1、免疫学原理与技术答辩2编辑标题编辑标题团队成员团队成员窦 俊14404315白华山14404726黄妤璠14404713刘学成14404818何海龙14404406王敏敏14404729赵雅嫱14404723组长：龙益如14404806Part 1Part 2Part 3研究思路与方法绪 论应用前景目录Contents绪 论Part 1选题背景相关研究状况研究意义51.1 选题背景 Del-1（developmentalendothelial locus-1）最早被发现是一种在胚胎血管生成过程中由内皮细胞分泌的ECM蛋白，具有促进血管形成的作用，是一种重要的血管再生因子和免疫调节因子。四个观点
2、恶性肿瘤成为威胁世界人民健康的致命因素针对肿瘤的预防、检测和治疗的研究成为热点肿瘤微环境和新生血管是近期药物研究的热门靶点Del-1蛋白靶点的发现为药物研发提供新方向61.1 选题背景 Del-1蛋白含有三个重复表皮生长因子EGF样结构域和两个盘状结构样结构域。其第二个EGF结构域（EGF2）包含一个可结合整合素的重要模体，RGD模体（Arg-Gly-Asp），两个盘状结构域则可结合磷脂酰丝氨酸，特殊的结构决定了Del-1在细胞微环境中发挥的功能。71.Del-1促肿瘤血管生成作用1.2 相关研究情况8结合v32.Del-1促进肿瘤生长及转移1.2 相关研究情况91.3 研究意义学术研究意义D
3、el-1作为肿瘤发生发展过程中重要的胞外基质蛋白，抗Del-1蛋白抗体药物的制备，将为该靶点的实际应用提供相应方法，也对肿瘤微环境中其他靶点的研究提供参考。社会效益可用于治疗肝癌、胰腺癌、肺癌、大肠癌等癌症肿瘤，为恶性肿瘤治疗提供新的选择，帮助病人减轻病痛，提高其生活质量。经济效益制成制备相应抗体药物可用于肿瘤检测和治疗，将会有很大经济效益。010203研究思路与方法Part 2理论依据研究思路可行性说明112.1 理论依据3个依据研究的三个理论依据理论依据一理论依据二理论依据三Del-1蛋白在肿瘤微环境中高表达，在正常人组织器官中仅部分部位表达如眼等。Del-1蛋白在肿瘤新生血管生成、抗肿瘤
4、血管内皮细胞凋亡以及肿瘤转移和复发等多信号通路中发挥重要作用。凝血酶原在凝血机制中起到中心作用，且其转化为凝血酶之后才具有相应活性，而凝血酶原和Del-1蛋白在与整合素结合均依赖RGD模体，可能存在共同抗原。单克隆抗体的制备技术和小分子抗体制备方法为我们提供了技术手段。12思路ABCDE兵马未动粮草先行切断运粮通道Del-1蛋白靶点抗体导弹亲和力、凝血酶原2.2 研究思路132.2.1 Del-1相关情况142.2.1 Del-1相关情况152.2.1 Del-1相关情况162.2.1 Del-1相关情况172.2.1 Del-1相关情况18材料动物免疫饲养细胞的制备瘤细胞SP2/0的制备免疫
5、脾细胞的制备细胞融合阳性杂交瘤细胞的筛选和克隆细胞冻存与复苏单抗腹水的制备及效价的测定1234567982.2.2 抗Del-1蛋白的单克隆抗体的制备 培养基及血清：胎牛血清、RPMI 1640培养基；试剂：HT、HAT、PEG3500、CFA、IFA、DMSO；细胞系：骨髓瘤细胞系 SP2/0 本校实验室保存；Balb/C 小鼠若干；19采用盐析法提纯单克隆抗体，对A-J分别执行如下操作，调节样品 p H 值，加 入 正 辛 酸（25ul/l），搅拌30min；室温高速离心（10000g，30min），收集上清液；再加入硫酸铵（40%饱和度）；4高速离心（10000g，15min），弃去上清
6、液；用PBS溶解沉淀，可得到比较纯的单克隆抗体A-J溶液。1.单克隆抗体的纯化将各株单克隆抗体分别用胃蛋白酶进行酶切修饰，然后采取凝胶层析法用Sephadex G-100分离F(ab)2，具体操作不再赘述；测定 F(ab)2的分子量、亲和力、特异性、效价等。2.获取纯化的F(ab)2及鉴定2.2.2 抗Del-1蛋白的单克隆抗体的制备20一、假设小分子抗体与凝血酶原能够结合肿瘤细胞Del-1血管Del-1抗体凝血酶原2.2.3 筛选满足亲和力条件的抗体21 酶免疫技术法（ELISA）：（1）将单位量Del-1蛋白吸附于固相载体上，洗涤，封阻。（2）用辣根过氧化物酶（HRP）根据过碘酸盐氧化交联
7、法进行抗体标记,将酶标抗体加入孔内。（3）洗涤未反应物。（4）加入底物（TMB）。（5）加入浓硫酸终止反应，测OD值，检测显色反应的程度，记录。（6）加入第二种抗体（单位量），重复前面步骤，直至全部检测完。（7）根据显色程度大小，将抗体按与Del-1亲和力的大小进行排序。2.2.3 筛选满足亲和力条件的抗体22酶免疫技术法（ELISA）:排序后，按亲和力从大到小的顺序，同理用ELISA将抗体与凝血酶原反应，检测反应亲和力，并与上面步骤进行比较，直至筛选出满足“抗体Del-1亲和力大于抗体凝血酶原亲和力”的抗体。筛选满足亲和力条件的抗体2.2.3 筛选满足亲和力条件的抗体23采用酶切法进行酶原修
