1、免疫组化原理和流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍一一.发展简史发展简史19411941年年 Coons Coons 首先用荧光素标记抗体首先用荧光素标记抗体检测检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功。肺组织内的肺炎双球菌获得成功。6060年代年代 AkankeAkanke建立酶标抗体技术建立酶标抗体技术铁蛋白铁蛋白标记标记AbAb技术。技术。7070年代年代 Stemberger Stemberger 改良上述技术，建立辣根改良上述技术，建立辣根过氧化物酶过氧化物酶抗体过氧化物酶（抗体过氧化物酶（PAPPAP）技术，）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。使免疫细胞化学得到广泛应用。免
2、疫组化原理和流程介绍28080年代年代 Hsu Hsu 等建立了抗生物素等建立了抗生物素生素生素（ABCABC）法之后，免疫金）法之后，免疫金银染色法、半抗银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。原标记法、免疫电镜技术相继问世。9090年代年代 分子杂交技术、原位杂交技术、免分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展。疫细胞化学分类方法迅速发展。20002000年年 各种免疫组化技术更加成熟，使免各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功疫组化技术成为当今生物医学中形态、功 能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范
3、围深达医学各个学科，是目前生命科学工作围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。者应该掌握的基本技术之一。免疫组化原理和流程介绍3免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 二二 免疫组化的原理免疫组化的原理 免疫组织化学又称免疫细胞化学，免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术性、定位、定量测定的一项新技术。免疫组化原理和流程介绍4免疫组化原理及流程介绍免疫组
4、化原理及流程介绍 它把免疫反应的特异性、组织化学的它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包包括荧光显微镜、电子显微镜括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等原体以及受体等)。免疫组化原理和流程介绍5三三 免疫组化的基本流程免疫组化的基本流程免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化2.细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 3.3.抗原修复、暴抗原修复、
5、暴露抗原决定簇露抗原决定簇 4.4.封闭非特异性封闭非特异性蛋白蛋白 5.5.一抗孵育一抗孵育 6.6.二抗孵育二抗孵育 7.SP 7.SP 反应反应 8.8.显色显色 9.9.复染、脱水、复染、脱水、透明、封片透明、封片 2.2.细胞通透、封细胞通透、封闭内源性过氧化闭内源性过氧化物酶物酶 免疫组化原理和流程介绍6免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.1.脱蜡与水化脱蜡与水化 脱蜡与水化的脱蜡与水化的目的目的是确保抗体等其是确保抗体等其他试剂能够充分与组织中抗原等结合发他试剂能够充分与组织中抗原等结合发生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶生反应。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗
6、不全，而产生非特异性背性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。景着色。免疫组化原理和流程介绍71)60 20 minXylene：2 10 minutes；2)100%absolute ethanol：2 5 minutes；3)95%ethanol 2 minutes；4)80%ethanol 2 minutes；5)70%ethanol 2 minutes；6)distilled water:5 min；7)PBS 洗 3 3 min。具具体体操操作作免疫组化原理和流程介绍8免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍2.2.细胞通透与封闭内源性过氧化酶细胞通透与封闭内源性过氧化酶 目的
7、是使抗体能够充分地进入胞内目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。一般用进行结合反应。一般用Triton X-100Triton X-100、蛋白酶蛋白酶k k等通透液。等通透液。(1)(1)细胞通透细胞通透免疫组化原理和流程介绍9免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(2)(2)封闭内源性过氧化酶封闭内源性过氧化酶 其主要目的是降低内源性过氧其主要目的是降低内源性过氧化物酶的活性。在传统的化物酶的活性。在传统的ABCABC法和法和SPSP法中，免疫组化反应结果容易受到法中，免疫组化反应结果容易受到内源性过氧化物酶的干扰，必须用内源性过氧化物酶的干扰，必须用过氧化氢等进行灭活。过氧化
8、氢等进行灭活。免疫组化原理和流程介绍101)1)用封闭通透液浸润切片用封闭通透液浸润切片 30 min30 min（RT RT 避避光）。光）。其配法是用预热其配法是用预热 40 ml PBS 40 ml PBS 加加120ul 120ul TritonX-100 TritonX-100 加热几分钟，在临用前加加热几分钟，在临用前加 400 ul400 ul的的3030H H2 2O O2 2。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作具体操作:免疫组化原理和流程介绍11免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介
9、绍3.3.抗原修复抗原修复 暴露抗原决定簇暴露抗原决定簇 由于组织中部分抗原在甲醛或多由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原性；通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。免疫组化原理和流程介绍12免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 常用的修复方法从强到弱一般常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压修复、微波修复、分为三种，高压修复、微波修复、胰酶修复。胰酶修复。抗原修复的主要方法抗原
