1、基因检测技术的临床应用价值和策略 内容提要内容提要?药物基因组学发展历程?临床基因检测的关注点?基因检测的临床应用价值?我们开展的一些工作 内容提要内容提要?药物基因组学发展历程?临床基因检测的关注点?基因检测的临床应用价值?我们开展的一些工作 药物基因组学的发展历程 1918 Marshall 报道人类对外源性化学品的反应具有多样性 1932 Snyder发现化学品反应的多样性与民族或种族之间存在有相关性 1956 Carson报道了葡萄糖6磷酸脱氢酶缺陷症 1957 Kalow and Genest 报道了血浆胆碱酯酶缺陷症 1959 Vogel F提出了遗传药理学的概念：基因在药物效应中
2、的作用 1960 Evans发现异烟肼的乙酰化具有多样性 1988 Gonzalez FJ 报道了细胞色数氧化酶P450 2D6基因的多态性 1997 药物基因组学概念的形成 2001 Wilson建立了评估遗传结构差异与药物反应相互关系的工作平台?药物基因组学是研究基因序列多态性与药物效应多样性之间的关系，即研究基因本身及其突变体与药物效应相互关系的一门科学?目标：提高药物疗效及安全性，研究影响药物吸收、转运、代谢、消除等个体差异的基因特性，以及基因变异所致的不同患者对药物的不同反应，并由此开发新的药物和用药方法?宗旨：实现个体化用药,以获得最佳疗效和最少不良反应?药物基因组学研究?基因组学
3、技术的作用?在新药研发中的作用?寻找新靶点，提高药物安全性?指导I期临床研究，缩短药物上市所需时间，保证有效性和安全性?老药的重新评价?应用范围：药物临床前研究及各期临床试验研究 疗效好疗效好 疗效不好或无疗效 毒副反应毒副反应 药物反应的个体差异药物反应的个体差异 相同药物治疗的一组人群 药物不良反应 开展药物基因组学研究的价值 基因检测 患者 药物 选对药，选对人，用对量 FDA,Clinical Pharmacogenomics:Premarketing Evaluation in Early Phase Clinical Studies (2011.2)治疗药物监测发展趋势治疗药物监测
4、发展趋势 HPLC-MS、红外光谱质谱、毛细管电泳 体内药物代谢产物分离分析 20世纪 50-60年代 20世纪 70-80年代 20世纪 90年代 21世纪 薄层分析、气相色谱（GC）临床毒物分析、体液分析 HPLC、GC-MS及免疫学测定如放射免疫等分析 血药浓度的监测广泛应用于临床，TDM深入发展 药物基因组学、代谢组学 多学科联合的基因分析 服务 项目 2009年 2010年 2011年 增 长 率 服务人次 百分率 服务人次 百分率 服务人次 百分率 基因检测 1467 0.11 1566 0.11 4040 0.25 175.39 175.39 外源性检测 1657 0.09 18
5、81 0.1 4465 0.23 169.46 内源性检测 896 0.02 622 0.01 1169 0.03 30.47 上海市公立医院基因检测平均服务人次（2009-2011年）范祝萍，白洁，周萍等.上海市医疗机构基因临床研究与应用现状分析.中国医院管理，2013,33（1）：23-25 内容提要内容提要?药物基因组学发展历程?临床基因检测的关注点?基因检测的临床应用价值?我们开展的一些工作 美国FDA确认的与相关基因有关需进行TDM的药物分类 FDAFDA近几年批准的基因检测数量 0123456782005年2006年2007年2008年2009年批准年份批准基因型监测产品数量FDA
6、面向制药企业发布两个文件（2012年初）药物基因组学数据提交指南（PDS）临床药物基因组学：早期临床研究的上市前评价草案 酶 药 物 CYP1A9 氟西汀,酰胺咪嗪,地尔硫卓,异烟肼,丙咪嗪,异烟肼,萘普生,去甲替林,苯妥英,利福平,茶碱,异搏定,红霉素 CYP2C9 氟西汀,布洛芬,丙咪嗪,异烟肼,萘普生,苯妥英,吡罗昔康,利福平,异搏定,华法林 CYP2C18 氟西汀,丙咪嗪,吡罗昔康,利福平 CYP2C19 氟西汀,丙咪嗪,异烟肼,去甲替林,苯妥英,利福平,华法林 CYP2D6 氟西汀,地尔硫卓,丙咪嗪,美托洛尔,去甲替林,茶碱 CYP2E1 氟西汀,异烟肼,茶碱,异搏定 CYP450酶
