二维电泳技术介绍课件.ppt

1、二维电泳技术介绍二维电泳技术介绍广州大学生命科学学院 柯德森主要内容主要内容一、蛋白质组学研究意义与面临的困难二、二维电泳及其重要性三、二维电泳的方法与存在的问题四、二维电泳的进展五、展望蛋白质组学研究的意义蛋白质组学研究的意义1、定义：蛋白质组(proteome)：一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质蛋白质组学(proteomics)：指研究蛋白质组的技术及这些研究所得到的结果，其内容包括蛋白质鉴定、翻译后修饰、蛋白质功能确定与疾病的关系。2、意义蛋白质组学是连接基因、蛋白质和疾病的纽带，对蛋白质表达的变化或差异的分析将具有重要的生物学意义和医学应用价值，为阐明生命现象的本质

2、奠定基础。蛋白质组学研究所面临的困难蛋白质组学研究所面临的困难之一之一1、细胞种类的多样性2、细胞的生命周期3、蛋白质生成的时效性（30万300万种）4、蛋白质的结构与变异5、研究方法生物学问题生物学问题的提出的提出实验模型实验模型的设计的设计实验组和对照组实验组和对照组样品的制备样品的制备蛋白样品的蛋白样品的IEF和和PAGE电泳分离电泳分离图像扫描和初步分析图像扫描和初步分析感兴趣感兴趣蛋白点蛋白点的切取的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对质谱结果的生物信息学分析和比对新新蛋白质的发现蛋

3、白质的发现其它实验其它实验的进一步的进一步验证验证蛋白信息的蛋白信息的初步获得初步获得蛋白质组研究平台蛋白质组研究平台n蛋白组学的发展依赖于双相电泳技术的发展、电喷雾质谱（ESI-MS）和基质辅助激光解吸飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术的发明以及在蛋白质分析中的应用和蛋白组信息学的兴起。二维电泳二维电泳及其重要性1.1.1 1、定义：二维电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率的分离分析方法。成功的二维电泳可以将2000到3000种蛋白质进行分离2.、等电聚焦：电荷、SDS凝胶电泳：分子大小二维电泳方法二维电泳方法与问题n方法的主要步骤方法的主要步骤：1、样品准备

4、2、第一维：形成pH梯度进行等电聚焦3、第二维：SDS凝胶电泳4、染色：考马氏亮兰或银染5、图像分析：肉眼或自动扫描 过程演示过程演示n双向凝胶电泳的原理是第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS-PAGE分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。等电点聚焦（IEF)n等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，等电聚焦是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。稳定的pH梯度形成n在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极间逐步建立稳定的pH梯度 蛋白质等电聚焦过程n当蛋白质分子

5、或其他两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终达到一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是该分子的pI，聚焦在等电点的分子也会不断扩散，一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。因此，这些分子总会是处于不断扩散和抗扩散的平衡中，在pI处得以“聚焦”仪器与试剂n聚丙烯酰胺、甲乙聚丙烯酰胺、两性电解质、尿素、NP-40、triton-100n电极液：1M磷酸（阳极液）、1M氢氧化钠（阴极液）n固定液：100g三氯乙酸、10g磺基水杨酸溶于500ml，定容为1000mln染色液：0.35g考马斯亮蓝R250溶

6、于300ml脱色液中，加热到6070，加入0.3g硫酸铜。n脱色液：25乙醇、8冰乙酸溶于水n样品缓冲液:1Ampholine、2Triton X-100、9M尿素样品制备：n用IEF样品缓冲液提取待分析样品，如其他缓冲液提取的样品则应透析后，冷冻干燥、再复溶于IEF样品缓冲液。充分溶解后，离心去除不溶杂质。配胶：n胶液组成：6ml胶母液（10）68尿素1ml Ampholine(pH3.5-10)60-80ul 10%AP5 ul TEMED灌胶：配好的胶迅速灌入模具电泳：n等胶凝固后，小心揭去上下玻璃板，将塑料垫片底部擦干，小心放于电泳槽上。在胶面两边各放一根浸透电极缓冲液的电极条。在胶面

