1、微生物微生物分离方法分离方法常用常用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮步骤一步骤一步骤二步骤二步骤三步骤三步骤四步骤四将接种针上的细菌划于一个新的营养平板将接种针上的细菌划于一个新的营养平板上。此为第一菌区上。此为第一菌区 。步骤五步骤五微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法重复第一步骤，将接种针以火焰灭菌法灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。灭菌，然后轻触琼脂无菌处冷却。步骤六步骤六微生物微生物分离方
2、法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮由第五步骤的第一区中划出第二区由第五步骤的第一区中划出第二区步骤七步骤七微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮重复第六以及第七步骤，由第七步骤的重复第六以及第七步骤，由第七步骤的第二区中划出第三区。第二区中划出第三区。步骤八步骤八微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮重复第六以及
3、第七步骤，由第八步骤的第三重复第六以及第七步骤，由第八步骤的第三区中划出第四区，划满剩下的空间。区中划出第四区，划满剩下的空间。步骤九步骤九微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 在营养平板上贴好标在营养平板上贴好标签，标示好接种日期、操签，标示好接种日期、操作者姓名、菌种学名以及作者姓名、菌种学名以及培养基名称。培养基名称。步骤十步骤十微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮二、二、微生物微生物分
4、离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 乳酸菌的概念及其分布乳酸菌的概念及其分布 并非生物分类学名词，而是指能够并非生物分类学名词，而是指能够利用发酵性糖类产生大量乳酸的一类细利用发酵性糖类产生大量乳酸的一类细菌的统称。乳酸菌生成的乳酸，能抑制菌的统称。乳酸菌生成的乳酸，能抑制一些腐败细菌的活动。一些腐败细菌的活动。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌
5、菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮乳酸菌的发现乳酸菌的发现微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮酸奶中的乳酸菌酸奶中的乳酸菌乳酸球菌乳酸球菌乳酸杆菌乳酸杆菌微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮乳酸菌主要分布在：乳酸菌主要分布在：乳杆菌属（乳杆菌属（Lactobacillus）链球菌属（链球菌属（Streptococcus）微生物微生物分离方法分离方法
6、常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮明串珠菌属（明串珠菌属（Leuconostoc）片球菌属（片球菌属（Pediococcus）微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮双歧杆菌属（双歧杆菌属（Bifidobacterium）微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮各式乳酸杆菌各式乳酸杆菌微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生
7、物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮各式乳酸球菌各式乳酸球菌微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮双歧杆双歧杆菌菌微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮泡菜坛中的乳酸菌泡菜坛中的乳酸菌微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方
