1、第二章第二章植物组织培养的一般技术植物组织培养的一般技术植物组织培养的一般技术植物组织培养的一般技术v操作技术操作技术v培养基的成分及作用培养基的成分及作用 v培养基的种类与选择培养基的种类与选择 v培养基的配制方法培养基的配制方法操作技术操作技术v洗涤洗涤 v灭菌灭菌v无菌操作无菌操作 v培养容器封口物的种类及制作培养容器封口物的种类及制作灭菌灭菌 v有菌的范畴有菌的范畴：凡是暴露在（未经处理的）空气中的物体，：凡是暴露在（未经处理的）空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都是有菌的。它的内部在未经证实之前，也应该作为
2、有菌物是有菌的。它的内部在未经证实之前，也应该作为有菌物体来看待。体来看待。v无菌的范畴无菌的范畴：经过高温灼烧或蒸煮过后的物体，经其他物：经过高温灼烧或蒸煮过后的物体，经其他物理或者化学灭菌方法处理过后的物体，是无菌的。高层大理或者化学灭菌方法处理过后的物体，是无菌的。高层大气、岩石的内部，健康的动物和植物不与内外部表面接触气、岩石的内部，健康的动物和植物不与内外部表面接触的组织内部很可能是无菌的。强酸强碱、化学灭菌剂等表的组织内部很可能是无菌的。强酸强碱、化学灭菌剂等表面和内部是无菌的。面和内部是无菌的。无菌的世界远远小于有菌的世界！无菌的世界远远小于有菌的世界！灭菌灭菌v培养基的灭菌培养
3、基的灭菌v不耐热的物质将采用不耐热的物质将采用过滤灭菌过滤灭菌v玻璃器皿及耐热用具等可采用玻璃器皿及耐热用具等可采用干热灭菌干热灭菌v用于无菌操作的器械采用用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌灼烧灭菌v布制品采用布制品采用高压灭菌高压灭菌v其他其他v植物材料的表面灭菌植物材料的表面灭菌培养基的成分及作用培养基的成分及作用v在完善的培养基配方中至少应包括下述几个部分：在完善的培养基配方中至少应包括下述几个部分：大量元素大量元素 微量元素微量元素 铁盐铁盐 有机成分有机成分 琼脂琼脂 糖糖 植物激素植物激素 PHPH 其它成分其它成分 大量元素大量元素v植物所需要的元素，其浓度大于植物所需要的元素，其浓
4、度大于0.50.5毫摩尔毫摩尔/升应该属于大升应该属于大量元素量元素v大量元素包括大量元素包括C C、H H、O O、N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S等九种元素，等九种元素，他们占植物干重的百分之几十到万分之几他们占植物干重的百分之几十到万分之几v生理作用：生理作用：1 1）参与肌体构造；）参与肌体构造；2 2）构成一些特殊的生理活）构成一些特殊的生理活性物质；性物质；3 3）电化学方面的作用）电化学方面的作用:维持离子浓度平衡，胶体维持离子浓度平衡，胶体稳定，电荷平衡稳定，电荷平衡；4 4）发育方面起的作用：影响植物组织发育方面起的作用：影响植物组织形态发生、器官形成。形态
5、发生、器官形成。微量元素微量元素v植物所需要的元素，其浓度小于植物所需要的元素，其浓度小于0.50.5毫摩尔毫摩尔/升应该属升应该属于微量元素。于微量元素。v 微量元素包括微量元素包括FeFe、CuCu、MoMo、ZnZn、NaNa、MnMn、CoCoB B和和I I等，等，通常培养基中添加通常培养基中添加1010-7-71010-5-5就可满足需要就可满足需要v生理作用生理作用：酶的催化、细胞分化和维持细胞完整机能：酶的催化、细胞分化和维持细胞完整机能等方面等方面 多年的研究结果：多年的研究结果：CuCu有促进离体根生长的作用；有促进离体根生长的作用；MoMo是合成活跃硝酸还原酶所必不可少的
6、元素，也是合成活跃硝酸还原酶所必不可少的元素，也是固氮酶的组成部分，还有防止叶绿素受破坏的作是固氮酶的组成部分，还有防止叶绿素受破坏的作用；用；MgMg、ZnZn、NaNa是酶的组成成份，也有防止叶绿素破是酶的组成成份，也有防止叶绿素破坏的作用；坏的作用；MnMn与植物的呼吸作用和光合作用有关；与植物的呼吸作用和光合作用有关；B B与糖的运输、蛋白质的合成有关。与糖的运输、蛋白质的合成有关。当缺乏某种元素时，往往会表现一些当缺乏某种元素时，往往会表现一些缺素症：缺素症：缺缺N N：某些组织呈现鲜艳的花色素苷的色彩，导某些组织呈现鲜艳的花色素苷的色彩，导管不能形成；管不能形成；缺缺N N、P P