7、上任意位置上放上小擦镜纸片，在纸片上加样，盖上盖子，横功率25W电泳，约10min后，暂停电泳，取下纸片，继续电泳约30min，待电流达4mA以下，停止电泳。固定：染色：脱色n固定：取出塑料片，放入固定液中15minn染色：取出塑料片放入染色液中65染色，直至条带出现n可脱色至背景消除后干燥保存。注意事项1、两性电解质是等电聚焦的关键试剂，它的含量2-3较合适，能形成较好的pH梯度。2、丙烯酰胺最好是经过重结晶的。3、过硫酸铵一定要新配置。4、所有水用重蒸水。5、样品必须无离子，否则电泳时样品带可能走歪，拖带或根本不成带。6、平板等电聚焦电泳的胶很薄，当电流稳定在8mA，电压上升到550V 以

8、上，由于阴极飘移，造成局部电流过大，胶承受不了而被烧断 目前研究现状n在目前情况下，双向凝胶电泳的一块胶板（16cm20cm）可分出34千个，甚至1万个可检测的蛋白斑点，这与10万个基因可表达的蛋白数目相比还是太少了。80年代开始采用固定化pH梯度胶，克服了载体两性电解质阴极漂移等许多缺点而得以建立非常稳定的可以随意精确设定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范围（如0.05U/cm)，对特别感兴趣的区域可在较窄的pH范围内做第二轮分析，从而大大提高了分辨率。此种胶条已有商品生产，因此基本上解决了双向凝胶电泳重复性的问题。这是双向凝胶电泳技术上的一个非常重要的突破。第二向SDS-PAGE有垂直板

9、电泳和水平超薄胶电泳两种做法，可分离10100kD分子量的蛋白质。2D-电泳实验步骤：n1.样品的溶解取纯化后的晶体蛋白3.0mg，加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右，共处理一个小时。其中每隔1015分钟振荡一次，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70ul，80保存。2D-电泳实验步骤：n2.Bradford法测蛋白含量2D-电泳实验步骤：n3.双向电泳第一向IEF（双向电泳中一律使用超纯水）3.1 水化液的制备称取2.0mg 的DTT，用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05%的溴酚兰，3.5ul（0.5%v/v）

10、IPG buffer(pH 3-10)振荡混匀，13200rpm离心15min 除杂质，取上清。在含300ug 蛋白（经验值）的样品溶解液中加入水化液，至终体积为340ul，振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质，取上清。2D-电泳实验步骤：n3.2 点样，上胶分两次吸取样品，每次170ul,按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧，再用镊子拨开Immobiline DryStrip gels(18cm，pH 310)胶条，从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意：胶条使用前，要在室温中平衡30分钟；加样时，正极要多加样，以防气泡的产生；压胶时不能产生气泡；酸性端对应正极

11、，碱性端对应负极；样品加好后，加同样多的覆盖油(Bio-Rad)，两个上样槽必须与底线齐平。2D-电泳实验步骤：n3.3 IPG聚焦系统跑胶程序的设定（跑胶温度为20）S1(30v,12hr,360vhs,step)S2(500v,1hr,500vhs,step)S3(1000v,1hr,1000vhs,step)S4(8000v,0.5hr,2250vhs,Grad)S5(8000v,5hr,40000vhs,step)共计44110vhs,19.5小时其中S1用于泡胀水化胶条，S2和S3用于去小离子，S4和S5用于聚焦2D-电泳实验步骤：n3.4 平衡用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后，在滤纸上

12、吸干（胶面，即接触样品那一面不能接触滤纸，如果为18cm的胶条要将两头剪去），再以超纯水冲洗，滤纸吸干（再次冲洗过程也可省略），然后用镊子夹住胶条以正极端（即酸性端）向下，负极端（即碱性端）向上，放入用来平衡的试管中（镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚兰作为标记），用平衡液A，平衡液B先后平衡15min。注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。平衡第二次时，在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片，长度与一向胶条的宽度等同，然后吸取煮好的Marker，转入SDSPAGE胶面上，保持紧密贴合；同样在第二次平衡时，煮5%的琼脂糖10ml。2D-电泳实验步骤：n4.双向电

13、泳第二向SDS-PAGE 4.1 配胶(两根胶条所用剂量)分离胶：（T=8%80 ml）：溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED30%丙烯酰胺储液 21.28ml分离胶buffer 20ml 10%APS 220ul TEMED 44 ul双蒸水 38.72ml 浓缩胶：（T=4.8%10ml）30%丙烯酰胺储液 1.6ml浓缩胶buffer 2.5ml 10%APS 30ul TEMED 5ul双蒸水 5.9ml2D-电泳实验步骤：n4.2 灌胶将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射