8、法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮乳酸菌的分离乳酸菌的分离 一般实验室分离来源：乳制品、一般实验室分离来源：乳制品、葡萄酒、酸泡菜、酱醪、醋醪等。葡萄酒、酸泡菜、酱醪、醋醪等。链球菌属分离用培养基：链球菌属分离用培养基：醋酸亚铊琼脂培养基（链球菌属）醋酸亚铊琼脂培养基（链球菌属）:pH6.0，35-37，12h，粪链球粪链球菌菌落中央红色，边缘白色；乳菌菌落中央红色，边缘白色；乳链球菌菌落深红色。链球菌菌落深红色。西红柿汁琼脂培养基（乳杆菌）：西红柿汁琼脂培养基（乳杆菌）：白色小菌落。白色小菌落。微生物微生物
9、分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 有些霉菌也能产生大量乳酸，这有些霉菌也能产生大量乳酸，这些霉菌也是乳酸菌吗？些霉菌也是乳酸菌吗？乳酸菌为何能抑制腐败细菌的活乳酸菌为何能抑制腐败细菌的活动？动？微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮1.2 微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮主要醋酸菌种主要醋酸菌种 纹
10、膜醋酸杆菌（纹膜醋酸杆菌（A.acetiA.aceti）培养时液面形成乳白色、皱褶状的粘性培养时液面形成乳白色、皱褶状的粘性菌膜。能产生葡萄糖酸及醋酸。菌膜。能产生葡萄糖酸及醋酸。奥尔兰醋酸杆菌（奥尔兰醋酸杆菌（A.orleanenseA.orleanense）法国奥尔兰地区用葡萄酒生产食醋的菌法国奥尔兰地区用葡萄酒生产食醋的菌种。种。许氏醋杆菌（许氏醋杆菌（A.schutzenbachiiA.schutzenbachii）法国著名的速酿食醋菌种，也是目前酿法国著名的速酿食醋菌种，也是目前酿醋工业重要的菌种之一。醋工业重要的菌种之一。醋酸杆菌醋酸杆菌AS 1.41AS 1.41 是我国酿醋工业
11、常用菌种之一。是我国酿醋工业常用菌种之一。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 实验室常用分离来源：醋、啤酒、实验室常用分离来源：醋、啤酒、果酒、酒曲、酒糟、柿饼、果汁等。果酒、酒曲、酒糟、柿饼、果汁等。分离用培养基：分离用培养基：曲汁琼脂曲汁琼脂,pH5.0,pH5.0，25-3025-30，培养，培养3 37 7天。天。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常
12、用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮酵母的分布酵母的分布 植物植物：苹果、谷物、葡萄、橄榄；：苹果、谷物、葡萄、橄榄；植物根际、茎、叶、花植物根际、茎、叶、花;
13、动物动物：鸟类、蚯蚓、鱼、人体、昆：鸟类、蚯蚓、鱼、人体、昆虫等虫等;食品或酿造物食品或酿造物：啤酒、奶油、罐头、：啤酒、奶油、罐头、奶酪、巧克力、水果、葡萄酒、蜂奶酪、巧克力、水果、葡萄酒、蜂蜜、泡菜、面团等蜜、泡菜、面团等;其它其它：土壤、石油、海水、淡水、：土壤、石油、海水、淡水、空气。空气。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮酵母分离用培养基酵母分离用培养基 豆芽汁琼脂豆芽汁琼脂 麦芽汁琼脂麦芽汁琼脂 苹果汁酵母膏琼脂苹果汁酵母膏琼脂 白垩琼脂白垩琼脂 赖氨酸琼脂赖氨酸琼脂 萨布德琼脂
14、萨布德琼脂微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮酵母分离用培养基的特点酵母分离用培养基的特点 最适最适pH4.5pH4.55.65.6（大部分酵母（大部分酵母pHpH 2.5时生长良好）；时生长良好）；琼脂量琼脂量3（pH低时琼脂不易凝低时琼脂不易凝固）；固）；加入加入0.25丙酸钠抑制霉菌；丙酸钠抑制霉菌；加入抗菌素抑制耐酸菌；加入抗菌素抑制耐酸菌；最适生长温度最适生长温度28283030（培养温培养温度根据需度根据需要要15-4515-45）。）。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物
15、微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮酿造业主要酵母菌种酿造业主要酵母菌种啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）典型的上面酵母，又称爱丁堡酵母。典型的上面酵母，又称爱丁堡酵母。广泛应用于啤酒、白酒酿造和面包广泛应用于啤酒、白酒酿造和面包制作。制作。在自然界中常出在自然界中常出现于现于水果水果、果汁果汁、花蜜及富含花蜜及富含糖类糖类的食品中的食品中。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离
