1、免疫荧光技术一、一些基本概念和基本知识：1 荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。2.技术分类：荧光抗体技术(荧光显微镜技术)抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法。免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法3荧光的产生：物质吸收外界能量而进入激发状态，在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形式释放，即发光，这种光称为荧光。这种物质，称为荧光素 由光激发所引起的荧光，为光致荧光 -荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光
2、 -化学发光技术4荧光素的荧光特性：停止供能，荧光现象随即终止 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性 入射光波长发射光波长 荧光效率：发射荧光的光量子数 荧光效率=吸收光的光量子数 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱5 常见荧光素：FITC RB200 TRITC 镧系：Eu、Tb PE 其它常见荧光素的特性：FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490495nm，发射光：520530nm，明亮的黄绿色荧光。RB200：橘红色粉末,吸收光570nm，发射光 595600nm，橘红色荧光。TRITC：紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。镧系：Eu、Tb PE：吸收光490560n
3、m，发射光595nm，红色 荧光。其它：酶作用后产生荧光物质。酶作用后产生荧光物质：酶 底物 产物 激发光 发射光-G MUG MU 360 450 AP MUP MU 360 450 HRP HPA 二聚体 317 414 6合适荧光素的选择 具有与蛋白质形成共价键的化学基团。荧光素-N=C+NH-蛋白质 荧光素-N-C-N-蛋白质 S H H S H 荧光效率高，标记后下降不明显。荧光色泽与背景色泽对比鲜明。标记后能保持生物学活性和免疫活性 标记方法简单、快速。安全无毒二、荧光抗体的制备 1 荧光素与抗体结合（标记）2 荧光抗体的纯化 3 荧光抗体的鉴定 1荧光素与抗体结合方法：透析法：适
4、用于蛋白质含量低、样品体 积小的抗体溶液的标记 标记较均匀，非特异荧光较低 搅拌法：适用于蛋白质含量较高、样品 体积较大的抗体溶液的标记 标记时间短、效率较高，荧光 素用量节省 影响因素多，非特异荧光较强 透析法第一步：将含10mg/ml的Ig溶液10ml 装入透析袋。第二步：将上述透析袋放入烧杯中：含0.1mg/ml FITC的 pH=9.4的碳酸盐缓冲液100ml。第三步：4磁力搅拌24h。第四步：取出透析袋，进行纯化、鉴定。搅拌法第一步：将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。第二步：加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml 第三步：25磁力搅拌下，逐滴加入 1
5、ml含2mg的FITC溶液第四步：25下搅拌1h，4下继续搅拌 4h，然后进行纯化、鉴定。2荧光抗体的纯化：除去未结合荧光素 除去标记不适当的抗体 除去非特异反应物质 除去未结合荧光素：A 透析法：将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流动的自来水中透析约10min，然后移入pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，在4下透析，直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为止。B 凝胶过滤法：葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后，上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml。除去标记不适当的抗体：采用DEAE纤维
6、素离子柱。将DEAE纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行分步洗脱。未结合荧光素的抗体，所帶负电少，最先洗出。过量结合荧光素的抗体，所帶负电多，最后洗出。除去非特异反应物质：将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其它组织的组织粉预先吸收。按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合，4磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液，在用50mg/ml比例重复一次。3荧光抗体的鉴定：抗体含量测定：双扩法 结合比率(F/P)测定：分光光度法，并按下式计算：FITC:F/P=2.87A495/(A280-0.35A495)RB和TRITC:F/P=A515/A280 *F
7、/P值高则抗体分子结合的荧光素多。*固定标本染色以F/P=1.5左右为宜 *活细胞染色以F/P=2.4左右为宜三、荧光抗体技术：抗原片的制作 试验类型 荧光显微镜检查抗原片的制作1 制作：临床常见的标本有组织、细胞细菌三大类。可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗原片。2 标本的固定：固定目的防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。易于保存。（但CD、SIg的检测不进行固定，而采用活细胞染色）。常用的固定方法：抗原 固定剂 固定方法蛋白质 95%乙醇 室温310min或430min Ig类 甲醇 同上酶类 丙酮 同上激素 CCl
8、4 同上类脂质 10%福尔马林 室温310min多糖(细菌)10%福尔马林 室温310min或430min 丙酮、甲醇病毒 无水乙醇 室温510min或43060min 丙酮、CCl4 或-20 60min以上试验类型 1 直接法 2 间接法 3 补体结合法 4 双标记法 抗原标记抗体光原荧光直接法原理示意图间接法原理示意图抗原抗体标记抗体光原荧光补体抗体标记抗补体抗体光源荧光补体结合法原理示意图荧光显微镜检查：（由实验课介绍）三、其它免疫荧光技术1流式细胞仪2时间分辨免疫荧光技术3荧光偏振免疫分析技术时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluoresence immunoass
9、ay,TR-FIA)基本原理是：利用具有双功能基团结构的螯合剂，将镧系元素标记到抗体（或抗原）上，经免疫反应形成复合物，由于镧系元素能发出荧光，故分离除去未结合的成分后，利用时间分辨荧光仪即可测定荧光强度，从而推测待测物含量。时间分辨荧光测定的特点：1 采用脉冲光源(每秒闪烁1000次以上的氙灯),照射样品后即暂短熄灭.2 以电子设备控制延缓时间，待非特异本底荧 光衰退后，再测镧系荧光。3 镧元素具有较长的荧光寿命(105ns)，延缓测量时 间，能有效地消除非特异本底荧光(10ns)的干扰，4 镧系螯合物的激发光与荧光发射峰之间的波长差 异(即较大的Stokes位移），有利于排除非特异性 荧光干扰，提高检测特异性。镧系元素有Eu、Sm Tb、Nd 和Dy等，其中以Eu最为常用。5 测定技术类型有：竞争法、夹心法、间接法等。荧光偏振免疫分析技术（fluorescence polarization immunoassay,FPIA）是利用荧光素经单一波长的偏振光照射后吸收光能，释放出相应的偏振荧光，荧光偏振程度与荧光分子大小成正比的关系而建立的免疫分析技术；技术类型主要采用竞争法。四、荧光免疫技术的新发展：上转磷光技术的进展