7、系酶系 器官 载体 肠道 MDR1*,BCRP*,MRP*,OCT2#肝 MDR1*,BCRP*,MRP2*,BSEP*,LST#,OCT#肾 MDR1*,BRCP*,MRP*,OCT#脑 MDR1*,BCRP*,OCT2#,OCT3#,OATP-A#*Mediates efflux from cell.#Mediates uptake into cell.相关转运体相关转运体?硫嘌呤甲基转移酶（TMPT）：巯嘌呤类药物?葡萄糖醛酸转移酶1A1：伊立替康?HER2/NEU：曲多单抗?表皮生长因子（EGFR）：吉非替尼?乙醛脱氢酶（ALDH2）：硝酸甘油等 其他基因其他基因/蛋白类型蛋白类型?小
8、分子生物标志物?生物标志物一般是指可供客观测定和评价的、生理病理或治疗过程中的某些特征性的生化指标，通过对它的测定就可获悉机体在某个时间或某种特殊影响下的生理病理状态?FDA在“药物基因组学数据呈报指南”草案中推出了生物标志物的分类方法。草案指出“有效的生物标志物”是一种得到人们广泛认可的、具有生理学、毒理学、药理学或者临床意义的指标?临床用药和诊断提供参考依据的小分子标志物?卡尼汀判断左卡尼汀是否用药的依据?褪黑素睡眠障碍药物治疗的参考?异前列腺素氧化应激药物治疗预后指标?大麻素神经细胞调节因子应用监测指标?过敏原（PRF）判断药物过敏的细胞因子之一?TDM领域中的相关基因产品?CYP2C1
9、9基因检测与波立维合理用药?波立维主要代谢酶为CYP2C19，形成活性代谢物发挥作用。?CYP2C19弱代谢患者使用常规剂量波立维，抑制血小板功能弱，接受PCI手术时，心血管事件发生率较高。?CYP2C19基因可检测国食药械（准）2009第3400723号，检测结果作为医生 调整用药策略的依据。?通过CYP2C19 基因代谢的药物 质子泵 抑制剂 抗抑郁药 抗癫痫类 其他 奥美拉唑 氟西汀 丙咪嗪 安定 环磷酰胺 兰索拉唑 西酞普兰 吗氯贝胺 苯妥英 黄体酮 泮托拉唑 S西酞普兰 阿米替林 曲米帕明 依替唑仑 苯巴比妥 丙戊酸 利福平 氯吡格雷 氯米帕明 氯巴占 那非那韦 氯胍 伏立康唑?CY
10、P2C19基因检测结果分析?氯吡格雷 慢代谢疗效差 剂量增加/更换其他药?丙戊酸 慢代谢者适用 较小-正常?奥美拉唑 快代谢疗效差 剂量增加/更换其他药?伏立康唑 快代谢疗效差 剂量增加/更换其他药?乙醛脱氢酶（ALDH2）基因试剂盒（2010年6月获SFDA批文）?硝酸甘油 突变型不适用 更换其他药?饮 酒 突变型伤害大 限制饮酒?高血压个体化用药基因试剂盒 内容提要内容提要?药物基因组学发展历程?临床基因检测的关注点?基因检测的临床应用价值?我们开展的一些工作?肿瘤化疗实施中的困惑肿瘤化疗实施中的困惑?同一癌症，同一分期，同一病理类型，使用相同的化疗方案，疗效与生存期可能截然不同；?不同类
11、型癌症患者，相同的化疗方案，疗效与生存期相似；?化疗耐受与化疗耐药现象；?原因？基因检测技术的临床应用价值基因检测技术的临床应用价值?影响消化道肿瘤患者化疗疗效、预后及毒性反应相关蛋白、影响消化道肿瘤患者化疗疗效、预后及毒性反应相关蛋白、基因基因?胸苷酸合成酶；?二氢嘧啶脱氢酶；?切除修复交叉互补基因；?多药耐药相关蛋白-1；?葡萄糖醛酸转移酶；?着色性干皮病复合物D；?X线交叉互补基因1?胸苷酸合成酶（thymidylate synthase TS）?生物学性质及功能?TS基因位于 18号染色体 p11.32，含7个外显子，6个内含子，长度为 16kb，在5非翻译区的增强子区域内含有单一重复
12、的28bp序列。?编码的TS是DNA合成途径中的一种限速酶?5-FU作用机制及肿瘤耐药?机制?3R等位基因可以导致肿瘤组织 TS表达增加（原因在于增加了 mRNA 的翻译效率和TS mRNA 水平），TS的高表达需要足够多的 5-FU来抑制TS的活性，从而产生耐药，同时，3R-等位基因对 5-FU 不敏感，反而增加 3-4级的毒性和腹泻的副作用，5-FU 尿苷激酶 FdUMP DNA(-)TS?临床应用?65例胃癌患者，化疗方案：顺铂+甲酰四氢叶酸+5-FU 0102030405060不可评价疗效组可评价疗效组疗效评价组别例数（个）?启示?TS蛋白和基因的表达水平与5-FU为基础的胃癌患者化疗
