1、化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术姓名：庞潇卿姓名：庞潇卿专业：生化与分子生物学专业：生化与分子生物学目录目录发光及化学发光的原理与分类发光及化学发光的原理与分类化学发光剂及其作用原理化学发光剂及其作用原理化学发光免疫分析的原理与操作化学发光免疫分析的原理与操作应用与发展前景应用与发展前景发光：发光：是指分子或原子中的电子吸收能量后，由是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态基态（较低能级）跃迁到（较低能级）跃迁到激发态激发态（较高能级），（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。然后再返回到基态，并释放光子的过程。基态基态v0激发态激发态v能量能量h.v普朗克公式，普朗克公式，
2、能量能量=h.vh为普朗克常数，为普朗克常数，v为频率为频率发光发光发光的分类发光的分类是指发光剂（荧光素）是指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照经短波长的入射光照射后射后，电子吸收能量，电子吸收能量跃迁到激发态，在其跃迁到激发态，在其回复至基态时，回复至基态时，发射发射出较长波长的可见光出较长波长的可见光（荧光）。（荧光）。是指发生在生物体内是指发生在生物体内的发光现象的发光现象。如萤火。如萤火虫的发光，反应底物虫的发光，反应底物为萤火虫荧光素，在为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，荧光素酶的催化下，利用利用ATP能，生成激能，生成激发态氧化型荧光素，发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余它在
3、回复基态时多余的能量以光子的形式的能量以光子的形式释放出来。释放出来。是指伴随化学反应过是指伴随化学反应过程所产生的光的发射程所产生的光的发射现象。现象。某些物质（发某些物质（发光剂）在化学反应时光剂）在化学反应时吸收了反应过程中的吸收了反应过程中的化学能，使反应的产化学能，使反应的产物分子或中间态分子物分子或中间态分子中的电子跃迁到激发中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态态，当电子从激发态回复到基态时，以发回复到基态时，以发射光子的形式释放出射光子的形式释放出能量的现象。能量的现象。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:间接化学发光间接化学发光直接化学
4、发光直接化学发光 A+B C*C*C+h.v A+B C*C*+D C+D*D*D+h.v 化学发光的原理化学发光的原理化学发光的分类化学发光的分类酶促化学发光：酶促化学发光：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶-鲁米诺鲁米诺（HRP-Luminol）系统）系统 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（ALP）系统）系统 黄嘌呤氧化酶系统黄嘌呤氧化酶系统非酶促化学发光：非酶促化学发光：吖啶酯系统吖啶酯系统 草酸酯系统草酸酯系统 闪光（闪光（Flash）：）：发光时间在发光时间在数秒数秒内，如吖啶酯内，如吖啶酯辉光（辉光（Glow）：发光时间在发光时间在数十分钟数十分钟以上，如：以上，如：HRP-Luminol系统系统
5、 二氧杂环乙烷二氧杂环乙烷APAP发光（发光（AP-AMPPD）系统）系统 黄嘌呤氧化酶系统黄嘌呤氧化酶系统在化学发光反应中参与能量转移并最终以在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子发射光子的形式释放能量的化合物，称为的形式释放能量的化合物，称为或或。可分为。可分为直接化学直接化学发光剂发光剂和和酶促反应发光剂酶促反应发光剂。化学发光剂化学发光剂能作为能作为化学发光剂化学发光剂的条件：的条件：发光的量子发光的量子产率高产率高；它的物理它的物理-化学特性要与被标记或测定的化学特性要与被标记或测定的 物质物质相匹配相匹配；能与抗原或抗体形成能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物稳定的偶联结合物；
6、其化学发光常是其化学发光常是氧化反应氧化反应的结果；的结果；在所使用的浓度范围内对生物体在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性没有毒性。在发光免疫分析过程中在发光免疫分析过程中不需要酶不需要酶的催化作用，的催化作用，直接直接参与发光反参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的应，它们在化学结构上有产生发光的特特有基团有基团，可直接标记抗原或抗体。，可直接标记抗原或抗体。（一）直接化学发光剂（一）直接化学发光剂1.吖啶酯吖啶酯 2.三联吡啶钌三联吡啶钌吖啶酯吖啶酯 在在碱性条件碱性条件下被下被H2O2氧化氧化时，发出波时，发出波长为长为470 nm的光，具有很高的发光效率，其激的光，具有很高的发光
