T 27405-2008GB/T 27405-2008）紫外线消毒：无菌室保持清洁干燥，作用时间30min，关闭紫外灯至少30min后，方可入内作业。臭氧消毒：封闭无菌室，采用20mg/m3 浓度，作用时间30min，消毒后浓度 0.2mg/m3 浓
6、度时，方可入内作业。微生物检测方法四）灭菌方法（依据四）灭菌方法（依据GB/T 27405-2008GB/T 27405-2008）培养基：培养基：通常使用高压湿热灭菌法121 15min，特殊（如 含糖培养基，115 20min）。器具和设备：器具和设备：湿热灭菌：湿热灭菌：高压灭菌锅，121 20min，如玻璃器皿、一次性用品等；干热灭菌：干热灭菌：干燥箱，160 2h，180 1h，适用玻璃器皿、不锈钢用具等；液体消毒剂消毒：液体消毒剂消毒：适量浓度自配消毒剂（如 75%酒精），对工作台面、器具或设备表面进行消毒；PS：芽孢是最顽强的细菌休眠体，是灭菌标准的主要依据，肉毒梭菌的芽孢在PH
7、7.0时，121 需10min才能杀死，嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢，121 需12min才能杀死，因此规定湿热灭菌在121 下至少15min才能算达到无菌要求。菌落总数测定搅 拌1ml1ml1ml稀释度0.1稀释度0.01固体产品固体产品液体产品液体产品225ml稀释液（0.85%生理盐水）25g25ml9ml稀释液（0.85%生理盐水）每个稀释度2个平皿每皿加入15-20ml平板琼脂菌落计数36 1 ，48 2h混匀、凝固后倒放报告菌落总数测定注意事项注意事项u平板琼脂低于40度会开始凝固，故使用前需水浴保温在（46 1）。u为确保试验结果有效，要有对照平板，观测 生理盐水、琼脂和工作台暴露空气
8、是否无菌和受到污染。平皿加入检液后，应在20min内加入琼脂，并混合均匀。u皿内琼脂凝固后，将平皿倒置放入培养箱进行培养，避免菌落蔓延生长及冷凝水落到培养基表面影响菌落形成。u平板培养方法得出的菌落总数，只是检出生长的活菌，不能检出样品中全部的细菌数，培养结果要比食品中实际细菌数少。u习惯进出玻璃瓶或试管时，不要接触到瓶口或试管外侧，避免污染。u吸管插入吸液内不能低于液面2.5cm，往试管加液时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液。u培养条件是根据食品种类而定，大部分食品如饼干为36 1 ，48 2h，特殊如水产品类用30 1 ，723h。菌落总数测定菌落计数菌落数菌落数菌落计数菌落计数菌落
9、总数菌落总数30-300具体数值1个稀释度菌落数在此范围=该稀释度平均菌落数稀释倍数2个连续稀释度菌落数在此范围=所有平板菌落数之和（低稀释度平板个数+0.1高稀释度平板个数）低稀释度30具体数值300多不可计所有30最低稀释度的平均菌落数稀释倍数所有300最高稀释度的平均菌落数稀释倍数所有=01最低稀释倍数所有不在30-300最接近30或300的平均菌落数稀释倍数菌落总数测定菌落报告菌落总数菌落总数菌落总数正式书写报告菌落总数正式书写报告100按“四舍五入”，整数报告100第3位数字采用“四舍五入”，取2位数字，后面全用0代替，也可用10的指数表示，仅留2位有效数字蔓延无法计数菌落蔓延空白对
10、照有菌落此次检测结果无效菌落总数测定举例举例例次例次稀释度及菌落数稀释度及菌落数菌落总数菌落总数报告方式报告方式10-110-210-311365164201640016 000或1.610422760295463100031 000或3.110432890271603009130 000或3.01044多不可计4560513513000513000或5.1105527115270270 或2.71026000110107多不可计305123050031 000或3.1104例例3 3：2 2个连续稀释度菌落数在个连续稀释度菌落数在30-30030-300之间：之间：菌落总数菌落总数=（295