16、方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌
17、醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮3.食品酿造中霉菌及其应用食品酿造中霉菌及其应用微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮属接合菌亚门，接合菌纲，毛霉目，属接合菌亚门，接合菌纲，毛霉目，毛霉科。毛霉科。具有很强的分解具有很强的分解的能力，常用于酿造、发酵食品的能力，常用于酿造、发酵食品等工业。等工业。微生物微生物分离方法分离方法常
18、常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 高大毛霉高大毛霉（Mucor mucedoMucor mucedo）产生）产生3-3-羟基丁酮、脂肪酶。羟基丁酮、脂肪酶。总状毛霉总状毛霉（Mucor racemosusMucor racemosus）毛霉）毛霉中分布最广的一种。我国四川的豆中分布最广的一种。我国四川的豆豉即用此菌制成。豉即用此菌制成。鲁氏毛霉鲁氏毛霉（Mucor rouxianusMucor rouxianus)最初最初从小曲中分离出来，产生蛋白酶，从小曲中分离出来，产生蛋白酶，有分解大豆的能力，我国多用它来有分解大
19、豆的能力，我国多用它来做豆腐乳。做豆腐乳。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物
20、微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮葡萄糖葡萄糖微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生
21、物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮霉菌的分离霉菌的分离 分布：土壤、食品、谷物；植物的分布：土壤、食品、谷物；植物的根、茎、叶、花、果实；动物的粪根、茎、叶、花、果实；动物的粪便；堆肥、生霉材料、某些化工原便；堆肥、生霉材料、某些化工原料等。料等。多数腐生，部分寄生或兼性寄生。多数腐生，部分寄生或兼性寄生。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮霉菌霉菌分离用培养基 土壤：马丁培养基，马铃薯葡萄糖琼脂土壤：马丁培养基，马铃薯葡萄糖琼脂（
22、PDAPDA，Potato-Dextrose-Agar）培养）培养基；基；食品：麦芽汁琼脂，察贝克琼脂，食品：麦芽汁琼脂，察贝克琼脂，PDAPDA，曲汁琼脂培养基；曲汁琼脂培养基；生霉材料：察贝克琼脂，生霉材料：察贝克琼脂，PDAPDA，麦芽汁，麦芽汁琼脂；琼脂；动物或昆虫：萨布德琼脂，牛肉浸汁，动物或昆虫：萨布德琼脂，牛肉浸汁，牛肉浸汁血琼脂，牛肉浸汁葡萄糖琼脂。牛肉浸汁血琼脂，牛肉浸汁葡萄糖琼脂。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮霉菌在食品工业中的应用霉菌在食品工业中的应用 酱油酿造酱油
23、酿造 酱类酿造酱类酿造 腐乳发酵腐乳发酵 柠檬酸发酵柠檬酸发酵微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮各类微生物生长适宜的各类微生物生长适宜的pH范围范围 细菌：细菌：7.08.0；放线菌：放线菌：7.58.5；酵母菌：酵母菌：3.86.0；霉菌：霉菌：4.05.8；藻类：藻类：6.07.0；原生动物：原生动物：6.08.0微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮三、菌种保藏的常用方法 菌种保藏有许多
24、的方法，其共同的目菌种保藏有许多的方法，其共同的目标是把菌株的优良性状保存下来，防标是把菌株的优良性状保存下来，防止退化、死亡或杂菌污染。保藏的一止退化、死亡或杂菌污染。保藏的一般程序是选取优良的纯菌种，最好是般程序是选取优良的纯菌种，最好是用其分生孢子或芽孢等休眠体，在其用其分生孢子或芽孢等休眠体，在其休眠和停止生长的条件下保藏。微生休眠和停止生长的条件下保藏。微生物生长要求适宜的温度、水分、空气物生长要求适宜的温度、水分、空气和营养物质等，如将菌种处于低温、和营养物质等，如将菌种处于低温、干燥、无氧和缺乏营养的条件下，就干燥、无氧和缺乏营养的条件下，就可以使菌种暂时处于休眠状态。可以使菌种