7、、K K：细胞变得肥肿而形成层组织减少；细胞变得肥肿而形成层组织减少；缺缺S S：产生非常明显的黄萎病；缺产生非常明显的黄萎病；缺FeFe：细胞分裂细胞分裂停止；停止；缺缺B B：细胞分裂和细胞生长延缓；细胞分裂和细胞生长延缓；缺缺MnMn或或MoMo：生长受影响。生长受影响。铁盐铁盐v采用硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠结合成螯合铁配采用硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠结合成螯合铁配置而成置而成v作用作用：促进细胞的分裂与生长；影响叶绿体的结构：促进细胞的分裂与生长；影响叶绿体的结构组成与叶绿素的形成。组成与叶绿素的形成。有机成分有机成分v维生素类维生素类：植物组织培养中经常使用维：植物组织培养中经常使
8、用维C C、维维B1B1（盐酸硫胺盐酸硫胺素）、维素）、维B6B6（盐酸吡哆素）、维盐酸吡哆素）、维H H（生物素）、叶酸和烟酸生物素）、叶酸和烟酸等，一般使用的浓度为等，一般使用的浓度为0.1100.110mg/lmg/lv肌醇肌醇：本身没有促进生长的作用，但有助于活性物质的发挥，：本身没有促进生长的作用，但有助于活性物质的发挥，并参与糖代谢，能使培养组织快速生长，对胚状体和芽的形并参与糖代谢，能使培养组织快速生长，对胚状体和芽的形成有良好的影响成有良好的影响v氨基酸氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、：甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白、水解乳蛋白水解酪
9、蛋白、水解乳蛋白v有机添加物有机添加物：椰乳、香蕉等：椰乳、香蕉等 琼脂琼脂v一种从海藻中提取出来的凝固剂，一般使用浓度一种从海藻中提取出来的凝固剂，一般使用浓度为为0.6%1%0.6%1%。以前使用琼脂条，现在使用琼脂粉，以。以前使用琼脂条，现在使用琼脂粉，以色白、洁净的为好。色白、洁净的为好。糖糖v糖的作用糖的作用：a.a.作为作为C C源，为细胞提供合成新化合物的碳骨架；源，为细胞提供合成新化合物的碳骨架；b.b.为细胞的呼吸代谢提供底物与能源；为细胞的呼吸代谢提供底物与能源；c.c.维持一定的渗透维持一定的渗透势。势。v使用最广泛的是蔗糖和葡萄糖，一般的使用浓度为使用最广泛的是蔗糖和葡
10、萄糖，一般的使用浓度为2%4%2%4%。v一般来说，以蔗糖做糖原时，离体的双子叶植物的根生长一般来说，以蔗糖做糖原时，离体的双子叶植物的根生长得最好，而以葡萄糖为得最好，而以葡萄糖为C C源时，单子叶植物的根生长得最好。源时，单子叶植物的根生长得最好。v为了节省成本，一般选用食用白糖。为了节省成本，一般选用食用白糖。植物激素植物激素v生长素类生长素类v细胞分裂素类细胞分裂素类v其它植物激素其它植物激素赤霉素（赤霉素（GAGA3 3）脱落酸脱落酸（ABAABA）多效唑（多效唑（PPPP333333）生长素类生长素类v主要作用主要作用：诱导愈伤组织的形成、胚状体的产生以及试管苗：诱导愈伤组织的形成
11、、胚状体的产生以及试管苗的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽和的生根，更重要的是配合一定比例的细胞分裂素诱导腋芽和不定芽的产生。不定芽的产生。v常用的生长素类物质常用的生长素类物质：2 2，4 4D D（2 2，4 4二氯苯氧乙酸）、二氯苯氧乙酸）、NAANAA（奈乙酸）奈乙酸）、IAAIAA（吲哚乙酸）、吲哚乙酸）、IBAIBA（吲哚丁酸）。吲哚丁酸）。v它们作用强弱顺序它们作用强弱顺序：2 2，4 4D D NAAIBAIAANAAIBAIAA细胞分裂素类细胞分裂素类v主要作用主要作用：促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、：促进细胞的分裂和器官的分化、延缓组织的衰老、