11、295 2+46 2）（2+0.1 2）10-2 ）=31000=31000混匀36 1 ，18-24h36 1 ，24 2h搅 拌固体产品固体产品液体产品液体产品225ml稀释液（0.85%生理盐水）25g25ml乳糖胆盐发酵管产气不产气报告大肠菌群阴性革兰氏染色乳糖复发酵管伊红美蓝琼脂平板不产气报告大肠菌群阴性产气报告大肠菌群阳性革兰氏阴性无芽孢杆菌革兰氏阳性报告大肠菌群阳性36 1 ，24 2h混匀大肠菌群测定大肠菌群测定注意事项注意事项u2003版本的大肠菌群测定法采用三步法（初发酵、分离培养和证实试验）。u第一步初发酵是样品发酵的结果，不是纯菌的发酵试验。所以初发酵产气阳性管，经过后
12、面两步法后，可能为阴性。很多实验证明，初发酵产气管，第三步证实试验后可能为阴性。u在伊红美蓝培养基上，要挑取典型、正确的菌落，故需熟悉大肠菌群在伊红美蓝上的菌落形态（如呈紫黑色有或无金属光泽、中心色较深的菌落）u在初发酵管中，产气量的大小与大肠菌群的检出率呈正相关，有时候套管内无气体，但是在液面或管壁有小气泡缓缓上升，此时我们可以用手轻敲或摇动试管，如果出现有气泡上升，应列为可疑阳性，做进一步的证实试验。u初发酵中出现产酸变色无产气现象，大量试验证明，可能做进一步的证实试验后为大肠菌群阳性。做证实试验时应考虑在内。大肠菌群测定MPN检索表部分截图如下：u MPN表只提供3个稀释度，即：1ml(
13、g)、0.1ml(g)、0.01ml(g)；若改用10ml(g)、1ml(g)、0.1ml(g)，则表内数字相应增加10倍。其他同理类推。uMPN表中提供的稀释度是指原样品的量，而非稀释后的浓度，对固体样品要更加注意。如固体样品1g放入9ml的生理盐水（10倍稀释）后，虽加入1ml量样品稀释液，但实际其中只含0.1g样品，应按0.1g计。u按相应的浓度产生的阳性管，对应MPN检索表，查的在95%可信度下的大肠菌群最可能数量为？MPN/100g。u举例：1ml(g)无阳性管、0.1ml(g)无阳性管、0.01ml(g)出现一支阳性管，查上表（MPN检索表）得出该样品的大肠菌群为30MPN/100
14、g。9 9 管管 法法大肠菌群最可能数大肠菌群最可能数(MPN)(MPN)检索表检索表阳性管数阳性管数MPN 100ml(g)MPN 100ml(g)95%95%可信限可信限1ml(g)1ml(g)3 30.1ml(g)0.1ml(g)3 30.01ml(g)0.01ml(g)3 3下限下限上限上限0 00 00 030300 00 01 130305 590900 00 02 260600 00 03 390900 01 10 030305 5130130霉菌、酵母菌测定搅 拌1ml1ml1ml稀释度0.1稀释度0.01固体产品固体产品液体产品液体产品225ml稀释液（0.85%生理盐水）2
15、5g25ml9ml稀释液（0.85%生理盐水）每个稀释度2个平皿每皿加入15-20ml马铃薯葡萄糖琼脂或孟加拉红培养基菌落计数281 ，5d混匀、凝固后倒放报告霉菌、酵母菌测定注意事项注意事项u霉菌、酵母菌的检测方法与菌落总数的检测方法大体一样，仅培养基与培养条件不同。u霉菌、酵母菌的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基、孟加拉红培养基。u培养条件为28 1 ，5d。u平板培养方法得出的菌落总数，单位与菌落总数一致，皆为cfu/g。u挑选菌落总数在10-150cfu之间的平板计数。u若所有平板菌落数150cfu，则对稀释度最高的进行计数，取其平均菌落数。其余记为“多不可计”。u若所有平板菌落数10c
16、fu，则对稀释度最低的进行计数，取其平均菌落数。u报告形式与菌落总数同理。环境微生物监控项目生产工序监控：人员手、台面、空间环境-GB15979 一次性使用卫生用品卫生标准生产水质-GB5749 生活饮用水卫生标准产品监控：饼干-GB7100 饼干卫生标准月饼-GB7099 糕点、面包卫生标准微生物检测限值对照检测项目内控标准限值(可调)国家标准限值菌落总数菌落总数（cfu/ml）大肠菌群大肠菌群（MPN/100ml）菌落总数菌落总数（cfu/ml）大肠菌群大肠菌群（MPN/100ml）加工人手表面加工人手表面200 不得检出不得检出300 不得检出不得检出台面、包材台面、包材10不得检出不得
