1、免疫组化技术及注意事项免疫组化技术及注意事项n免疫组化是利用免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合抗原与抗体特异性结合的原理，的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、荧光素、酶、金属离子、同位素金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的，对其进行定位、定性及定量的研究。研究。n根据标记物的不同分为：根据标记物的不同分为：免疫酶法、免疫荧光法、免疫酶法、免疫荧光法、亲和组织化学法亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法及放、免疫铁蛋白法、免疫金法及放射免疫自影法等。其中前三种最常
2、用。射免疫自影法等。其中前三种最常用。抗原抗体的特异性结合抗原抗体的特异性结合n免疫酶法免疫酶法 n以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色以酶作为标记物与外加底物作用后产生不溶性色素，沉积于抗原和抗体反应的部位素，沉积于抗原和抗体反应的部位 n酶降解底物的量与色泽浓度成正比，可反映被测酶降解底物的量与色泽浓度成正比，可反映被测定的抗原或抗体的量定的抗原或抗体的量 n常用的标记酶：常用的标记酶：HRP、AP、GOD酶标抗体法酶标抗体法非标记抗体酶法非标记抗体酶法免疫酶染免疫酶染色方法色方法直接法直接法间接法间接法酶桥法酶桥法 PAP法法(过氧化酶抗过氧化酶法过氧化酶抗过氧化酶法)n免疫荧光法
3、免疫荧光法n用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可用于免疫荧光的标记物是小分子的荧光素，可标记抗体或抗原标记抗体或抗原 n荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发荧光素经某种特定波长的光照射激发后，能发射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的射出一种比激发光波波长更长而且能量较低的荧光，籍此可作定位观察或示踪荧光，籍此可作定位观察或示踪 n借助于荧光显微镜进行观察借助于荧光显微镜进行观察 n常用的荧光素常用的荧光素：异硫氰酸荧光素：异硫氰酸荧光素(FITC)、四、四甲基异硫氰酸罗丹明甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)、四乙基罗丹明、四乙基罗丹明(RB200)、碘化丙啶、碘化丙啶(PI)等等n免
4、疫荧光染色法常用的有直接法和间接法免疫荧光染色法常用的有直接法和间接法 延髓延髓A2区中区中Fos和和TH荧光染色荧光染色大脑神经干细胞大脑神经干细胞n亲和组织化学法亲和组织化学法n是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础。为基础。n这种方法敏感性更高，有利于微量抗原这种方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗体抗体)在细胞或亚细胞水平的定位。在细胞或亚细胞水平的定位。n常用的有：亲和素常用的有：亲和素-生物素生物素-过氧化物酶复合物过氧化物酶复合物技术技术(ABC法法)、链亲和素链亲和素-生物素生物素-过氧化物酶过氧化物酶复合物技术复合物技术(SP法法
5、)。束缚-浸水应激引起的孤束核中Fos蛋白的表达(SP法)小鼠海马神经小鼠海马神经GFAP蛋白表达蛋白表达 1、实验前准备、实验前准备1.1 查阅相关文献资料查阅相关文献资料n中文：山师图书馆中文电子资源，清华同方、中文：山师图书馆中文电子资源，清华同方、北京万方、重庆维普期刊全文数据库。北京万方、重庆维普期刊全文数据库。n英文：英文：National Center for Biotechnology Information (http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)山师图书馆外文电子资源，山师图书馆外文电子资源，Springer、ProQuest、Kluwer全文数据库，或试用
6、电全文数据库，或试用电 子资源。子资源。1.2 所用抗体的选择和购买所用抗体的选择和购买n参考文献设计实验选择抗体参考文献设计实验选择抗体n种属来源：一抗常见兔、鼠、山羊、豚鼠种属来源：一抗常见兔、鼠、山羊、豚鼠n单或多克隆抗体：前者贵特异性高，后者相反单或多克隆抗体：前者贵特异性高，后者相反n双标或三标的要求：不同的一抗种属来源双标或三标的要求：不同的一抗种属来源n二抗选择和目标一抗同型或同亚型的抗体，二抗选择和目标一抗同型或同亚型的抗体，IgM，IgG1，2a，2b等。等。n公司：最好是国外著名生产抗体的大公司公司：最好是国外著名生产抗体的大公司n购买抗体购买抗体n抗体的实际使用范围：抗体