10、修复的主要方法:酶消化方法酶消化方法一般用于细一般用于细胞内抗原胞内抗原应用高频电磁波应用高频电磁波打开蛋白质间的打开蛋白质间的交联键交联键免疫组化原理和流程介绍13免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍将切片放入将切片放入 0.01 M 0.01 M 柠檬酸钠缓冲柠檬酸钠缓冲 溶液（溶液（pH6.0pH6.0）后，在微波炉里高火）后，在微波炉里高火 4 min 4 min 至沸腾后，取出，冷却至室温，至沸腾后，取出，冷却至室温，再加热，约再加热，约4 4次，每次间隔补足液体，次，每次间隔补足液体，防止干片。防止干片。2)PBS 2)PBS 溶液洗溶液洗 3 3 次次3 min3 min
11、。具体操作（微波修复）：具体操作（微波修复）：1)免疫组化原理和流程介绍14免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍4.4.封闭特异性蛋白封闭特异性蛋白组织切片上有些组织切片上有些剩余剩余的位点可以与一的位点可以与一抗抗非特异性结合非特异性结合，造成后续结果的，造成后续结果的假假阳性阳性。封闭血清一般是和二抗同一来源的，血封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中有一些动物自身的抗体，预先能和清中有一些动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合。组织中有交叉反应的位点发生结合。免疫组化原理和流程介绍15免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 将切片取出将切片取出,周围水分用滤
12、纸吸干周围水分用滤纸吸干,用组化用组化笔在组织周围画上圈笔在组织周围画上圈,在圆圈内组织滴入在圆圈内组织滴入 5%5%羊羊血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中血清（与二抗来源一致）后放入湿盒中,室温室温 (约约30)30)下下101030min30min。具体操作：具体操作：大一点免疫组化原理和流程介绍16免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍5.5.一抗孵育一抗孵育一抗一抗:可以特异结合底物，就是识别出可以特异结合底物，就是识别出我们想要检测的东西。一抗和底物结我们想要检测的东西。一抗和底物结合与否用肉眼是看不出来的。合与否用肉眼是看不出来的。免疫组化原理和流程介绍17 一抗孵育条件在免
13、疫组化反应中最重要，一抗孵育条件在免疫组化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度。包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种：一抗孵育温度有几种：4 4度、室温、度、室温、3737度，度，其中其中4 4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般体浓度有关，一般3737度度1-2h1-2h，然后，然后4 4度过夜和度过夜和从冰箱拿出后从冰箱拿出后3737度复温度复温45min45min。具体条件还要。具体条件还要摸索。摸索。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1.防止脱片；防止脱片；2.使抗原使抗原抗体结合更稳定。抗体结合更稳定。免疫组化原理和流程
14、介绍18 甩去切片上的羊血清甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周用滤纸擦干组织周围残留血清，直接加入已稀释的一抗（围残留血清，直接加入已稀释的一抗（1 1：250250、500500、10001000）后，放入湿盒中室温）后，放入湿盒中室温 1 1 小时，然后小时，然后 4 4 度过夜，冰箱中取出后需度过夜，冰箱中取出后需37 37 复温复温 45 min45 min。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体做法：具体做法：免疫组化原理和流程介绍19免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍6.6.二抗孵育二抗孵育二抗二抗:可以和一抗结合，并带有可以被可以和一抗结合，并带有可以被检测
15、出的标记检测出的标记(如带荧光、放射性、化如带荧光、放射性、化学发光或显色基团），作用是检测一抗。学发光或显色基团），作用是检测一抗。免疫组化原理和流程介绍20 二抗孵育条件：二抗一般室温或二抗孵育条件：二抗一般室温或3737度度30min-1h30min-1h，具体时间需要摸索。，具体时间需要摸索。但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度但在免疫组化中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓度和孵育时间。孵育时间。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理和流程介绍21 1)1)将一抗倒掉并用将一抗倒掉并用 PBS PBS 洗洗 5
16、 min5 min5 5 次；次；2)2)用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放入稀释的二抗后放入 3737恒温烤箱中恒温烤箱中 30 min。3)3)用用 PBS PBS 洗洗 5 5 次次5 min 5 min 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍具体操作：具体操作：免疫组化原理和流程介绍227.SP7.SP反应反应 SP SP染色法即染色法即链霉素抗生物素蛋白链霉素抗生物素蛋白 生物素过氧化酶连接法。生物素过氧化酶连接法。该法是该法是ABCABC法基础上的进一步改良，法基础上的进一步改良，使卵白素与链霉（而非生物素）结合，使卵白素与链霉（而
17、非生物素）结合，而后再结合而后再结合POPO基。基。免疫组化原理和流程介绍23 免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍1 1）加入加入 SP SP 复合液后放入复合液后放入 37 37 度烤箱中度烤箱中 30 min。2 2）用用 PBS PBS 洗洗 5 次次5 min。具体操作：具体操作：SPSP染色法的特点染色法的特点:灵敏特异性低，成本低。灵敏特异性低，成本低。免疫组化原理和流程介绍24免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍8.8.显色显色 在免疫组化中，由于抗原抗体所在免疫组化中，由于抗原抗体所形成的复合物本身没有颜色，不能形成的复合物本身没有颜色，不能直接观察，只能借助
18、于其他某些化直接观察，只能借助于其他某些化学基团的显色作用，是复合物显色，学基团的显色作用，是复合物显色，有利于显微镜下观察有利于显微镜下观察。免疫组化原理和流程介绍25免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 通常在过氧化物酶（通常在过氧化物酶（HRPHRP）法中，显）法中，显色剂为色剂为DABDAB。DAB(3,3-二氨基联苯胺显色液二氨基联苯胺显色液)配法配法:DAB 50mg 0.05M TB 100ml 30%H2O2 30-40ulABC 法SP法PAP法免疫组化原理和流程介绍26免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍9 9、复染、脱水、透明、封片、复染、脱水、透明、封片