12、增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著增强蛋白质的合成、抑制顶端优势、促进侧芽的生长及显著改变其它的激素作用。改变其它的激素作用。v常用的细胞分裂素类有常用的细胞分裂素类有：KT(KT(激动素激动素)、6-6-BA(6-BA(6-苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)、ZTZT（玉米素）、玉米素）、2 2iPiP（2 2异戊烯腺嘌呤）、异戊烯腺嘌呤）、4 4PUPU、CPPUCPPU（吡效隆）和吡效隆）和TDZTDZ（噻重氮苯基脲）。噻重氮苯基脲）。v作用的强弱顺序作用的强弱顺序：TDZ,4PU ZT 2TDZ,4PU ZT 2iPiP 6-BA KT 6-BA KT。PHPHv培养基培养基的的
13、PHPH值，直接影响离子的吸收，过酸过碱对材料的值，直接影响离子的吸收，过酸过碱对材料的生长都不利。生长都不利。v对大多数植物来说，灭菌之前培养基的对大多数植物来说，灭菌之前培养基的PHPH调到调到5.66.05.66.0能能达到要求。主要用达到要求。主要用KOHKOH和和HClHCl来调节。来调节。v一般来说，当一般来说，当PHPH值高于值高于6 6时，培养基会变硬，低于时，培养基会变硬，低于5 5时琼脂时琼脂不能很好的凝固。不能很好的凝固。其它成分其它成分v活性碳活性碳v硝酸银硝酸银v香蕉泥、椰乳香蕉泥、椰乳v抗生素类物质抗生素类物质培养基的种类与选择培养基的种类与选择v培养基的种类培养基
14、的种类v培养基的选择培养基的选择培养基选择培养基选择常用的试验方法常用的试验方法培养基的种类培养基的种类v第一类为含盐量高的基本培养基，第一类为含盐量高的基本培养基，如如MSMS、LSLS、BLBL、ERER。v第二类为硝酸钾含量高的基本培养基，如第二类为硝酸钾含量高的基本培养基，如B5B5、N6N6、SHSH。v第三类是无机盐中等含量培养基，如第三类是无机盐中等含量培养基，如H H基本培养基和基本培养基和NitschNitsch基本培养基。基本培养基。v第四类为低盐含量基本培养基，如第四类为低盐含量基本培养基，如WhiteWhite、WSWS和和HEHE基本基本培养基。培养基。培养基选择培养
15、基选择1 1、基本培养基的选择、基本培养基的选择（1 1）在选择一种新的植物材料进行组织培养时，为了尽）在选择一种新的植物材料进行组织培养时，为了尽快建立起再生体系，最好选择常用的一些培养基快建立起再生体系，最好选择常用的一些培养基 ，如如MSMS培养基；培养基；（2 2）如果）如果MSMS培养基不理想，可首先降低它的浓度；培养基不理想，可首先降低它的浓度；（3 3）其次再）其次再选择在配料成分上与选择在配料成分上与MSMS有显著不同的其它培有显著不同的其它培养基加以试用对比养基加以试用对比 。培养基的选择培养基的选择2 2、激素浓度和相对比例的确定激素浓度和相对比例的确定 在试验中，首先应参
16、考已有的报道，看是否有用在试验中，首先应参考已有的报道，看是否有用相同的植物、相同的组织或相近者做过成功或失败相同的植物、相同的组织或相近者做过成功或失败的试验，如果有则可直接作参考；如果没有，则在的试验，如果有则可直接作参考；如果没有，则在建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择建立激素配比中，将每一种拟使用的激素选择3 35 5个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方个水平，再按随机组合的方式建立起如下的实验方案。案。1616种激素配比实验方案种激素配比实验方案细胞分裂素浓度/mgL1 生长素浓度/mgL1 0.5 1.5 3 4.5 0 1 2 3 4 0.5 5 6 7 8 1.0
17、 9 10 11 12 2.0 13 14 15 16 细胞分裂素浓度/mgL1 生长素浓度/mgL1 1.0 1.25 1.50 1.75 0.25 1 2 3 4 0.5 5 6 7 8 0.75 9 10 11 12 常用的试验方法常用的试验方法1 1、预备实验、预备实验2 2、单因子实验、单因子实验3 3、多因子实验及正交设计、多因子实验及正交设计4 4、广谱实验法、广谱实验法5 5、逐步添加和逐步排除的实验方法逐步添加和逐步排除的实验方法 培养基的配制方法培养基的配制方法v培养基成分的浓度换算培养基成分的浓度换算体积百分比浓度体积百分比浓度重量百分比浓度重量百分比浓度摩尔浓度摩尔浓度
