1、免疫组化荧光组化免疫组化荧光组化一、荧光的特征一、荧光的特征荧光荧光 跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光，叫荧光。的时间也很短，这种发射光，叫荧光。免疫组化荧光组化2二、荧光素二、荧光素 能够产生荧光并能作为染料的化合物能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的称为荧光色素，必须具备：吸收激发光的光能并发射荧光。光能并发射
2、荧光。免疫组化荧光组化3 1 1、具备用于标记抗体的荧光素条件、具备用于标记抗体的荧光素条件(1)(1)应具有与蛋白质分子形成共价键的化应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易离解，而未结合的色学基团，结合后不易离解，而未结合的色素及其降解产物易排除。素及其降解产物易排除。免疫组化荧光组化4(2)(2)荧光效率高，与蛋白质结合后荧光荧光效率高，与蛋白质结合后荧光 素质量下降不多。素质量下降不多。(3)(3)标记后对抗体的免疫学性质和生化标记后对抗体的免疫学性质和生化 性质无影响。性质无影响。(4)(4)结合方法简便而快速，并且较稳定。结合方法简便而快速，并且较稳定。免疫组化荧光组化5
3、(5)(5)荧光素容易溶解，溶解后不会和其荧光素容易溶解，溶解后不会和其 他物质发生化学反应。他物质发生化学反应。(6)(6)荧光颜色与背景组织的自发荧光颜荧光颜色与背景组织的自发荧光颜 色对比鲜明，能清晰判断结果。色对比鲜明，能清晰判断结果。免疫组化荧光组化62.荧光素的种类荧光素的种类(1)(1)异硫氰酸荧光黄（异硫氰酸荧光黄（FITCFITC）：分子量）：分子量390D390D，最大吸收光谱为，最大吸收光谱为490490495nm495nm，最，最大发射光谱为大发射光谱为520520530nm530nm。呈现明亮的。呈现明亮的黄绿色黄绿色荧光，分子量荧光，分子量389.4389.4。免疫
4、组化荧光组化7免疫组化荧光组化8(2)(2)四甲基异硫氰酸罗达明（四甲基异硫氰酸罗达明（TRITCTRITC）是）是罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收罗达明的衍生物，易溶于水，最大吸收光谱为光谱为550nm550nm，最大发射光谱为，最大发射光谱为620nm620nm，呈呈橙红色橙红色荧光。荧光。免疫组化荧光组化9免疫组化荧光组化10(3)(3)四乙基罗达明四乙基罗达明(RB200RB200)呈褐红色粉呈褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可末状，溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存。最大吸收光谱长期保存。最大吸收光谱570nm570nm，最大，最大发射光谱发射光谱596596600nm6
5、00nm，呈明亮，呈明亮橙红色橙红色荧荧光，分子量光，分子量580580，RB200RB200不能直接和蛋白不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷反应，转化成质结合，要先经五氯化磷反应，转化成硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。硫酰氯，再与蛋白质的氨基结合。免疫组化荧光组化11免疫组化荧光组化12(4)1-(4)1-二甲基氨基二甲基氨基-5-5-硫酰氯硫酰氯(5)4-(5)4-乙酰胺乙酰胺-4-4-异硫氰酸异硫氰酸-2-2-硫酸芪（硫酸芪（SITSSITS）(6)(6)得克萨斯红（得克萨斯红（Texas redTexas red）(7)(7)藻红蛋白（藻红蛋白（PEPE）(8)(8)花青（花青（Cya
6、nine,Cy2,Cy3,Cy5Cyanine,Cy2,Cy3,Cy5）免疫组化荧光组化13三、荧光抗体的质量控制三、荧光抗体的质量控制主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。1.1.特异性染色效价测定特异性染色效价测定2.2.非特异性染色测定非特异性染色测定3.3.吸收试验吸收试验4.F/P4.F/P比值的测定方法比值的测定方法免疫组化荧光组化14四、免疫荧光组织化学染色方法四、免疫荧光组织化学染色方法 1.1.直接法直接法 简便、快速，用已知特异性标记荧光的一简便、快速，用已知特异性标记荧光的一抗与组织细胞内抗原结合。抗与组织细胞内抗原结合。免疫组化荧光
7、组化15(2)(2)适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，适当稀释荧光抗体滴加在组织切片上，湿盒内湿盒内3737温育温育1h1h，PBSPBS洗洗3 33min3min。(3)0.01%(3)0.01%伊文氏蓝衬染伊文氏蓝衬染1 13min3min，PBSPBS洗洗3 33min3min，蒸馏水洗，蒸馏水洗2 2次，除去次，除去NaclNacl结晶。结晶。(4)pH9.0(4)pH9.0缓冲甘油封片。缓冲甘油封片。(5)(5)镜检镜检免疫组化荧光组化16免疫组化荧光组化172.2.间接法间接法 是直接是直接法法的重要改进，先用标的重要改进，先用标记的已知特异性一抗与组织细胞内抗原结记的已知特异性一