14、器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。2D-电泳实验步骤：n4.3 转移剪两个小的滤纸片，吸取Marker后，放入SDSPAGE胶面的一端。然后，将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDSPAGE胶面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。2D-电泳实验步骤：n4.4 跑胶浓缩胶 13mA 分离胶 20mA 共约5.5个小时n5.银

15、染(两根胶条所用剂量)（银染特别注意用超纯水）2D-电泳实验相关试剂：n1 Bradford 工作液95%乙醇 25ml 先用乙醇溶解考马斯亮兰G250，溶解完后再加磷85%磷酸 52ml 酸，最后超纯水定容至500ml。过滤后置于棕色瓶考马斯亮兰G250 0.035g 外加油皮纸保存（Bradford不稳定，一周内有效）2D-电泳实验相关试剂：n2 裂解液尿素 8M硫脲 2MCHAPS 4%DTT 60 mMTrisbase 40 mM（如果有条件可以添加PMSF 0.5mM和5%的Pharmalate）2D-电泳实验相关试剂：n3.水化液储液尿素 8M 硫脲 2MCHAPS 4%Trisb

16、ase 40 mM2D-电泳实验相关试剂：n4.分离胶buffer(pH8.8)250mlSDS 0.4%1gTrisHCl 1.5M 45.4275gn5.浓缩胶buffer(pH6.8)100mlSDS 0.4%0.4gTrisHCl 0.5M 6.07g 2D-电泳实验相关试剂：n6.凝胶储存液（30%的丙烯酰胺）250mlAcr 29.2%73gBis 0.8%2gn7.电极缓冲液（跑一次要配制2500ml）甘氨酸 43.2g 36gTris 9g 或 7.5gSDS 3g 2.5g 超纯水定容至3000ml 超纯水定容至2500ml 2D-电泳实验相关试剂：n8 0.5M Tris

17、HCl pH 6.8储液6.1g Tris先用30ml超纯水溶解，再用46ml，3M HCl调pH6.8,再加水定容至100mln9 平衡液储液脲（即尿素）36g甘油 30%30mlSDS 1%1g0.5M TrisHCl pH6.8 10ml 超纯水定容至100ml 2D-电泳实验相关试剂：n10.平衡液A（一根胶条）DTT 20mg平衡液储液 10mln11平衡液B（一根胶条）碘乙酰氨 300mg平衡液储液 10ml0.05%溴酚兰 15ul(平衡液A、B均需临时配制)2D-电泳实验相关试剂：n药品CHAPS 兼性离子去垢剂 去垢剂可破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，SDS 离子型去垢剂

18、提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出尿素 离液剂 可改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质硫脲 离液剂 变性并使蛋白失活。尿素和硫脲联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性DTT 还原剂 断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。但过分提高DTT的浓度，由于它pKa在8左右，因而会影响pH梯度。DTT在碱性pH下会去质子化，等电聚焦时会损耗，导致二硫键复原，蛋白质沉淀BSA Bradford中制作标准曲线用无水乙醇 和磷酸一起，提供Bradford中的环境磷酸 提供Bradford中的酸性环境Tris 构成缓冲液的成分，可用于抗衡pH的变化 IPG buffer覆盖液 即

19、矿物油，防止水分蒸发，样品干燥。丙烯酰胺（Acr）以丙烯酰胺为单体，甲叉二丙烯酰胺为交联剂，甲叉二丙烯酰胺（Bis）在催化剂（Aps）和引发剂（TEMED）作用下，聚合交联成三维网状结构 琼脂糖溴酚兰 指示剂作用碘乙酰氨（IAA）平衡液B中使用，中和A液中的DTT正丁醇 比聚丙烯酰胺密度小，用于凝胶制作过程中的压胶甘油 无机盐的良好溶剂，热稳定性好Marker考马斯亮兰G250（Bradford法用）考马斯亮兰G250有红、蓝两种不同颜色的形式在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定，反应化合物在465595nm处有最大的光吸收值，化合物

