1、PCR测定临床应用及结果临床意义测定临床应用及结果临床意义 概述概述 临床临床PCR检测三条件检测三条件 SDA批准使用的试剂盒批准使用的试剂盒 国家批准符合要求的实验室国家批准符合要求的实验室 经行政部门同意并培训后持证上岗经行政部门同意并培训后持证上岗关于结核杆菌等关于结核杆菌等5项检测的项检测的 具体应用具体应用 结核分枝杆菌结核分枝杆菌(TB)靶序列来源靶序列来源:a.单抗检出的单抗检出的TB抗原旦白编码基因抗原旦白编码基因 b.TB特异性核酸片段克隆特异性核酸片段克隆 c.插插入序列入序列实验设计特点实验设计特点举例举例 65KD,165bp;MPB64,240BP;IS6110,1
2、23bp;IS986,245bp;16sDNA,584bp.注意事项注意事项 标本处理标本处理：痰液化，抑制物去除：痰液化，抑制物去除 试剂质控及灵敏度试剂质控及灵敏度临床评价临床评价 结核的结核的PCR临床主要应用临床主要应用 a.结核与其他分枝杆菌区分结核与其他分枝杆菌区分 b.结核耐药基因结核耐药基因 c.对含菌量低的标本的分离对含菌量低的标本的分离 d.为临床可疑者捕捉信息为临床可疑者捕捉信息 PCR方法与痰涂片及方法与痰涂片及TB培养的比较培养的比较 应做比对研究应做比对研究临床评价临床评价 沙眼衣原体沙眼衣原体(Ct)实验设计特点实验设计特点 靶及引物选择靶及引物选择 外膜蛋白基因
3、外膜蛋白基因(MOMP-OMPI)7.5kb质粒质粒 隐蔽性基因质粒拷贝隐蔽性基因质粒拷贝 16srRNA基因基因注意事项注意事项 标本取材是关键标本取材是关键临床评价临床评价 细胞培养细胞培养 McCoy.Hela-229金标准金标准 ELA法法 PCR法法.专家希望此法为新金标专家希望此法为新金标 HBV-DNA.实验设计特点实验设计特点 S及及C混合引物混合引物 定量用治疗监测定量用治疗监测 104 ,106 临床评价临床评价一一 般临床靠免疫标志般临床靠免疫标志 但无法明确时可测但无法明确时可测拉米呋定及干扰素治疗监测拉米呋定及干扰素治疗监测新问题研究新问题研究 HCV-RNA 实验室
4、设计特点实验室设计特点 需扩增二次需扩增二次 低温启动低温启动UDG系统系统-RNA不稳定性不稳定性注意事项注意事项 防止防止RNase污染污染 杜绝溶血杜绝溶血临床评估临床评估 定性用于诊断(只有抗HCV无法 决定病毒存在状况）定量用于治疗监测 HLA方法方法:免疫学免疫学 分子生物学分子生物学：PCR SSCP RFLP 基因芯片基因芯片I 类类(A,B,C)与疾病发生频率有关与疾病发生频率有关II 类类(DR,DQ,DP)等等 移植配型移植配型DR为例为例 设计设计10条特异性引物条特异性引物:DR1-DR10 设计设计2条组特异性引物条组特异性引物:3568,DRB1 选择其中某些组合
5、成上选择其中某些组合成上,下游引物下游引物 据据bp数推算等位基因数推算等位基因局限性局限性:DR6用排它法用排它法 有有6种表型种表型(DR3/DR3,DR8/DR6等等)不能区分不能区分临床评价中共同问题临床评价中共同问题假阳假阳:残余模板的污染残余模板的污染 其它其它假阴假阴:标本处理不当标本处理不当 其它其它假阳性与假阴性假阳性与假阴性 不能单向强调不能单向强调PCR的优势和检出率应的优势和检出率应与传统方法比对与传统方法比对,合理判断合理判断阳性率与阳性率与“金标准金标准”临床实践是检验实验室工作的标准临床实践是检验实验室工作的标准重视从临床实践找出问题和评价重视从临床实践找出问题和评价临床实践是判断临床实践是判断PCR结果最重要的依据结果最重要的依据