8、抗与组织细胞内抗原结合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异合，随后用间接荧光标记二抗与一抗特异性结合。性结合。免疫组化荧光组化18免疫组化荧光组化19五、荧光显微镜检查方法五、荧光显微镜检查方法 1.1.荧光显微镜荧光显微镜 荧光显微镜是免疫荧荧光显微镜是免疫荧光组织化学的基本工具。它是由超高压光光组织化学的基本工具。它是由超高压光源，滤片系统源，滤片系统(包括激发和压制滤板包括激发和压制滤板)，光，光学系统和摄影系统等主要部件组成，是利学系统和摄影系统等主要部件组成，是利用一定波长的光激发标本发射荧光。用一定波长的光激发标本发射荧光。免疫组化荧光组化20(1)(1)光源光源 光源的亮度应根据荧
9、光素的类型光源的亮度应根据荧光素的类型选择。小功率汞灯可满足激发一般荧光染选择。小功率汞灯可满足激发一般荧光染料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率料的要求。对于免疫荧光染色需用大功率超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，超高压汞灯。其工作时，两个电极间放电，引起球内水银蒸发，经过引起球内水银蒸发，经过5 515min15min，球内，球内气压升至气压升至50507070标准大气压，此时达到最标准大气压，此时达到最高亮度，成为稳定工作状态。高亮度，成为稳定工作状态。免疫组化荧光组化21滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片系统包括激发滤片，阻断滤片、隔热滤片，分光镜和其他一些中性滤片。滤片，分
10、光镜和其他一些中性滤片。免疫组化荧光组化23免疫组化荧光组化242.2.标本制作要求标本制作要求(1)(1)载玻片厚度应在载玻片厚度应在0.60.61.2mm1.2mm之间之间(2)(2)盖玻片应光洁，厚度在盖玻片应光洁，厚度在0.17mm0.17mm左右左右(3)(3)标本不能太厚，如太厚激发光大部分消标本不能太厚，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激分。不能充分激分。免疫组化荧光组化25(4)(4)封片剂封片剂 常用甘油，必须无自发荧光，常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在无色透明，荧光的亮度在pH8.5pH8.
11、59.59.5时较时较亮，不易很快褪去。甘油和亮，不易很快褪去。甘油和0.5mol/L 0.5mol/L pH9.0pH9.09.59.5的碳酸盐缓冲液等量混合作封的碳酸盐缓冲液等量混合作封片剂。片剂。免疫组化荧光组化26荧光信号增强封片剂荧光信号增强封片剂 聚乙烯醇聚乙烯醇40-88 4.8g40-88 4.8g 甘油甘油 12ml 12ml 蒸馏水蒸馏水 12ml 12ml 0.2mol/L Tris(pH8.5)24ml 0.2mol/L Tris(pH8.5)24ml免疫组化荧光组化27 上述混合（加热溶解），上述混合（加热溶解），5000g5000g离心，离心，15min15min，
12、最后加入，最后加入1.4-diazobicydo-1.4-diazobicydo-2,2,2-octane(DABcos)2,2,2-octane(DABcos)，终浓度，终浓度2.5%(2.5%(约约1.25g)1.25g)，溶解后，分装存于，溶解后，分装存于-2020中。中。免疫组化荧光组化283.3.使用荧光显微镜注意事项使用荧光显微镜注意事项(1)(1)严格按说明书操作，不要随意改变程序。严格按说明书操作，不要随意改变程序。(2)(2)应在暗室中进行检查。应在暗室中进行检查。(3)(3)防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时防止紫外线对眼睛的损害。在调整光源时应戴上防护眼镜。应戴上防护眼
13、镜。(4)(4)检查时间每次以检查时间每次以1 12h2h为宜，超过为宜，超过90min90min，超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。超高压汞灯强度逐渐下降，荧光减弱。免疫组化荧光组化29(5)(5)荧光显微镜光源寿命有限，标本应集荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。光源关中检查，以节省时间，保护光源。光源关闭后必须在闭后必须在30min30min后才能再启动光源，一后才能再启动光源，一天中应避免数次点燃光源。天中应避免数次点燃光源。免疫组化荧光组化30(6)(6)标本染色后应立即观察。标本染色后应立即观察。(7)(7)荧光高度的判断标准，分四级荧光高度的判断标准，分
14、四级“”为阴性，为阴性，“”为仅能见明确可见的荧光；为仅能见明确可见的荧光；“”为可见有明亮的荧光；为可见有明亮的荧光；“”为可见耀眼的荧光。为可见耀眼的荧光。免疫组化荧光组化31免疫组化荧光组化32免疫组化荧光组化33免疫组化荧光组化34免疫组化荧光组化35六、非特异性染色的消除方法六、非特异性染色的消除方法根据产生的原因采取适当的方法，常用方法：根据产生的原因采取适当的方法，常用方法：1.1.先用非免疫血清处理切片，再行荧光染色先用非免疫血清处理切片，再行荧光染色2.2.选用高特异性、高效价荧光抗体选用高特异性、高效价荧光抗体 3.3.选择合适的抗体稀释度和切片选择合适的抗体稀释度和切片4.4.漂洗彻底漂洗彻底免疫组化荧光组化36