20、颜色 深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量甘氨酸 与Tris构成缓冲系统AgNO3EDTA 金属螯合剂，可以结合银离子，终止银染过程 染色与分析n其中灵敏度较高的银染色法可检测到4ng蛋白，最灵敏的还是用同位素标记，20ppm的标记蛋白就可通过其荧光或磷光的强度而测定。用图像扫描仪、莱赛密度仪、电荷组合装置可把用上述方法得到的蛋白图谱数字化，再经过计算机处理，去除纵向和横向的曳尾以及背景底色，就可以给出所有蛋白斑点的准确位置和强度，得到布满蛋白斑点的图像，即所谓“参考胶图谱”。蛋白质组研究的主要困难是对用双向凝胶电泳分离出来的蛋白，进行定性和定量的

21、分析。最常用的方法是先把胶上的蛋白印迹到PVDF(polyvinylidene difluoride)膜上后再进行分析，确定它们是已知还是未知蛋白。现在的分级分析法是先做快速的氨基酸组成分析，也可先做45个循环的N末端微量测序，再做氨基酸组成分析；结合在电泳胶板上估计的等点电和分子量，查对数据库中已知蛋白的数据，即可作出判断。有文献报道，N末端4个残基序列的数据就可以给出很多的信息而得到相当准确的结果。如再结合C末端序列，判断结果的准确性会更高。对分离得到的蛋白质作进一步的确切鉴定需要有足够数量的纯蛋白，电泳时蛋白质已经过了高度纯化。现在一块胶板可允许上到高达mg数量级的样品，因此每个分离的蛋

22、白斑点可有g数量的蛋白，这样使本来是微量的蛋白也可希冀被鉴定。二维电泳方法与问题问题n重复性差：方法尚未标准化导致的结果是实验室内部、不同实验室之间难以重复n难定量二维电泳方法与问题问题n双向凝胶电泳技术当前面临的挑战是：(1)低拷贝蛋白的鉴定。人体的微量蛋白往往还是重要的调节蛋白。除增加双向凝胶电泳灵敏度的方法外，最有希望的还是把介质辅助的激光解吸/离子化质谱用到PVDF膜上，但当前的技术还不足以检出拷贝数低于1000的蛋白质。(2)极酸或极碱蛋白的分离。(3)极大（200kD）或极小（10kD蛋白的分离。(4)难溶蛋白的检测，这类蛋白中包括一些重要的膜蛋白。(5)得到高质量的双向凝胶电泳需

23、要精湛的技术，因此迫切需要自动二维电泳仪的出现。二维电泳的进展进展1、二维平板凝胶电泳的进展染色试剂：考马氏亮兰、银染、同位素、荧光等 由染色检测到直接紫外检测 肉眼观察自动扫描2、平板二维柱二维电泳（二维CE）3、平板二维芯片二维电泳4、二维电泳多维电泳进展之一：（进展之一：（1）荧光染色）荧光染色FLA-5000-image:Sypro Ruby stained 2 D-gel,brain proteins 二维电泳荧光检测二维电泳荧光检测进展之一：（进展之一：（2）紫外荧光检）紫外荧光检测测Anal.Chem.2003,75,157-159进展之一：（进展之一：（3）结果自动分析）结果自

24、动分析BioRads PDQuest.Simultaneous analysis of 100 gels or composite gels using BioRads PDQuest.(Courtesy:BioRad laboatories)进展二：由平板二维至柱二维进展二：由平板二维至柱二维(二维毛细管电泳二维毛细管电泳)1、一维：等电聚焦毛细管电泳2、二维：区带毛细管电泳n刘春和等。色谱2003年第5期进展之三：微流控芯片电泳进展之三：微流控芯片电泳微流控芯片二维电泳芯片二维电泳：芯片二维电泳：MECKCEJ.Michael Ramsey*,Anal.Chem.2000,72,5244-

25、5249Anal.Chem.2003,75,3758-3764峰容量达4200芯片二维电泳：芯片二维电泳：MECKCE芯片二维电泳：开管电色谱芯片二维电泳：开管电色谱CEAnal.Chem.2001,73,2669-2674芯片二维电泳：芯片二维电泳：IEFCEThomas W.Kenny，Anal.Chem.2003,75,1180-1187峰容量达到1300芯片二维电泳：芯片二维电泳：IEFCEAnal.Chem.2004,76,742-748峰容量达1700发展之四：多维电泳发展之四：多维电泳n按等电点、质荷比和分子量分离蛋白质，理论上可分离3万多种蛋白质 n与平板二维电泳相比，多维电泳