7、效率，其激发态产物发态产物 是该发光反应体系的发是该发光反应体系的发光体。光体。利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类发光，这一类需酶催化需酶催化后发光的发光剂称后发光的发光剂称为为。（二）（二）酶促反应发光剂：酶促反应发光剂：1.鲁米诺鲁米诺 2.AMPPD鲁米诺（鲁米诺（Luminol）发光原理）发光原理辣根过氧化酶辣根过氧化酶文字内容文字内容鲁米诺（鲁米诺（Luminol）增强发光反应原理）增强发光反应原理双负离子双负离子铁氰化钾催化铁氰化钾催化H2O2产生产生O23-氨基氨基-邻邻苯二甲酸苯二甲酸（激发态）（激发态）过氧化物不稳定，过氧
8、化物不稳定，分解产生分解产生N2(Chemiluminescence immunoass-ay,CLIA)，是将具有是将具有高灵敏度高灵敏度的化学发光测定技术的化学发光测定技术与与高特异性高特异性的免疫反应相结合，用于各种的免疫反应相结合，用于各种抗原抗原、半半抗原抗原、抗体抗体、激素激素、酶酶、脂肪酸脂肪酸、维生素维生素和和药物药物等等的检测分析技术。是继的检测分析技术。是继放射免疫分析放射免疫分析、酶免疫分析酶免疫分析、荧光免疫分析荧光免疫分析和和胶体时间分辨荧光免疫分析胶体时间分辨荧光免疫分析之后之后发展起来的一项新的免疫分析技术。发展起来的一项新的免疫分析技术。化学发光免疫分析化学发光
9、免疫分析化学发光免疫化学发光免疫分析类型分析类型直接化学发光直接化学发光免疫分析免疫分析化学发光酶化学发光酶免疫分析免疫分析电化学发光电化学发光免疫分析免疫分析一、直接化学发光免疫分析一、直接化学发光免疫分析用用吖啶酯吖啶酯直接标记抗体（抗原），与待测标本中直接标记抗体（抗原），与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成固相固相包被抗体包被抗体-待测抗原待测抗原-吖啶酯标记抗体复合物吖啶酯标记抗体复合物，这，这时只需加入时只需加入氧化剂（氧化剂（H2O2）和）和NaOH使成碱性环使成碱性环境，境，吖啶酯吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发在不需要催
10、化剂的情况下分解、发光光。由集光器和光电倍增管接收、记录由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间单位时间内所产生的光子能内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。含量。直接化学发光的机理直接化学发光的机理磁磁微粒微粒模式图模式图Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y特点特点n抗原和抗体结抗原和抗体结合与未合与未结
11、结合部分合部分的的易易分离分离磁微粒技术磁微粒技术磁性纳米粒子与无机或有机分磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料态复合材料 二、化学发光酶免疫分析二、化学发光酶免疫分析（Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用参与催化）是用参与催化某一化学发光反应的酶如某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（或碱性磷酸酶（ALP）来标记抗原或抗体，在与待来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形测
12、标本中相应的抗原（抗体）发生免疫反应后，形成成固相包被抗体固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶标记抗体复合物酶标记抗体复合物，经，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光，由发光，由光量子阅读系统光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。机数据处理系统，计算出测定物的浓度。该分析系统采用该分析系统采用辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（或抗原），在与反应体系中的标记抗体（或抗原），在与反应体