17、检出20不得检出不得检出空气空气内包区：内包区：1000其余区：其余区：2000-2500-生产水质生产水质80不得检出不得检出100不得检出不得检出饼干饼干500不得检出不得检出非夹心：非夹心：750夹心：夹心：200030月饼月饼1000不得检出不得检出150030备注备注如下页所示微生物检测工作详表监控工序监控工序检验项目检验项目培养基类型培养基类型样品数量样品数量培养基总量培养基总量（ml）使用工具使用工具加工人手表加工人手表面面菌落总数菌落总数平板琼脂平板琼脂20800生理盐水生理盐水10ml试管试管20个、个、棉签棉签20个、平皿个、平皿40个个大肠菌群大肠菌群乳糖胆盐乳糖胆盐20
18、1000（单料）（单料）60ml试管试管20个个装装50ml台面、包材台面、包材菌落总数菌落总数平板琼脂平板琼脂8320生理盐水生理盐水10ml试管试管8个、棉个、棉签签8个、平皿个、平皿16个个大肠菌群大肠菌群乳糖胆盐乳糖胆盐8400（单料）（单料）60ml试管试管8个个装装50ml空气空气菌落总数菌落总数平板琼脂平板琼脂4400平皿平皿20个个生产水质生产水质菌落总数菌落总数平板琼脂平板琼脂4160空锥形瓶空锥形瓶4个，平皿个，平皿8个个大肠菌群大肠菌群乳糖蛋白胨乳糖蛋白胨4200（双料）（双料）400（单料）（单料）20ml试管试管20个个装装10ml、10ml试管试管40个个饼干饼干菌
19、落总数菌落总数平板琼脂平板琼脂10400生理盐水锥形瓶生理盐水锥形瓶10个个装装225ml，平皿，平皿20个、个、剪刀剪刀、镊子镊子、吸管吸管、移液枪移液枪、油油性笔、电子称性笔、电子称大肠菌群大肠菌群乳糖胆盐乳糖胆盐10300（双料）（双料）600（单料）（单料）20ml试管试管30个个装装10ml、10ml试管试管60个个月饼月饼霉菌霉菌马铃薯葡萄糖或马铃薯葡萄糖或孟加拉红孟加拉红5200平皿平皿10个个配制工作第一步准备采样工具（棉签、4个250ml空锥形瓶）和操作工具（10个药匙、2把剪刀、2个镊子、吸量管或移液枪吸管）检验工具（104个平皿）干热或湿热灭菌第二步配制0.85%无菌生理
20、盐水3000ml（如8.5g氯化钠+1000ml蒸馏水）分装12个锥形瓶，每瓶225ml。分装28支10ml试管，每支10ml。121 20min湿热灭菌第三步配制单料单料乳糖胆盐1400ml（如35g乳糖胆盐+1000ml蒸馏水）分装28支60ml试管，每支50ml。配制双料双料乳糖胆盐300ml（如35g乳糖胆盐+1000ml蒸馏水）分装30支20ml试管，每支10ml。121 20min湿热灭菌第四步配制单料单料乳糖蛋白胨200ml（如23g乳糖蛋白胨+1000ml蒸馏水）分装20支20ml试管，每支10ml。配制双料双料乳糖胆盐200ml（如46g乳糖蛋白胨+1000ml蒸馏水）分装2
21、0支10ml试管，每支10ml。115 20min湿热灭菌第五步配制平板琼脂2000ml（如23.5g平板琼脂+1000ml蒸馏水）分装4个500ml锥形瓶，每瓶500ml。121 20min湿热灭菌现场采样工作第一步准备采样工具（棉签、4个空锥形瓶、10ml无菌生理盐水28支（采样管）、225ml无菌生理盐水2瓶（用于湿润棉签）和操作工具（2个镊子、2个酒精灯、2个试管架、2个不锈钢方框）使用前用酒精消毒第二步配制75%食用酒精1000ml（可用酒精计），分装到1个700ml玻璃瓶中，和2个200ml玻璃瓶。把2个不锈钢方框和适量棉球放入酒精内。酒精会挥发，配制需快速第三步员工手指员工手指：
22、把以上工具放入采样篮中，带到生产现场操作。选定操作台面，先用酒精擦拭台面，把采样工具放在台面，用棉签湿润生理盐水，后涂抹员工右手曲面，从指尖到指端，来回10次。去掉手接触部分，放入采样管。员工检验前不可洗手消毒，所有操作需在酒精灯前完成第四步操作台面（操作台面（包材包材）：把不锈钢方框放在检测台面（包材）（包材）上，用棉签湿润生理盐水后，在其内涂抹10次。去掉手接触部分，放入采样管。放入采样管的操作需要在酒精灯前完成第五步生产水质生产水质：到检验指定位置，让水自流5分钟后，迅速打开灭菌空锥形瓶，接入约250ml水，立刻加塞捆绑。尽量避免其他污染微生物培养培养项目培养项目使用培养基使用培养基使用使用器具器具培养时间培养时间培养温度培养温度计数方式计数方式菌落总数平板琼脂2平皿482h36 1 平板计数大肠菌群乳糖胆盐9试管242h36 1 产气管数量查MPN表水质大肠菌群乳糖蛋白胨15试管242h36 1 产气管数量查MPN表霉菌、酵母菌马铃薯葡萄糖、孟加拉红2平皿5天28 1 平板计数