26、可将灵敏度和精密度提高100倍（LIF检测）,峰容量提高5倍平板二平板二维维电泳与三维电泳比较电泳与三维电泳比较 平板二维电泳平板二维电泳多维电泳多维电泳分离容量（理分离容量（理论值）论值）7,00034,000重复性重复性CV%445%0.5%灵敏度灵敏度0.1 ng(Silver Stain)0.001 ng(LIF)分子大小限制分子大小限制200 kDa无蛋白质类型蛋白质类型水溶性水溶性与脂溶性双向电泳分析中的样品制备制备原则制备原则：n应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。多数疏水性蛋白）

27、，且制备方法应具有可重现性。n防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。n防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。（如酶性或化学性降解等）。n完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。n尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。待研究蛋白的可检测性。可溶性样品可溶性样品 固体组织样品固体组织样品 细胞细胞不同样品的基本处理方法不同样品的基本处理方法样品的分级处理样品的分级处理通过采用亚细

28、胞分级、液相电泳和选择性沉淀等方法对蛋白质样品进行分级处理，可降低样品的复杂性并富集低丰度蛋白质。当前最简单有效的处理是采用分级抽提，按样品溶解度不同进行分离。样品的溶解n是2-DE成功分离蛋白质的最关键因素之一。n溶解的目标：1、样品中非共价结合的蛋白质复合物和聚积体完全破坏，从而形成各个多肽的溶解液（否则样品中结合牢固的蛋白复合物可能使2-DE中出现新的蛋白点，相应的表示单个多肽的点的强度会下降）；2、溶解方法必须允许可能干扰2-DE分离的盐、脂类、多糖和核酸等物质的去除；3、溶解方法要保证样品在电泳过程中保持溶解状态。增加样品溶解性的手段增加样品溶解性的手段变性剂：变性剂：通过改变溶液中

29、的氢键结构使蛋白质充分伸展，将其疏水中心完全暴露，降低接近疏水残基的能量域。其典型代表是尿素和硫脲。表面活性剂：表面活性剂：经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。常用的表面活性剂有离子去污剂SDS、非离子去污剂Triton X-100和NP-40、两性离子去污剂CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。还原剂：还原剂：在变性剂和表面活性剂联用条件下，加用还原剂可使已变性的蛋白质展开更完全，溶解更彻底。常用含自由巯基的DTT或-巯基乙醇，以及不带电荷的三丁基膦（TBP）进行还原。起载体作用的两性电解质：起载体作用的两性电解质：即便在变性剂和

30、表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。Carrier ampholytes的作用在于捕获样品中的少量盐分，从而保证蛋白质的溶解性。应用时，两性电解质的浓度应小于0.2（w/v)。浓度过高会使IEF的速度降低。另外，为了保证实验的精确性，在选择不同pH范围的IPG胶条时，也应使两性电解质的pH值与之相符合。样品液的准备标准液：ReagentAmount8M urea47ml of 8.5 stock or 24g urea in 25ml H2O50mM DTT or2mM TBP385mg or 500ul o

31、f 200mM TBP stock4%CHAPS2g0.2%carrier ampholytesSee next table0.0002%bromophenol blue100ul of 0.1%stockddH2OTo 50mlIPG pH RangeBio-Lyte Ampholyte(stock)rangeBio-Lyte Ampholyte(stock)Conc.(w/v)Sample Solution VolumePer 5mlSample Solution VolumePer 50ml3-103/1040%25l250 l4-74/640%12.5 l125 l5/740%12.5

32、 l125 l3-63/540%25 l250 l4/640%12.l125 l5-85/840%25 l250 l7-107/940%12.5 l125 l8/1020%25 l250 l Suggested Bio-lyte ampholyte composition for IPG use样品中核酸的去除样品中核酸的去除n对电泳的影响：对电泳的影响：增加样品粘度、与蛋白质形成复合物后会出现假象迁移和条纹。n解决方法：用适量纯的不含蛋白酶的核酸内切酶进行降解，或是利用合成载体两性电解质（SCA）同核酸结合形成复合物的能力，再通过超速离心来去除复合物。亚蛋白质组样品的制备亚蛋白质组样品的制备