18、v培养基母液的配制培养基母液的配制大量元素母液的配制大量元素母液的配制微量元素母液的配制微量元素母液的配制 铁盐母液配制铁盐母液配制植物生长调节物质及其他有机物质母液的配制植物生长调节物质及其他有机物质母液的配制 培养基配制程序培养基配制程序过滤灭菌装置过滤灭菌装置总结总结v通过本章内容的学习通过本章内容的学习掌握组织培养的一般操作技术掌握组织培养的一般操作技术理解培养基的成分及作用理解培养基的成分及作用了解培养基的种类与选择了解培养基的种类与选择无菌操作大量元素母液的配制大量元素母液的配制v大量元素母液浓度一般为原培养基浓度的大量元素母液浓度一般为原培养基浓度的1010、2020或或5050
19、倍，有时也可用倍，有时也可用l00l00倍，倍数不宜过高，也不宜过倍，倍数不宜过高，也不宜过低。低。v有时有时将将CaClCaCl2 2 2H 2H2 2O O单独配制保存，以免长期贮存发单独配制保存，以免长期贮存发生沉淀。生沉淀。v将全部大量元素配在一起时，为防止在混合时发生将全部大量元素配在一起时，为防止在混合时发生沉淀，须在各药品充分溶解后，按表中顺序混合，沉淀，须在各药品充分溶解后，按表中顺序混合，氯化钙最后加入，以免与硫酸镁形成沉淀。氯化钙最后加入，以免与硫酸镁形成沉淀。v称量大量元素的化合物用感量为称量大量元素的化合物用感量为0.010.01克的扭力天平克的扭力天平即可。即可。微量
20、元素母液的配制微量元素母液的配制v微量元素母液浓度宜为原培养基配方中用量的微量元素母液浓度宜为原培养基配方中用量的100100倍。倍。v一般将微量元素分别称量溶解，贮存在一个瓶个，一般将微量元素分别称量溶解，贮存在一个瓶个，但也有将但也有将KIKI分别配制，单独贮存在棕色瓶中。分别配制，单独贮存在棕色瓶中。v称量微量元素化合物宜用感量为称量微量元素化合物宜用感量为0.00010.0001g g的电子分析的电子分析天平。天平。铁盐母液配制铁盐母液配制v培养基中的铁盐母液一般单独配制培养基中的铁盐母液一般单独配制v目前常用的铁盐为硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠目前常用的铁盐为硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠
21、的螯合物的螯合物v配制时，用感量为配制时，用感量为0.010.01g g的扭力天平称取的扭力天平称取植物生长调节物质母液的植物生长调节物质母液的配制配制v植物生长调节物质如生长素类植物生长调节物质如生长素类(IAAIAA，NAA)NAA)和细胞分裂和细胞分裂素类素类(KTKT，BA)BA)，可根据需要，灵活设计其浓度，一般可根据需要，灵活设计其浓度，一般为为0.010.01，0.10.1、0.20.2、0.50.5和和2 2mg/Lmg/L。一般用感量为一般用感量为0.00010.0001g g的电子分析天平称量。的电子分析天平称量。IAAIAA要用棕色瓶，暗中要用棕色瓶，暗中贮存，以免光照分
22、解。贮存，以免光照分解。其他有机物质母液的其他有机物质母液的配制配制v椰乳：采集到椰子时应检查其汁液椰乳：采集到椰子时应检查其汁液(保证没变质保证没变质)，首先将椰，首先将椰乳混合，用纱布或滤纸过滤去渣。将滤液放入乳混合，用纱布或滤纸过滤去渣。将滤液放入8080水浴中保水浴中保温温2020minmin，冷却后用滤纸滤去蛋白，用微孔滤膜过滤灭菌；冷却后用滤纸滤去蛋白，用微孔滤膜过滤灭菌；也可经高压灭菌也可经高压灭菌(120(120下下1515分钟分钟)，冷却后过夜，第二天早，冷却后过夜，第二天早晨过滤，然后贮存在塑料容器中，一晨过滤，然后贮存在塑料容器中，一2020下保存。椰乳不宜下保存。椰乳不宜重复高温高压灭菌，以免破坏其有效成分。重复高温高压灭菌，以免破坏其有效成分。v酵母提取液一般在培养基配制时临时制备。根据用量称量酵酵母提取液一般在培养基配制时临时制备。根据用量称量酵母粉，加水加热至沸腾母粉，加水加热至沸腾3030分钟，然后过滤，去渣，取用滤液，分钟，然后过滤，去渣，取用滤液，或直接称量使用酵母膏。或直接称量使用酵母膏。