7、的实际使用范围：IHC-P,IHC-Fr,ICC,IF,IP,WB,En特异性，交叉反应特异性，交叉反应n一抗、二抗都能找到对应动物源后再订购一抗、二抗都能找到对应动物源后再订购n索取抗体索取抗体n一般已发表文献中描述的抗体，只需向作者礼一般已发表文献中描述的抗体，只需向作者礼貌地提出申请均能获得，只有当多抗已用尽或貌地提出申请均能获得，只有当多抗已用尽或供应非常短缺，作者才会婉转拒绝。供应非常短缺，作者才会婉转拒绝。n制备抗体制备抗体多克隆抗体的制备多克隆抗体的制备 n多克隆抗肽的抗血清是用天然蛋白抗原或肽多克隆抗肽的抗血清是用天然蛋白抗原或肽-载体蛋白偶联物作为抗原来制备得来的。载体蛋白偶
8、联物作为抗原来制备得来的。n可应用肌肉注射和皮下组织注射免疫法制备可应用肌肉注射和皮下组织注射免疫法制备抗血清，然后用亲和层析法进行特异性抗体抗血清，然后用亲和层析法进行特异性抗体纯化纯化n制备抗肽抗体的流程图制备抗肽抗体的流程图 单克隆抗体技术单克隆抗体技术1.3 抗体的保存抗体的保存n抗体浓度越高（浓度大于抗体浓度越高（浓度大于10mg/ml），越稳定，），越稳定，易保存；浓度低时，应加易保存；浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15NaN3防防腐剂以延长保存时间。腐剂以延长保存时间。n酶标记抗体在应用防腐剂
9、时要注意不能用酶标记抗体在应用防腐剂时要注意不能用NaN3，否则会抑制酶的活性。否则会抑制酶的活性。n抗体浓缩液抗体浓缩液-20保存两年，融解后抗体于保存两年，融解后抗体于2-8可以保存一个月，稀释抗体在可以保存一个月，稀释抗体在4下可存放下可存放1-3天，天，超过超过7天效价显著降低。天效价显著降低。1.4 抗体的分装抗体的分装n阅读抗体的阅读抗体的说明书说明书：背景、抗原、应用、保存：背景、抗原、应用、保存n分装：在洁净的环境下无菌操作，是否避光分装：在洁净的环境下无菌操作，是否避光n液体抗体：冰盒内直接分装，最少液体抗体：冰盒内直接分装，最少 10L/每管每管n干粉抗体：重构干粉抗体：重
10、构(最好用超滤水最好用超滤水)，加甘油，加甘油(-20)n分装的抗体密封，存储分装的抗体密封，存储(4 or-20)，荧光抗体，荧光抗体锡箔纸包裹避光锡箔纸包裹避光n用时取出一管，用时取出一管，存于存于4，避免反复冻融，用前稀，避免反复冻融，用前稀释。释。2、预实验、预实验2.1 掌握各种技术掌握各种技术n制作束缚制作束缚-浸水应激模型浸水应激模型n灌流固定脑组织：免疫组化染色的关键第一步，灌流固定脑组织：免疫组化染色的关键第一步，常规常规4%多聚甲醛多聚甲醛/PBS。长时间固定会使组织抗。长时间固定会使组织抗原的检出强度逐渐降低。原的检出强度逐渐降低。n脑组织和脑切片的保存：脑组织和脑切片的
11、保存：n包埋剂包埋快速冷冻，包埋剂包埋快速冷冻，-20保存保存n防冻液防冻液(20%丙三醇、丙三醇、30%乙二醇、乙二醇、50%PBS)中中-20保存保存n异戊烷中异戊烷中-70 保存保存n贴片脑切片室温晾干，贴片脑切片室温晾干，-20-80的冰箱保存的冰箱保存n脑立体定位脑立体定位n冰冻切片冰冻切片n减少冰晶减少冰晶:速冻或速冻或2030%蔗糖溶液蔗糖溶液4 脱水脱水n防止切片脱落：清洗载玻片，粘附剂处理防止切片脱落：清洗载玻片，粘附剂处理n脑切片染色：中性红、焦油紫、苏木精等脑切片染色：中性红、焦油紫、苏木精等中性红染色的大鼠脑切片中性红染色的大鼠脑切片2.2 免疫组化的方法免疫组化的方法
12、n贴片法：贴片法：孵育盒放平，防止切片干涸孵育盒放平，防止切片干涸 n漂片法：轻摇小瓶或培养板，使切片充分接触抗漂片法：轻摇小瓶或培养板，使切片充分接触抗体，冲洗充分体，冲洗充分2.3 抗体最佳稀释度确定抗体最佳稀释度确定n直接测定法：用已知阳性抗原切片进行免疫染色，标直接测定法：用已知阳性抗原切片进行免疫染色，标准是该浓度可使抗原特异且明显染色但背景无染色准是该浓度可使抗原特异且明显染色但背景无染色一抗稀释度一抗稀释度特异性染色特异性染色非特异性染色非特异性染色1:100+1:500+1:1000+1:2000+(-)1:3000+(-)阴性对照阴性对照(-)(-)n棋盘法：测定两种以上抗体
13、的最佳配合稀释度棋盘法：测定两种以上抗体的最佳配合稀释度 第第 一一 抗抗 体体第二抗体第二抗体1：5001：1000 1:20001：40001：100+(+)+(+)+()+(-)1：200+(+)+(-)+(-)+(-)1：400+(-)+(-)-括号内为背景染色结果括号内为背景染色结果 2.4 免疫组化染色对照的设计免疫组化染色对照的设计 免疫组化的质量取决于正确使用各种对照，没免疫组化的质量取决于正确使用各种对照，没有对照的免疫组化结果是毫无意义的。对照的有对照的免疫组化结果是毫无意义的。对照的设置在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除设置在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑
14、问。非特异性疑问。主要是针对一抗的对照，包括阴性对照、阳性主要是针对一抗的对照，包括阴性对照、阳性对照和自身对照。对照和自身对照。n阴性对照阴性对照 n空白对照：用空白对照：用PBS 代替第一抗体代替第一抗体n替代对照：用正常血清代替第一抗体替代对照：用正常血清代替第一抗体n抑制对照：标本加未标记的特异性抗体，再加抑制对照：标本加未标记的特异性抗体，再加酶或荧光标记的特异性抗体酶或荧光标记的特异性抗体n 吸收实验对照：将足量的抗原吸收实验对照：将足量的抗原(如如SP)加入相应加入相应的一抗的一抗(抗抗SP血清血清)孵育、离心、取上清液作为孵育、离心、取上清液作为第一抗体第一抗体n阳性对照阳性对
15、照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组织化学染色，对照切片应呈阳性织化学染色，对照切片应呈阳性n自身对照自身对照 同一切片上，不同组织成分或不同部位或神经核中同一切片上，不同组织成分或不同部位或神经核中的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比较。如应的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比较。如应为阳性的组织或部位是阳性，则免疫组化技术正确，为阳性的组织或部位是阳性，则免疫组化技术正确，如为阴性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量如为阴性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。有问题。替代对照替代对照PVN中中Fos表达表达3、免疫组化正式实验
16、、免疫组化正式实验3.1 步骤步骤组织组织固定固定冰冻冰冻切片切片阻断内阻断内源性酶源性酶封闭封闭处理处理一抗一抗处理处理二抗二抗处理处理显色显色复染复染脱水脱水透明透明封片封片3.2 注意事项注意事项n组织固定组织固定 保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性n固定液的选择固定液的选择：免疫组化技术成功与否的基础。：免疫组化技术成功与否的基础。不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有
17、固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有Bouins液、液、Zanbonis液、液、Karnovskys液液n组织固定时间：最好在组织固定时间：最好在l2h内，一般不应超过内，一般不应超过24h。随着固定时间的延长，组织抗原的检出强度将逐随着固定时间的延长，组织抗原的检出强度将逐渐降低渐降低 n固定方法：浸入法和灌注法固定方法：浸入法和灌注法n去除生物体自身含有的内源性酶去除生物体自身含有的内源性酶n灭活碱灭活碱(酸酸)性磷酸酶：左旋咪唑性磷酸酶：左旋咪唑(24mg/mL)加加入底物液中并保持入底物液中并保持pH7.68.2能除去大部分内源能除去大部分内源性碱性磷酸酶，酸性磷酸酶可用性碱性磷酸酶，
18、酸性磷酸酶可用0.05mol/L酒石酒石酸抑制酸抑制。n去除内源性过氧化物酶：去除内源性过氧化物酶：0.33过氧化氢甲醇过氧化氢甲醇液孵育液孵育1030min。甲醇对各种酶，都有钝化的。甲醇对各种酶，都有钝化的作用。作用。n去除内源性生物素去除内源性生物素 n正常组织细胞中含有生物素，特别是肝、脾、正常组织细胞中含有生物素，特别是肝、脾、肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合卵白素，形成卵染色中，内源性生物素易结合卵白素，形成卵白素一生物素复合物，导致假阳性白素一生物素复合物，导致假阳性n采用生物素方法染色前，将组织切片浸于采
19、用生物素方法染色前，将组织切片浸于0.01%卵白素溶液卵白素溶液室温处理室温处理20分钟，使其结合分钟，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。位点饱和，以消除内源性生物素的活性。n合理地使用封闭试剂合理地使用封闭试剂n一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色，因为抗体是高度的电荷分子，少背景的染色，因为抗体是高度的电荷分子，可能与带有相应电荷的组织成分非特异性地结可能与带有相应电荷的组织成分非特异性地结合合n要消除电荷吸附所造成的非特异性背景染色，要消除电荷吸附所造成的非特异性背景染色，可用可用二抗动物的二抗动物的210%非免疫血清或非