8、饰，切除酶原无用的基团，同时可减小其分子量，增加穿透性。若所有抗体不满足2.2.4 凝血酶原修饰连接24采用流式细胞仪确定抗原抗体结合表位。然后利用基因拼接技术（基因工程），在融合蛋白作用下，将表位与酶原连接，这样就可保证抗体与酶原结合。基因工程凝血酶原可视为载体，筛选得到的抗原表位视为半抗原，用碳化二亚胺法将两者连接，测偶联比。最后用ELISA找到想要的偶联物。蛋白质工程当抗体不满足亲和力条件时25采用脂质体包埋法，将脂质体包埋在酶原上，制成多囊颗粒。增加酶原稳定性。酶固定化法根据肿瘤细胞特有的Warburg反应，可将PKM2结合蛋白结合在酶原上，待其进入肿瘤微环境后可被特异性结合、酶解，而
9、不破坏酶原。能量底物法对于酶原在机体的保护262.2.5 测小分子抗体的效价、亲和力、特异性1测效价（间接ELISA:1）3测交叉反应率（间接竞争ELISA）2测亲和力常数（间接ELISA）27-70保存将交联剂PMPI粉末溶于DMSO，CA4P，再加入PBS缓冲液，按一定物料比，分批加入，轻轻搅拌，反应数小时 将 还 原 性 抗 体 与PMPI-CA4P按一定比例偶联琼葡糖凝胶脱盐 将 抗 体 与 还 原 剂TCEP以一定比例混合搅匀，反应1h后，超滤除盐2.2.5 偶联物纯化，偶联比检测方法一、偶联步骤28SDS-PAGE非还原性电泳紫外分光光度法粗测偶联比液质联用测量药物抗体偶联比例二、
10、偶联比的测定三、其他血管阻断药物偶联备选ENMD-1198反式-3，5，4-三甲氧基白藜芦醇血栓素蛇毒蛋白(SVTLE)2.2.5 偶联物纯化，偶联比检测方法对比试验同类筛选292.2.7 临床前研究实验试剂：人胰腺癌细胞细胞株，SPF级BALB/C小鼠人源细胞荷瘤裸鼠模型的建立：取对数生长期的胰腺癌细胞，用无血清培养基重悬至浓度为2*107个。选取体重20g左右，68周龄的雌性小鼠，腹腔注射麻醉剂，待麻醉后，于右侧背部皮下注射细胞悬液进行接种。肿瘤生长至200mm3时，进行后续试验。302.2.7 临床前研究1.检查药物的靶向性：用荧光标记的抗DEL-1单抗-凝血酶药物经尾静脉注射入小鼠体内
11、，分别在给药4,12,24,48h后，对老鼠进行活体荧光检测。24h后处死小鼠，收集心、肝、脾、肾、肺、肿瘤等组织检测荧光强度。312.检查凝血酶是否发挥作用：将小鼠分为给药组和不给药组，每组5只。对两组肿瘤组织进行切片，制成组织匀浆。用凝血酶ELISA检测试剂盒检测两组小鼠肿瘤组织中的凝血四项。（凝血四项包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（FIB）3.检查药物的抗肿瘤活性：随机分成5组（每组10只）：第一组：空白生理盐水溶液（空白对照组）第二组：DEL-1抗体-凝血酶低剂量组第三组：DEL-1抗体-凝血酶高剂量组第四组：贝伐单抗治疗组第
12、五组：贝伐单抗+DEL-1抗体-凝血酶组进行治疗实验，以小鼠生存周期、体重、肿瘤生长抑制率为考察指标。每周给药一次，连续给药8周后，结束治疗。处死后，将实体瘤剥离，称瘤重，并拍照。2.2.7 临床前研究322.3 可行性说明可行性分析二、小分子抗体制备小分子抗体分子量小，方便携带凝血酶原并通过血液循环运输到靶点。保留抗原识别功能，摒弃了Fc段无关作用。四、偶联物纯化，偶联比检测 交联剂选择分子量较小的，在体内稳定性较好 偶联物和小分子药物结合时，结合基团的选择原则是尽量降低其异物性 小分子药物达到靶点可能无法解离，无法发挥药效三、凝血酶原修饰 如果凝血酶原在运输途中掉落，可对其进行固定化 如果
13、凝血酶原太大可对其进行修饰，不过可能改变其亲和力。如果凝血酶原的亲和力无法达到要求，则对其进行基因工程改造，添加新的抗原表位 若凝血酶原上无法构建出适合的抗原表位，则选用凝血系统中的其他凝血因子，重复以上实验一、del-1的获取 所需骨髓瘤细胞和小鼠皆可购买，构建方法简单 已知凝血酶原与del1存在交叉抗原RGD，很可能是我们需要的抗原表位33噬菌体展示技术应用若通过亲和力筛选得不到满足条件的抗体，则采用库容量更大的噬菌体展示技术生物体内效价检测肿瘤新生血管抑制剂和阻断剂相关检测方法已成熟567其他副作用（Del-1在眼、脑、肺等局部组织器官表达，药物对非肿瘤健康组织也有凝血作用。）凝血酶有促进肿瘤扩散的功能，与其浓度有关，可通过控制其浓度发挥凝血功能药物发挥凝血功能后，联合手术治疗2.3 可行性说明应用前景Part 335应用前景应用前景一应用前景二应用前景三为肿瘤血管阻断剂及新生血管抑制剂，双效药物的制备提供研究基础用于胰腺癌、肝癌、肺癌、大肠癌的辅助治疗Del-1抗体还可以与其他抗肿瘤药物偶联制成新的抗癌药物。