19、 复染：目的是形成细胞轮廓，从而更复染：目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂好地对目标蛋白进行定位，经常用的试剂为苏木素。为苏木素。片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸片子复染完后流水振洗，然后置于盐酸酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水酒精中数秒（一定动作要快）后拿出流水振洗，在放入氨水中返蓝即可。振洗，在放入氨水中返蓝即可。免疫组化原理和流程介绍27 1)1)用用 PBS 3 PBS 3 次次3min 3min 后，用双蒸水洗后，用双蒸水洗 5 min5 min；加；加一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜一大滴苏木素染液，（胞核蛋白染几秒，胞浆或胞膜蛋白染
20、蛋白染 20 s 20 s），自来水冲洗，双蒸水洗），自来水冲洗，双蒸水洗 5 min5 min，再，再用用 PBS PBS 返蓝返蓝 5 min5 min。2)2)脱水脱水：50%ethanol(1-2)min;70%ethanol(1-2)min;95%ethanol（1-2）min；95%ethanol（1-2）min；100%absolute ethanol:(1-2)min；100%absolute ethanol:(1-2)min。3)3)透明：透明：Xylene 1(1-2)minXylene 2(1-2)min 4)4)封片：中性树胶。封片：中性树胶。免疫组化原理及流程介绍免疫
21、组化原理及流程介绍免疫组化原理和流程介绍28免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍四四 免疫组化结果分析免疫组化结果分析免疫组化结果的判断原则：免疫组化结果的判断原则：1.必须设对照。必须设对照。2.抗原表达必须在特定部位。抗原表达必须在特定部位。3.阴性结果不能视为抗原不表达。阴性结果不能视为抗原不表达。免疫组化原理和流程介绍29免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍实验分析的相关介绍实验分析的相关介绍免疫组化原理和流程介绍30阴性对照：阴性对照：免疫组化原理和流程介绍31免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍阳性对阳性对照照阴性对阴性对照照替代对替代对照照实验实验 组组结
22、论结论6受检组织不含定位受检组织不含定位Ag7受检组织含定位受检组织含定位Ag免疫组化原理和流程介绍33免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理和流程介绍34免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理和流程介绍35免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍染色失败的几种原因：染色失败的几种原因：染染色色失失败败的的可可能能情情况况免疫组化原理和流程介绍36免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍(1)(1)所有切片呈阴性所有切片呈阴性3 3）4 4）5 5）免疫组化原理和流程介绍37免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理和流程介绍38免疫组
23、化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 内源性过氧化酶没有完全阻断内源性过氧化酶没有完全阻断 切片或涂片过厚切片或涂片过厚 漂洗不够漂洗不够 底物呈色反应过久底物呈色反应过久 使用全血清抗体稀释不够使用全血清抗体稀释不够免疫组化原理和流程介绍39免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理和流程介绍40 1.1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。阳性染色的位置。2.2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加覆盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，液前甩干洗涤液，但又防止干片但又防止干片
24、 。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍注意事项：注意事项：免疫组化原理和流程介绍41 3.3.以下原因可能导致片子着色不均匀：以下原因可能导致片子着色不均匀：脱蜡不充分。可以脱蜡不充分。可以 60 60 烤烤 20 min20 min，立即放入新鲜，立即放入新鲜的的 二甲苯中；二甲苯中；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇；抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂；二抗等试剂；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育时，切片放倾斜；抗体孵育后抗体孵育后 PBS PBS 冲洗不充分。冲洗不充分。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不
25、平，切片倾斜。制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理和流程介绍42 4.4.一抗的清洗：一抗的清洗：免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍（1 1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。（2 2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式；用浸洗方式；（3 3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。结合的物质。免疫组化原理和流程介绍43 5.PBS5.PBS的的PHPH和离子强度的使用。和离子强度的使用。免疫组化原理及流程介绍免疫组化
26、原理及流程介绍建议建议PH在在7.4-7.6浓度是浓度是0.01M。中性及弱硷性条件（中性及弱硷性条件（PH7-8PH7-8）有利）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。于分解。免疫组化原理和流程介绍44 5.5.拍照拍照免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍 有条件的话最好立即拍照，有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和和用指甲油封固，保持避光和湿度。湿度。免疫组化原理和流程介绍45免疫组化原理及流程介绍免疫组化原理及流程介绍谢 谢免疫组化原理和流程介绍46