13、系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成成固相包被抗体固相包被抗体-待测抗原待测抗原-酶（酶（HRP）标）标记抗体复合物记抗体复合物，这时加入，这时加入鲁米诺发光剂、鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂和化学发光增强剂使产生化学发光。使产生化学发光。辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图 化学发光免疫分析仪化学发光免疫分析仪优点优点1.灵敏度高灵敏度高：CLIA关键的优越性，其灵敏度关键的优越性，其灵敏度可达可达10-16mol/L(RIA
14、为为10-12mol/L)。2.宽的线性动力学范围宽的线性动力学范围：发光强度在：发光强度在46个量个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。级之间与测定物质浓度间呈线性关系。3.光信号持续时间长光信号持续时间长：辉光型的：辉光型的CLIA产生的产生的光信号持续时间可达数小时甚至一天，简化了光信号持续时间可达数小时甚至一天，简化了实验操作及测量。实验操作及测量。4.分析方法简便快速分析方法简便快速：绝大多数分析测定均为：绝大多数分析测定均为仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式。仅需加入一种试剂（或复合试剂）的一步模式。5.结果稳定、误差小结果稳定、误差小：样品系直接自己发光，：样品系直接自己发
15、光，不需要任何光源照射，分析结果灵敏稳定可靠不需要任何光源照射，分析结果灵敏稳定可靠6.安全性好及使用期长安全性好及使用期长：免除了使用放射性物：免除了使用放射性物质。质。化学发光免疫分析的应用（一）化学发光免疫分析的应用（一）肺结核病常以人体血清中肺结核病常以人体血清中CA125 含量为疾病标记物，含量为疾病标记物，Wang 等建立了等建立了CA125 的毛细管化学发光免疫分析方法的毛细管化学发光免疫分析方法，以实现对肺结核病的检测。，以实现对肺结核病的检测。Knight 等采用等采用化学发光免疫夹心分析方法对梅毒病毒进行检测，化学发光免疫夹心分析方法对梅毒病毒进行检测，并与并与传统的分析方
16、法快速血浆素反应（传统的分析方法快速血浆素反应（RPR）和酶免疫分析方法（）和酶免疫分析方法（ELI SA）进行比较，通过对多种样品进行检测，并与）进行比较，通过对多种样品进行检测，并与RPR 及及ELISA分析方法分析方法结果相比有结果相比有 99.1的正确率。的正确率。甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）为肿瘤疾病标志物，）为肿瘤疾病标志物，Zhang 等利用磁性微粒子和包等利用磁性微粒子和包被小管建立了被小管建立了AFP 的化学发光酶免疫分析方法的化学发光酶免疫分析方法。在该方法中，。在该方法中，AFP抗抗体首先包被于两种不同的固相载体上，如磁性微粒子和包被小管，再体首先包被于两种不同的固相载体
17、上，如磁性微粒子和包被小管，再分别对这两种包被模式建立的化学发光免疫分析方法进行比较。通过分别对这两种包被模式建立的化学发光免疫分析方法进行比较。通过再抗体包被浓度、标记于抗体上再抗体包被浓度、标记于抗体上HRP 的稀释比例、分析所需时间、化的稀释比例、分析所需时间、化学发光动力学等角度进行衡量，显示磁性微粒子具有较大的优势。学发光动力学等角度进行衡量，显示磁性微粒子具有较大的优势。医学检测医学检测化学发光免疫分析的应用（二）化学发光免疫分析的应用（二）Quan 等建立了食品中等建立了食品中伏马菌素伏马菌素B1 的化学发光酶免疫分析方法的化学发光酶免疫分析方法，与伏，与伏马菌素马菌素B1 的的
18、 ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。且通过样倍。且通过样品的添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与品的添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分分析方法与析方法与 HPLC 方法有良好的相关性。方法有良好的相关性。Yang 等建立了食品中等建立了食品中葡萄球菌肠毒素葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化学发）的碳纳米管的化学发光免疫分析方法光免疫分析方法，通过将，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面抗体吸附在碳纳米管表面，然后将抗体，然后将抗体碳纳米管固定在聚碳酸酯表面，再通过增强化学发光免疫法测定碳纳米管固定在聚碳酸