33、n用超离心技术分离出细胞器、质膜和细胞核等成分，再用适当的蛋白质溶解液进行溶解。其优点是不仅大大减少样品的复杂性，而且可对分离的蛋白质进行亚细胞定位。但该法需要专业仪器，有时会出现假阳性。n顺序抽提法：顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。第一步：用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用标准IEF样品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白约占整个样品的11%（W/W）。特殊样品的制备特殊样品的制备 低丰度蛋白的分离：低丰度蛋白的分离：尽管增加上样量和提高

34、总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄pH胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离。n强碱性蛋白质（如核糖体）的处理：先将蛋白预处理以富集，再用特殊pH梯度的IPG胶条（如pH312、4-12或10-12）进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶（如pH10-12）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性IPG胶（如pH3-12、4-12）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。n极端分子量的蛋白质：极端分子量的蛋白质：小于

35、8kD和大于200kD的蛋白在常规IPG-2D上不易看到，这可能是在Tris/glycine缓冲液中，样品和游离的dodelcyl sulfate ions持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。BIO-RAD公司自动蛋白点切胶仪（ProteomeWorksTM spot cutter）：是一套自动切胶系统，能够自动切取在PDQuesTM图像分析软件的操控下，直接切取凝胶中的蛋白质点。自动酶解系统一维固一维固

36、相相pH梯度等电聚焦梯度等电聚焦（IEF with IPG）：）：nIPG胶的材料是Immobilines，为拥有CH2=CH-CO-NH-R结构的8种丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基团，它们构成了分布在pH310不同值的缓冲体系。根据公布的配方计算后，将适宜的IPG试剂添加至混合物中用于凝胶聚合，在聚合中缓冲基团通过乙烯键共价聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通过这种方式生成的IPG不会发生电渗透作用，因而可以进行特别稳定的IEF分离达到真正的平衡状态。IPG胶条的重泡胀胶条的重泡胀n泡胀的实质：是让样品能完全以可溶性的形式进入IPG内，从而能进行接下来的IEF。n不同的加样方

37、法和加样量会导致最终结果的差异：nProtean IEF cell、IPGphor等集成设备的使用：n 20mmol/L DTT 垫片的使用：n温度的选择：蛋白载样量蛋白载样量影响影响IPG胶条对蛋白载样量的因素包括：胶条对蛋白载样量的因素包括：n待分析的蛋白点的量应满足随后的质谱分析。n电泳的目的：如果只是得到一张好的图片，则无需考虑太多其它因素。n待研究蛋白的丰度：n样品的复杂度：复杂度较高的样品，为了尽可能的了解所包含的每种蛋白，需要反复实验才能完成。如果将待检样品被富集以后则更易分析。nIPG胶条的pH范围：IPG胶条的蛋白质大约载样量胶条的蛋白质大约载样量IPG Strip leng

38、thAnalytical Load(silver staining)Preparative Load(Coom staining)7cm10100 g/125 l200500ug/125 l11cm50200 g/185 l2501000ug/185 l17cm100300 g/300 l13mg/300 lIPG IEF 中中pH梯度的选择梯度的选择 n常用方法：先宽后窄，先线性后非线性，先短后长，预试验确定。预分步预分步收集收集细胞浆细胞浆细胞核细胞核 细胞膜细胞膜核糖体及其他核糖体及其他特定细胞成份特定细胞成份细胞分细胞分泌成份泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-1

39、0pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第一步第二步第二步第第三三步步用窄用窄pH范围阵列分离范围阵列分离低丰度或交叉覆盖蛋白低丰度或交叉覆盖蛋白阵列那些亚细胞定位位阵列那些亚细胞定位位置的功能蛋白质置的功能蛋白质亚蛋白质组阵列策略的框架图亚蛋白质组阵列策略的框架图3倍3倍聚焦时间的优化聚焦时间的优化 n理论上讲，要获得最好的图谱质量和重复性所需最佳时间是IEF分离达到稳定态所需的时间。n聚焦时间太短，会导致水平和垂直条纹的出现。n过度聚焦虽然不会导致蛋白质向阴极漂移，但会因为活性水转运而导致过多水在IP