25、暂时处于休眠状态。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 低温保藏法低温保藏法 低温定期移植法低温定期移植法 石蜡油低温保藏法石蜡油低温保藏法 干燥保藏干燥保藏 甘油管保藏法甘油管保藏法 真空冷冻干燥法真空冷冻干燥法 液氮超低温保存液氮超低温保存 微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 这是一种常用的简便方法。一般的斜这是一种常用的简便方法。一般的斜面孢子、液态孢子、斜面种子以及用面孢子、液态孢子
26、、斜面种子以及用麸皮、大米、小米或碎玉米制成的孢麸皮、大米、小米或碎玉米制成的孢子，可以放在子，可以放在44冰箱内保藏，这种冰箱内保藏，这种温度条件下不能使菌体进入休眠，而温度条件下不能使菌体进入休眠，而仅是仅是抑制微生物的生命活动抑制微生物的生命活动。因此，。因此，保藏时间不宜过长，一般不超过保藏时间不宜过长，一般不超过1 12 2个月为宜。本方法虽然简便，但由于个月为宜。本方法虽然简便，但由于菌株处于较高的水平活性下，这对保菌株处于较高的水平活性下，这对保藏株的生产性状是不利的，因此，藏株的生产性状是不利的，因此，生生产菌种一般不采用此法保藏。产菌种一般不采用此法保藏。1 1、低温保藏法、
27、低温保藏法微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 问题问题 为何低温能保存菌种？为何低温能保存菌种？微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮把培养好的斜面菌种放在把培养好的斜面菌种放在4 4处保存，定期处保存，定期移植，一般移植，一般3 36 6个月移植一次个月移植一次(视菌种特视菌种特征而定征而定)。也可以用穿刺培养定期移植法保藏细菌，也可以用穿刺培养定期移植法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是将
28、含其效果也较好。穿刺培养是将含0.60.60.80.8的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷的琼脂培养基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直凝后，用接种针尖挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下刺入琼脂培养基中心，放在适当温度下培养，待菌长好后即可放培养，待菌长好后即可放低温低温保存，此保存，此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2 2年年以上不发生明显变异。以上不发生明显变异。2 2、低温定期移植法、低温定期移植法 微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复
29、壮提纯复壮 斜面定期移植与穿刺移植法有其缺斜面定期移植与穿刺移植法有其缺陷，即陷，即容易发生遗传变异；连续传容易发生遗传变异；连续传代可使一些生产性状丢失或减弱，代可使一些生产性状丢失或减弱，也易于污染杂菌。也易于污染杂菌。因此，一些贵重因此，一些贵重菌株及生产优良菌株不宜用此法保菌株及生产优良菌株不宜用此法保藏。藏。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 本方法的原理是在长好的斜面菌上本方法的原理是在长好的斜面菌上覆盖灭菌的液体石蜡，达到覆盖灭菌的液体石蜡，达到菌体与菌体与空气隔绝空气隔绝，使
30、菌处于生长和代谢停，使菌处于生长和代谢停止状态，同时石蜡油还止状态，同时石蜡油还防止水分蒸防止水分蒸发发，在低温下达到较长期的保藏菌，在低温下达到较长期的保藏菌种的目的。保藏温度要求在种的目的。保藏温度要求在-4-444下。液体石蜡法适用于不产孢子的下。液体石蜡法适用于不产孢子的菌种。菌种。3 3、石蜡油低温保藏法、石蜡油低温保藏法微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 具体操作是：菌种为斜面培养菌种，具体操作是：菌种为斜面培养菌种，斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡斜面不宜过长；选择纯净优质石蜡油
31、，置三角烧瓶中经过油，置三角烧瓶中经过121121高压蒸高压蒸汽灭菌汽灭菌1 12h2h，将其放，将其放4040温箱中，温箱中，去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油去除灭菌时渗入的水分，待石蜡油变得清澈透明后冷却即可加入斜面。变得清澈透明后冷却即可加入斜面。斜面上不能出现气泡，液蜡添加量斜面上不能出现气泡，液蜡添加量以高出斜面顶部约以高出斜面顶部约1cm1cm左右为宜。左右为宜。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 微生物生长需要水分，干燥法是使微生物生长需要水分，干燥法是使菌处于菌处于干燥条件下停