20、免疫血清或12%牛血牛血清白蛋白清白蛋白，以封闭吸附位点，以封闭吸附位点 n抗体的配制抗体的配制n根据一次实验所需的抗体量来决定配制的抗体根据一次实验所需的抗体量来决定配制的抗体量。量。n配制抗体的微量取样器一定要准确，最好专用。配制抗体的微量取样器一定要准确，最好专用。n根据抗体的使用说明书配制，一般可加去垢剂根据抗体的使用说明书配制，一般可加去垢剂 如如TritonX-100、Tween-20等等 n一抗孵育可在一抗孵育可在4过夜，或室温或过夜，或室温或37 几小时几小时nPBS的冲洗的冲洗n冲洗的冲洗的PBS为一次性，防止交叉污染为一次性，防止交叉污染n温柔冲洗，冲洗时间足够，一般冲洗温
21、柔冲洗，冲洗时间足够，一般冲洗35次次nPBS的的pH和离子强度的使用和要求和离子强度的使用和要求，中性及，中性及弱碱性条件弱碱性条件(pH7-8)有利于免疫复合物的形成，有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解解n显色系统显色系统n辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)：DAB或或AEC显色显色nDAB配制完后最长放置配制完后最长放置30 min，DAB显色最长显色最长不宜超过不宜超过10 min。n增强显色的方法：应用金属离子或有机复合物增强显色
22、的方法：应用金属离子或有机复合物溶剂在显色液中可增强溶剂在显色液中可增强DAB的显色效果。包括的显色效果。包括铜、锇、银、钴、镍、及米唑等。加入铜、锇、银、钴、镍、及米唑等。加入1重重金属离子金属离子(1：50)，可使显色明显增强，并发，可使显色明显增强，并发生变色反应。以生变色反应。以Ag、Co、Ni离子最好。离子最好。nAEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片以水性封片剂为主，染色切片不能久存。以水性封片剂为主，染色切片不能久存。n碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP)：最好选用：最好选用NBT/BCIP，而，而AP-Red、AP-Qrange、Fas-Red染
23、色结果均不染色结果均不能长期保存能长期保存 3.3 非特异性染色的出现非特异性染色的出现 逐一查找原因逐一查找原因 n是否有效地去除内源性酶是否有效地去除内源性酶n非免疫血清封闭是否正确非免疫血清封闭是否正确n一抗要合适，过高的浓度极易出现非特异性一抗要合适，过高的浓度极易出现非特异性n每步的冲洗是否干净每步的冲洗是否干净n组织切片在操作过程中是否曾经干涸组织切片在操作过程中是否曾经干涸 nDAB配置、使用、浓度是否准确配置、使用、浓度是否准确n检测系统是否与组织内源性蛋白有交叉反应检测系统是否与组织内源性蛋白有交叉反应4、免疫组化阳性结果的统计、免疫组化阳性结果的统计Image-Pro Pl
24、us的主要用途是分析测量图象的主要用途是分析测量图象照片中的黄色部照片中的黄色部分是免疫组化染分是免疫组化染色的阳性表达成色的阳性表达成分。处理目标是分。处理目标是通过测量图片中通过测量图片中黄色部分的黄色部分的黄黄度来反映相应蛋度来反映相应蛋白表达的的白表达的的量量4.1 校正光密度校正光密度n图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致 n计算机图片格式中，纯黑的点的计算机图片格式中，纯黑的点的“亮度亮度”为零，其为零，其灰度灰度gray=0；纯白点的；纯白点的“亮度亮度”为为255，其灰度，其灰度gray=255 n光密度光密度OD值：为吸收光线物
25、质的光学密度值：为吸收光线物质的光学密度n未校正前，未校正前，IPP用的是用的是gray灰度单位。浅色处灰灰度单位。浅色处灰度值大，深色处灰度值小度值大，深色处灰度值小n光密度校正的目的就是让照片上亮的、白的、染光密度校正的目的就是让照片上亮的、白的、染色浅的点的色浅的点的OD值显示为接近于零的小的数值，值显示为接近于零的小的数值，让暗的、黑的、染色深的阳性区域点的让暗的、黑的、染色深的阳性区域点的OD值显值显示为较大的数值示为较大的数值n光密度分析时必须对程序系统的光密度值进行转光密度分析时必须对程序系统的光密度值进行转换，从灰度数值转换为光密度数值单位换，从灰度数值转换为光密度数值单位n校正光密度的具体方法校正光密度的具体方法 n点点measure-calibaration intensityn点窗口里的点窗口里的 new按纽，新建一个按纽，新建一个caliberation set，在下面点击在下面点击std optical density。再点一下左上。再点一下左上方的方的system按纽。按纽。4.2 校正标尺校正标尺4.3 Count4.4 统计统计