13、疗效呈现负相关?对胃癌患者开展TS检测可以提高患者的疗效?二氢嘧啶脱氢酶（二氢嘧啶脱氢酶（dihydropyrimidine dehydrogenase DPD）?生物学性质及功能?由相同亚单位构成的二聚体，每亚单位分子质量为111 103，含有FMN，FAD，-NH2，-COO(4Fe24S)2?双氢嘧啶脱氢酶（DPD）是嘧啶类药物如5-FU分解代谢的起始酶和限速酶?5-FU分解代谢及肿瘤耐药?机制 5-FU 5-FUH2 NADPH 5-FUPA 5-FBAL -丙氨酸合成酶 体 外 DPD?耐药机制耐药机制 药代动力学研究表明，DPD活性的高低与肿瘤耐药有明显的关系?DPD低活性：5-F
14、U体内清除下降，T1/2显著延长，合成增加，毒性加强；?DPD高活性：5-FU分解增加，合成减少，耐药?临床应用特点?DPD活性与患者人种、性别、年龄、肿瘤部位、分期、分化、病理类型无关?研究表明，临床监测5-FUH2浓度为1.14-37.88mol/L时，5-FU临床疗效最佳；?胃癌组织中DPD活性可以预测肿瘤组织对5-FU的敏感性，DPD越低对5-FU越敏感?外周血单核细胞DPD活性具有时间节律性，1点活性最高，13点活性最低，临床上可以根据这一规律来调整用药。?切除修复交叉互补基因（切除修复交叉互补基因（excision repair cross-complementing-1 ERCC
15、1）?生物学性质及功能：?ERCC1位于19q13.3-q13.2，基因长度约为14kb，包括10个外显子。?H-Ras 基因所引起的Ap1主导的c-Jun 和c-Fos 强大的相互作用对ERCC1反应很重要，在以H-Ras 介导的细胞对铂类药物耐药具有重要意义；?减少ERCC1的表达可以增加肿瘤细胞对铂类化疗药物的敏感性。?临床应用?用顺铂为基础的胃癌患者进行辅助化疗，结果如下?启示?在化疗方案中，合用ERCC1合成抑制剂可以大大提高以铂类为基础的化疗药物在消化道肿瘤化疗中的疗效。Metzgle R,Leichman CG,Danenberg,et al,.J Clin Oncol,1998
16、,16(1)309-317?多药耐药相关蛋白-1（multidrug resistance-assiciated proteins-1 MRP-1）?生物学性质及功能?属于ABC转运蛋白超家族，定位于16号染色体p13.1带上，6500bp组成，编码1531个氨基酸的跨膜糖蛋白，分子质量为190000，主要包括MRP-1、MRP-2 和MRP-3?主要功能为肿瘤组织对抗肿瘤药物耐药，是判断恶性肿瘤敏感性的极其重要的指标，与恶性肿瘤化疗生物学行为及预后密切相关。?耐药机制?与谷胱甘肽 S结合载体（GS-X泵）活性提高有关?MRP 转运的步骤?谷胱甘肽（GSH）的合成?GSH与药物偶联?MRP 将
17、药物泵出细胞外?MRP 可以介导?药物中的谷胱甘肽共轭物?葡萄糖醛酸甙共轭物?硫酸盐共轭物?解决途径?7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38）等可以逆转MRP介导的多药耐药（MDR）?反义RNA技术，可以大大减少对化疗药的耐药?启示?在消化道肿瘤化疗前，检测 MRP 的表达，对于指导临床化疗药选择、评估疗效及预后具有重要的意义。?葡萄糖醛酸转移酶（UDP-glucuronosyltransferase,UGTs）?伊立替康体内代谢与转化?UGT1A1分子生物学特征?具有25种基因多态性，其中28等位基因启动子区域含6个TA重复区域 （-53(TA)67，UGT1A1*28）最为普通。?TA重复
18、区域的高表达与严重的中性粒细胞减少所致发热、腹泻有密切关系（增加7倍）?启示?对于消化道肿瘤患者进行UGT1A1*28等位基因的测定，对于选择正确选择药物，减少伊立替康所带来的不良反应具有极其重要的意义。?着色性干皮病复合物D（Xeroderma pigmentosum complementation group D,XPD）?在基于奥沙利铂治疗的胃癌患者中，同义XPDArg156Arg（CA）基因多态性与C/A或A/A长时间和高表达密切相关，对于转移性结直肠癌患者，基因高表达可以增加肿瘤组织对药物的敏感性，延长患者的中位生存率。?XPD Lys751Gln（AC）基因多态性在给予各种铂类制剂