32、止生长及处于干燥条件下停止生长及处于休眠状态休眠状态，达到较长期保藏的目的。，达到较长期保藏的目的。此法用于细菌此法用于细菌芽孢芽孢或产或产分生孢子分生孢子的的菌种，是现在发酵工业生产中较常菌种，是现在发酵工业生产中较常用的菌种保藏方法。用的菌种保藏方法。为了转接方便，控制接种量以及对为了转接方便，控制接种量以及对菌种的保护作用，通常将菌种的分菌种的保护作用，通常将菌种的分生孢子、芽孢，甚至菌丝体吸附于生孢子、芽孢，甚至菌丝体吸附于一些载体表面放至干燥容器里进行一些载体表面放至干燥容器里进行常压干燥或真空干燥，所用载体有常压干燥或真空干燥，所用载体有沙土、滤纸、硅胶及大沙土、滤纸、硅胶及大(小
33、小)米米等。等。4 4、干燥保藏、干燥保藏微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮4.1 4.1 沙土管法沙土管法取取河河(海海)沙沙，过，过0.78mm(240.78mm(24目目)筛，用筛，用1010盐盐酸浸泡酸浸泡24h24h，倒去盐酸用清水冲洗至，倒去盐酸用清水冲洗至pHpH呈呈中性，去水烘干或晒干。中性，去水烘干或晒干。取取菜园或果园土菜园或果园土粉碎过筛，把烘干的沙土装粉碎过筛，把烘干的沙土装入指形管或高入指形管或高100mm100mm、直径为、直径为10mm10mm的小的小试管中，高
34、约试管中，高约1cm(1cm(约约2g)2g)，塞棉塞，塞棉塞121121灭灭菌菌1h1h，也可用，也可用1702h1702h干热灭菌干热灭菌(或蒸汽三或蒸汽三次间歇灭菌次间歇灭菌)，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤，蒸汽灭菌后需烘干。经肉汤检查确实证明无菌即可使用。检查确实证明无菌即可使用。将要保存的斜面菌种制成浓孢子悬液将要保存的斜面菌种制成浓孢子悬液(10(106 6个个/ml)/ml)，用灭菌滴管或吸管吸取孢子悬液，用灭菌滴管或吸管吸取孢子悬液滴入无菌沙土上，每管约滴入无菌沙土上，每管约0.30.30.5ml0.5ml，用，用接种环将其混合均匀。接种环将其混合均匀。微生物微生物分离方法分离方法
35、常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 也可将真菌分生孢子用接种环从斜面也可将真菌分生孢子用接种环从斜面直接挑取放入直接挑取放入沙土沙土中。然后将沙土管中。然后将沙土管抽真空以加速干燥抽真空以加速干燥。这时管内砂土松。这时管内砂土松散，表明已干燥。将干燥的砂土管放散，表明已干燥。将干燥的砂土管放置在干燥器或密闭容器内、干燥器下置在干燥器或密闭容器内、干燥器下部放置变色硅胶等部放置变色硅胶等干燥剂干燥剂，于，于44下下保存。保存。也可以将从斜面取出的孢子放入沙土也可以将从斜面取出的孢子放入沙土管中混匀后，可以管中混匀后，可以
36、不抽真空直接不抽真空直接放放干干燥器燥器内保存。内保存。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 在沙土保藏在沙土保藏初期，菌死亡率高，以后初期，菌死亡率高，以后逐渐减慢逐渐减慢，存活下来的孢子在以后保，存活下来的孢子在以后保存期间稳定性较好，保藏的有效时间存期间稳定性较好，保藏的有效时间与菌种存活率的关系见图与菌种存活率的关系见图2-102-10。用沙土管保藏的某些抗生素产生菌保用沙土管保藏的某些抗生素产生菌保藏期可达藏期可达1818年年(土霉素和链霉素产生土霉素和链霉素产生菌菌)到到2222年
37、年(新霉素产生菌新霉素产生菌)，但对利，但对利福霉素、卡那霉素、四环素等容易产福霉素、卡那霉素、四环素等容易产生变异的菌种，就不适合作长期的沙生变异的菌种，就不适合作长期的沙土管保存。土管保存。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮4.2 4.2 滤纸保藏法滤纸保藏法 本法是将要保藏的微生物本法是将要保藏的微生物细胞或孢子细胞或孢子吸吸附在灭菌滤纸上，附在灭菌