19、酯表面，再通过增强化学发光免疫法测定SEB 含量。含量。Magliulo 等建立了等建立了牛奶中黄曲霉毒素牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶免疫分析方法的化学发光酶免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通过酶标二牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。Lin 等建立了等建立了农产品中黄曲霉毒素农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免疫分析方法的化学发光免疫分析方法。同时。同时，将建立的分析方法与黄曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关将建立的分析方法与黄曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试
20、验，相关系数为性试验，相关系数为0.9098，显示其有较好的应用前景。，显示其有较好的应用前景。食品安全检测食品安全检测化学发光免疫分析的应用（三）化学发光免疫分析的应用（三）Christian 等通过化学发光酶免疫分析方法建立了等通过化学发光酶免疫分析方法建立了环境内分泌干扰物环境内分泌干扰物炔雌醇的免疫分析方法炔雌醇的免疫分析方法，并通过建立的分析方法对表面水和污水处，并通过建立的分析方法对表面水和污水处理厂的污水中的炔雌醇进行测定。理厂的污水中的炔雌醇进行测定。Pittman 等通过磁性小珠和生物素等通过磁性小珠和生物素-亲和素为载体建立了亲和素为载体建立了水样和土样水样和土样中中2，4
21、，6-三硝基甲苯的免疫夹心电化学发光免疫分析方法三硝基甲苯的免疫夹心电化学发光免疫分析方法。Zhao 等通过建立等通过建立微板式磁化学发光酶免疫分析方法来对水样中微板式磁化学发光酶免疫分析方法来对水样中17 -雌二醇进行检测雌二醇进行检测。通过微板磁性分离器可避免前处理过程以达到高。通过微板磁性分离器可避免前处理过程以达到高通量分析，再结合高灵敏度的化学发光体系，建立了该方法。通量分析，再结合高灵敏度的化学发光体系，建立了该方法。环境科学环境科学发展与展望发展与展望 具有具有选择性好选择性好、灵敏度高灵敏度高、分析分析速度快速度快、设备简单设备简单等优点，近年来在环境、临床、食品、等优点，近年
22、来在环境、临床、食品、药物检测中得到了广泛运用。实际检测常常需要对大量、药物检测中得到了广泛运用。实际检测常常需要对大量、复杂、低丰度的样品进行测定，因而化学发光免疫分析法复杂、低丰度的样品进行测定，因而化学发光免疫分析法逐渐向逐渐向的方向发展。的方向发展。化学发光成像技术化学发光成像技术、化学发光免疫分析化学发光免疫分析与与分离技术分离技术的的联用，可以使免疫分析的选择性、灵敏度、检测速度和检联用，可以使免疫分析的选择性、灵敏度、检测速度和检测通量得到进一步提高。为了更好地适应临床、环境等领测通量得到进一步提高。为了更好地适应临床、环境等领域的实际应用，需要大力发展域的实际应用，需要大力发展
23、微型化微型化、集成化集成化和和自动化自动化的的化学发光免疫分析仪器化学发光免疫分析仪器。随着分子生物学及纳米与传感技。随着分子生物学及纳米与传感技术的进步，新的化学发光免疫分析原理与高灵敏的免疫分术的进步，新的化学发光免疫分析原理与高灵敏的免疫分析方法将得到不断发展，开发析方法将得到不断发展，开发催化活性更高催化活性更高、稳定性更好稳定性更好、发光动力学曲线更符合免疫分析发光动力学曲线更符合免疫分析的的酶酶和和底物底物并推广到临并推广到临床检测，发展床检测，发展新型标记技术新型标记技术用于信号放大，建立用于信号放大，建立化学发光化学发光免疫分析新方法免疫分析新方法，都将是未来的发展方向及研究重
24、点。，都将是未来的发展方向及研究重点。发展与展望发展与展望 目前化学发光免疫分析方法的发展趋势主要表现在：目前化学发光免疫分析方法的发展趋势主要表现在：（1）常见发光体系的不断完善，随着化学发）常见发光体系的不断完善，随着化学发光底物、氧化光底物、氧化剂、催化剂、增敏剂及固相材料剂、催化剂、增敏剂及固相材料研究的不断深入，性能研究的不断深入，性能更加优异的化学发光体系将在今后研究中不断涌现；更加优异的化学发光体系将在今后研究中不断涌现；（2）基因工程抗原、抗体的制备及广泛应用基因工程抗原、抗体的制备及广泛应用，将进一步促，将进一步促进化学发光免疫分析方法的发展；进化学发光免疫分析方法的发展；（3）化学发光免疫分析方法）化学发光免疫分析方法与包括毛细管电泳等其他方法与包括毛细管电泳等其他方法联用联用，将提高化学发光免疫分析的速度以及灵敏度，拓，将提高化学发光免疫分析的速度以及灵敏度，拓宽化学发光体系的应用范围。宽化学发光体系的应用范围。Thanks for your attention!Thanks for your attention!2013年12月16日