40、G胶表面渗出（电渗）而造成蛋白图谱变性，在胶条碱性端产生水平条纹以及蛋白丢失。n最佳时间的确定需要根据不同蛋白样品、上样量、pH范围和胶条长度通过经验来确定。IEF的基本条件的基本条件Stemp 1Stemp 2Stemp 3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020minLinear400040002hr10,000V-hrLinearRapid5 hr14,000V-hr7 cmStemp 1Stemp 2Stemp 3totaltotalStemp 1Stemp 2Stemp 311 cm17 cm25025080001000010000800020min20

41、min2.5hr2.5hr20,000V-hr40,000V-hr30,000V-hr50,000V-hr5.3 hr7 hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid两维间的平衡两维间的平衡 n一维结束后可马上进行二维电泳，也可保存在两片塑料膜间于80保存数月。n但在二维电泳前一定要进行胶条的平衡，以便于被分离的蛋白质与SDS完整结合，从而在SDS-PAGE是电泳能顺利进行。n建议方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mM Tris（pH8.8）缓冲液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述缓冲液平

42、衡15min。如果用TBP代替DTT则只需一步平衡。二维二维SDS-PAGEn同普通SDS-PAGE类似。n但一般在垂直电泳系统中无需浓缩胶，因为在IPG胶条中蛋白质区域已得到浓缩，可以认为非限制性IEF胶（低浓度丙烯酰胺胶）充当了浓缩胶。有机染料和银染有机染料和银染n考染灵敏度为30100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。n胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为810ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。n胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。n银染的缺点是：对某些种类的

43、蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。n这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。负负 染染n能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。n结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。n速度快（515min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。n它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。n该技术主要包括金属盐染料、锌咪唑染料等的使用。胶体扩散染料胶体扩散染料n主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。n最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的

44、银染类似。n这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。有机荧光团染料有机荧光团染料n包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、Orange、Ruby等荧光染料。n这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约3060min完成，灵敏度为210ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。n这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。n在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。金属螯

45、合染料金属螯合染料n这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。n其中SYPRO Ruby也是一种基于钌的金属发光染料。凝胶的图像处理分析和凝胶的图像处理分析和典型流程典型流程n凝胶图像的扫描：n图像加工：n斑点检测和定量：n凝胶配比：n数据分析：n数据呈递和解释：n2-DE数据库的建立：蛋白质的胶内酶切 包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程质谱

46、技术进行蛋白质鉴定的基本流程质谱技术进行蛋白质鉴定的基本流程 样品制备样品制备 与与IPG胶条水化胶条水化 IPG电泳电泳 与上样缓冲液浸润与上样缓冲液浸润 SDS-PAGE 转转PVDF膜膜 胶内直接染色胶内直接染色 染色染色 取出蛋白点取出蛋白点 胰酶等消化胰酶等消化 浓缩于多孔吸附柱上浓缩于多孔吸附柱上 MALDI-MS肽指纹图肽指纹图 数据库查询数据库查询 蛋白质鉴定蛋白质鉴定 已知已知 反向反向HPLC分离分离 MALDI-MS，PSD片段分析片段分析示知示知 ESI-MS-MS、微测序微测序 实验方法实验方法完整蛋白质（如凝胶分离或完整蛋白质（如凝胶分离或色谱纯化蛋白质）色谱纯化蛋

47、白质）肽肽混合物混合物质谱测定肽质量质谱测定肽质量（MALDI-MS,ESI-MS)选择肽段裂解选择肽段裂解PSD-MALDI-MS,ESI-MS/MS)计算方法计算方法蛋白质序列数据库（核酸序列翻译数据库）蛋白质序列数据库（核酸序列翻译数据库）肽肽质量检索质量检索：片片1.ppt 未未解析碎片离子检索：解析碎片离子检索：片片2.ppt酶切酶切体外体外 pmol32P蛋白质标记蛋白质标记蛋白质分离蛋白质分离蛋白酶切蛋白酶切2D磷酸化做图磷酸化做图 LC-ESI-MS或或MALDI-MS LC-ESI-MS HPLCIMAC磷酸化氨磷酸化氨基酸分析基酸分析体内体内32P细胞标记细胞标记蛋白酶切蛋白酶切2D磷酸化做图磷酸化做图相关分析相关分析磷酸化位点磷酸化位点分析策略分析策略五、展望五、展望n1、柱二维电泳发展越来越快，如芯片二维电泳将会起越来越重要的作用；n2、二维向多维发展；n3、将从定性向定量分析发展。Thank you!