38、滤纸上，干燥干燥后后冷藏冷藏。其方法。其方法是是3#3#滤纸剪成滤纸剪成5mm5mm50mm50mm的小条，放的小条，放入干燥的培养皿中灭菌。入干燥的培养皿中灭菌。将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复将培养好的菌种用灭菌脱脂乳或奶粉复原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将准备原乳制成孢子悬液，用灭菌镊子将准备好的滤纸条在灭菌操作下浸入菌悬液中，好的滤纸条在灭菌操作下浸入菌悬液中，充分吸附菌细胞，取出后放入灭菌小试充分吸附菌细胞，取出后放入灭菌小试管或安瓿管中，在真空干燥机上抽干，管或安瓿管中，在真空干燥机上抽干，真空真空条件下火焰熔封，冷藏。条件下火焰熔封，冷藏。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微
39、生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮4.3 4.3 大大(小小)米保藏法米保藏法 是根据我国制曲原理加以改进的是根据我国制曲原理加以改进的一种方法。此法是将曲霉等大量一种方法。此法是将曲霉等大量产生孢子的菌直接培养在大产生孢子的菌直接培养在大(小小)米米培养基上，待孢子充分成熟后培养基上，待孢子充分成熟后干干燥燥后保藏。后保藏。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮4.4 4.4 麸皮保藏法麸皮保藏法 麸曲麸曲是是曲霉菌曲霉菌生长的粗
40、放固体酶制剂。麸生长的粗放固体酶制剂。麸皮中皮中碳水化合物和蛋白质碳水化合物和蛋白质含量极为丰富，含量极为丰富，含有提供曲霉生长的一切维生素、微量矿含有提供曲霉生长的一切维生素、微量矿质元素及其它生长因素。质元素及其它生长因素。麸皮本身又是固体酶制剂的良好载体，具麸皮本身又是固体酶制剂的良好载体，具有表面积大、吸水性好、通气优良等特点，有表面积大、吸水性好、通气优良等特点，是制曲的好原料。好的麸皮，碳水化合物是制曲的好原料。好的麸皮，碳水化合物和蛋白质含量十分协调，即和蛋白质含量十分协调，即碳氮比适当碳氮比适当，有利于曲霉菌的生长和产酶，而且其碳水有利于曲霉菌的生长和产酶，而且其碳水化合物的主
41、要成份是淀粉，是产生淀粉酶化合物的主要成份是淀粉，是产生淀粉酶的适宜诱导物。其蛋白质含量，也足以达的适宜诱导物。其蛋白质含量，也足以达到正常生产的酶活性。到正常生产的酶活性。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮什么是曲？什么是曲？周德庆周德庆 曲的构成与功能曲的构成与功能固体基质固体基质菌体（菌丝、孢子或细胞）：可用作种子菌体（菌丝、孢子或细胞）：可用作种子代谢产物代谢产物提供营养源提供营养源有利于疏松通气有利于疏松通气赋予曲的外形赋予曲的外形外酶类：可用作粗酶制剂外酶类：可用作粗酶制剂其它：
42、如柠檬酸、赤霉素、抗生素等其它：如柠檬酸、赤霉素、抗生素等微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮周德庆周德庆 曲既是酿造的曲既是酿造的酶制剂酶制剂，也是，也是保存酿造保存酿造用微生物用微生物的一种方式。用这种方法保的一种方式。用这种方法保存存根霉根霉、曲霉曲霉、青霉青霉、红曲霉红曲霉等属和等属和赤霉菌赤霉菌效果较好，经试验赤霉菌经过效果较好，经试验赤霉菌经过4 4年、红曲霉经过年、红曲霉经过1212年后仍然保持着年后仍然保持着生活活力。生活活力。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物
43、细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮本法也是利用微生物在低温时代谢和生本法也是利用微生物在低温时代谢和生理等生命活动受到抑制的原理达到保理等生命活动受到抑制的原理达到保藏目的。其方法是，将藏目的。其方法是，将80%80%的甘油高的甘油高压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌压蒸汽灭菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌水制成高浓度的菌悬液种用无菌水制成高浓度的菌悬液(10(108 810101010/ml)/ml)。取。取1ml1ml灭菌甘油放入灭菌甘油放入与甘油充分混匀，使甘油浓度约为与甘油充分混匀，使甘油浓度约为40%40%，于，于-20-20下冻存
