1、免疫实验 免疫学及免疫检测技术试验实验一、外周血单个核细胞的分离实验一、外周血单个核细胞的分离 单个核细胞：单个核细胞：一、基本原理一、基本原理?常用哪些方法分离细胞，免疫学可采用哪些方法本实验是利用不同的细胞之间密度不同的性质，通过速度沉降法来分离制备外周血中单个核细胞。二、操作：1、稀释血：1ml血+1ml缓冲液（含510IU/ml肝素的PBS，无血清）（用滴管）离心单个核细胞（斜面！）2、加于淋巴细胞分离液上层，离心：500g 20min（小于1000rpm)！沿管壁滴加 !淋巴细胞分离液取法3、吸出细胞，悬于营养缓冲液（12倍量含5IU/ml肝素、2灭活小牛血清的PBS液），离心：20
2、0g 10min，除去血小板。4、洗涤：同样营养液洗涤2次，洗去淋巴细胞分离液，离心：500g 10min实验二、酶联免疫检测技术实验二、酶联免疫检测技术（ELISA）一、实验原理：酶联免疫测定法实质上是将专一性很强的、十分灵敏的、能够定量进行的抗原抗体结合反应与高催化效能的酶促反应偶联在一起的一种分析方法。它除了用来测定抗体外，原则上适用于一切可以诱导动物产生相应抗体的抗原和半抗原物质的测定。其特点是专一性强，灵敏度高，操作简便，无须特殊设备，特别适用于测定成分复杂的体液及组织中的微量生命物质，而且几乎不受其他物质的干扰。一、原理（续）一、原理（续）测定方法：酶联免疫测定法应用非常广泛。具体
3、操作方法随测定对象及测定要求的不同而有很大差异。液相固相吸附测定法酶联免疫吸附测定法(ELISA)简称酶标法。酶标法的基本测定方法有三类：即间接法(抗原-抗体-酶标抗抗体)双抗体(夹心)法(抗体-抗原-酶标抗体)抗原竞争法。本次实验检测血清IgG，应用的是双抗体夹心法。二、实验方法：1、包被抗体：包被抗体浓度为：用包被液稀释（包被聚苯乙烯要在偏碱性条件下进行，所以该包被液用pH9.6的碳酸盐缓冲溶液）抗体至10或20ug/ml，每孔加100ul。加18孔18孔的安排：套上包装袋，4过夜，弃上清，以洗涤液(200ul)洗涤三次，甩干。关于对照、平行！标准：S1-S5ELISA荧光免疫空白对照阴性
4、对照阳性对照2、加抗原：！稀释抗原用加！稀释抗原用加BSABSA的保温液稀释！的保温液稀释！如上页图所示，加抗原，空白和荧光阴性对照加含BSA的保温液标准抗原1-5的浓度分别为：50，100，200，300，500ng/ml(都从500ng/ml加，分别加10，20，40，60，100ul至各孔，再分别补加90，80，60，40，0ul保温液即可)荧光各孔：阴性对照：Ab-Ag-FITC-Ab，阳性对照用200ng/ml，500ng/ml37，1hr，洗涤液洗涤三次3、加酶标抗体、荧光标记抗体：所有ELISA各孔均加100ul（已稀释好,稀释倍数：2000各荧光孔不加酶标抗体，加荧光标记抗体1
5、00ul,(已稀释好，稀释倍数：50)！注意！注意！荧光怕见光，注意避光，加液、保温时都要避光荧光怕见光，注意避光，加液、保温时都要避光37，45min，取出后保温平衡10分钟,洗涤液洗涤三次，荧光各孔可不洗4、观察荧光、ELISA各孔加底物：一组同学观察荧光、一组同学加酶底物。酶底物溶液要现配，由老师或同学代表配制一份即可。各孔加100ul，37保温15min。终止酶反应：各孔加4mlol/L硫酸50ul终止。5、酶标仪上测各孔492nm的光吸收。打印直线附在实验报告上！实验三、纳米金免疫检测技术实验三、纳米金免疫检测技术一、实验原理：以双抗体夹心法为例。在硝酸纤维素膜的膜片上滴加纯化的抗体
6、，为膜所吸附。当滴加在膜上的标本液体渗滤过膜时，标本中含抗原被膜上抗体捕获，其余无关蛋白等滤出膜片。其后加入的胶体金标记的抗体也在渗滤中与已结合在膜上的抗原相结合。因胶体金本身呈红色，阳性反应即在膜中央显示红色斑点。一、实验原理一、实验原理本实验不用夹心法，直接加抗原，再加金标抗体。二、实验操作：二、实验操作：1.点加抗原：（人IgG）：在硝酸纤维素膜下垫吸水材料（卫生纸），用微量移液器取3ul抗原溶液点于硝酸纤维素膜上，注意点样时要逐次点于膜上，待前次所点液体渗入后再继续点，不要使斑点太大，同时注意不要太用力将膜点破，致使斑点太大。烤干或吹干，保证抗原能够吸附到膜上，给蛋白质一定吸附时间，否
7、则下步的洗涤有可能将蛋白洗掉！）。2.洗涤、封闭：点加10ul 含1%BSA的PBS洗涤（BSA作用是封闭），待干（注意别让BSA覆盖前一步抗原），另点1个点（作为阴性对照）。3.点加金标抗体：金标记抗体稀释至1：25-1：50，点加10ul，即可在阳性对照点处观察到红色斑点，而阴性对照则无。三、注意事项：三、注意事项：1斑点大小控制。2勿用力戳破膜。3给第一抗体和封闭蛋白（BSA）一定吸附时间。4把你的实验结果粘贴于实验报告上，报告测定结果，指出阳性点和阴性点。实验四、免疫荧光检测技术实验四、免疫荧光检测技术一、基本原理：荧光双抗夹心法定位与定量抗原二、操作：1、抗体包被：（同实验二）2、加样本：同实验二，但在本实验中不做标准曲线，样品加两个稀释浓度，如1：20，1：40，另外加一个阳性对照（用人IgG标准），每孔做一个复孔，加空白对照共计8孔。3、加荧光抗体：从这里开始与实验二不同之处是一定要记得避光操作。按照要求加入一定稀释度的荧光标记抗人IgG抗体（一般为1：80倍左右），避光37保温箱中保温30-45分钟。三、结果处理：于荧光显微镜下观察荧光，并照相，于实验报告上附上你获得的荧光照片，图片标明照片样本、显微镜放大倍数等。附一张样板