44、。下冻存。5 5、甘油管保藏法、甘油管保藏法微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 真空冷冻干燥保藏法是兼具真空冷冻干燥保藏法是兼具低温、干燥、低温、干燥、除氧除氧三方面菌种保藏的主要因素，除不宜三方面菌种保藏的主要因素，除不宜于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、于丝状真菌的菌丝体外，对病毒、细菌、放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物放线菌、酵母及丝状菌孢子等各类微生物都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到都适用，不宜用冻干法保存的微生物不到2%2%。冷冻干燥保存的菌种存活时间长、效。冷冻干燥保存
45、的菌种存活时间长、效果好，一般菌种可保存果好，一般菌种可保存5 5年以上，有的可年以上，有的可保藏保藏1515年以上不发生变异。还具有体积小、年以上不发生变异。还具有体积小、不易污染、便于运输等优点，是一种不易污染、便于运输等优点，是一种最为最为广泛的菌种保藏方法广泛的菌种保藏方法。6 6、真空冷冻干燥法、真空冷冻干燥法微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结，然后在真空条件下干燥，使微生结，然后在真空条件下干燥，使微生物的生长和
46、酶活动停止。为了防止在物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，冷冻和水分升华过程中对细胞的损害，要采用要采用保护剂保护剂来制备细胞悬液，使菌来制备细胞悬液，使菌在冻结和脱水过程中起到保护作用。在冻结和脱水过程中起到保护作用。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 设备设备 冷冻干燥装置具有不同型号和类型，冷冻干燥装置具有不同型号和类型，但都由四个部分组成：但都由四个部分组成：干燥箱、蒸汽干燥箱、蒸汽捕集器、真空泵、冷冻系统捕集器、真空泵、冷冻系统。干燥箱。干燥箱可控制温
47、度范围为可控制温度范围为-40-404040。微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 本方法是近年推广使用的一种菌种保存法。本方法是近年推广使用的一种菌种保存法。大多数微生物如病毒、噬菌体，立克氏体，大多数微生物如病毒、噬菌体，立克氏体，各种细菌、放细菌、支原体，各种丝状菌、各种细菌、放细菌、支原体，各种丝状菌、酵母、藻类和原虫，特别是一些无法用冻酵母、藻类和
48、原虫，特别是一些无法用冻干保存的微生物，都可用此法长期保存。干保存的微生物，都可用此法长期保存。工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。工业微生物高产菌种也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在液氮保存的原理是微生物在-130-130以下温以下温度时，它的新陈代谢作用停止，化学反应度时，它的新陈代谢作用停止，化学反应也消失，而液氮温度可达也消失，而液氮温度可达-196-196，在这种，在这种情况下可以长期保存。情况下可以长期保存。7 7、液氮超低温保存、液氮超低温保存 微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提
49、纯复壮提纯复壮 菌种的提纯菌种的提纯 通过寄主体进行复壮通过寄主体进行复壮 淘汰已衰退的个体淘汰已衰退的个体 四、菌种的提纯与复壮四、菌种的提纯与复壮微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮 即从已即从已衰退衰退的菌种中，通过的菌种中，通过分离纯化分离纯化，将尚未，将尚未退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来退化的个体分离出来，以恢复和建立具有原来生产性状的群体，继续供科研及生产使用。生产性状的群体，继续供科研及生产使用。菌种提纯：一是只要求达到菌种提纯：一是只要求达到菌落纯化菌落纯化的水平，的
50、水平，通过稀释平板法、划线法等常规操作法，该方通过稀释平板法、划线法等常规操作法，该方法较为粗放，适用于菌退化不太严重的情况。法较为粗放，适用于菌退化不太严重的情况。另一类方法，可达到另一类方法，可达到“细胞纯细胞纯”的水平，采用的水平，采用单胞分离法，也可以二者结合，先用前一种方单胞分离法，也可以二者结合，先用前一种方法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步法获得较纯的菌种后再采用单胞分离法进一步纯化。纯化。1 1、菌种的提纯、菌种的提纯 微生物微生物分离方法分离方法常常 用用微生物微生物细细 菌菌乳酸菌乳酸菌醋酸菌醋酸菌霉霉 菌菌酵母菌酵母菌菌种保藏菌种保藏提纯复壮提纯复壮对于对于寄生性寄