19、化疗的结直肠癌患者中与生存率无显著差异。?启示：对肠道肿瘤患者进行XPD基因多态性的相关检测，对于选择合适的铂类化疗药，评价疗效，化疗预后均有重要的意义。?X线交叉互补基因线交叉互补基因1(X-ray repair cross complementing group 1,XRCC1)?分子生物学特征及功能?位于人19号染色体长臂区（19q13.2），编码的蛋白通过与多聚 ADP核糖聚合酶（PARP）、APE1、多聚核苷酸激酶/磷酸酶、DNA连接酶3及DNA多聚酶的相互作用参与 DNA碱基修复及 DNA单链断裂重组修复，该基因常见的单核苷酸多态性有 3种：C26304T、G27466A、G281
20、52A，这些突变位点的存在会影响编码蛋白的功能活性，使机体对肿瘤的易感性发生变化。?基因多态性与结直肠癌发病相关性?埃及人群：26304T、28152A等位基因 编译，会增加早发性结直肠癌的罹患风险；?韩国人群：28152A等位基因变异与结直肠癌增高显著相关（OR：1.61）；?台湾人群：28152AA等位基因变异与结直肠癌增高显著相关（OR：1.59）；?中国人群：对26304T、27466A、28152A 等位基因 SNP 分析发现与患结直肠癌风险无显著相关性；?基因多态性与胃癌发病的相关性?已经发现 3种aa突变，分别位于密码子 194（Arg-Trp）、280（Arg-His）和399
21、（Arg-Gln）?携带Gln等位基因的个体较 Arg/Arg 基因型个体胃癌危险性有所上升（OR值1.35）；?Arg/Arg 基因型与 Arg/Trp 基因型及 Trp/Trp 基因型相比，胃贲门癌发生危险性显著增加（OR值1.86）?多基因联合检测与药物基因组学研究展望?由于5-FU、奥沙利铂等是消化道肿瘤的常选药物，德国Stoehlmacher J 教授与美国Park D J 教授对5-FU及L-奥沙利铂相关基因联合检测，提示多基因共同作用影响患者疗效及化疗预后。?XPD-156、GSTT1、GSTM1、XRCC1-399、XPA-5、TS-5UTR 与MST 及疾病进展时间无关；?X
22、PD-751、ERCC1-118、GSTP1-105、TS-3UTR 与生存时间、接受 L-OHP/5-FU化疗方案的临床获益密切相关；?XPD-751Lys/Lys、ERCC1-118C/C1、GSTP1-105Val/Val，TS-3UTP+6BP/+6BP基因型为大肠癌患者有利基因：拥有的基因型数量 中位生存时间（月）2个及以上 17.4 1个 10.2 0 5.4 靶向治疗药物靶向治疗药物 Herceptin 赫塞丁 (breast cancer,target:Her2/neu)Erbitux 爱必妥 (colorectal cancer,target:EGFR)Tarceva 特罗凯
23、 (lung cancer,target:EGFR)Strattera 托莫西汀 (attention-deficit/hyperactivity disorder,Metabolism:P4502D6)6-MP 6-巯基嘌呤 (leukemia,Metabolism:TPMT)Antivirals (i.e.resistance of HIV)Tamoxifen and CYP450 2D6 Testing prior to treatment?N-desmethyl-tamoxifen(NDM)Tamoxifen CYP3A4/5?4-hydroxy-N-desmethyl-tamoxif
24、en(endoxifen)CYP2D6?乳腺癌，乳腺癌，HER2与赫赛汀（与赫赛汀（Herceptin）?新英格兰医学杂志发表的研究论文显示，HER2呈阳性的早期乳腺癌患者使用赫赛汀治疗，乳腺癌复发的风险降低了46，死亡率降低了1/3。?赫赛汀由罗氏制药公司研制，它在1998年被批准用于治疗HER2阳性的晚期乳腺癌转移的患者。KRAS基因突变：与大肠癌等肿瘤患者酪氨酸激酶抑制剂等靶向药物的原发性耐药有关。KRAS基因野生型的患者能从爱必妥(Erbitux,又称西妥昔单抗/Cetuximab)或维克替比(Vectibix,又称帕尼单抗/Panitumumab)治疗中获益，而KRAS基因突变的大肠
25、癌患者治疗效果较差。欧洲药监局和美国FDA明确规定了在使用靶向药物爱必妥和维克替比治疗转移性大肠癌前必须检测KRAS基因。KRAS基因突变，大肠癌与爱必妥(Erbitux）治疗 EGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶区18-21外显子上，共29种突变，这些突变与易瑞沙（Iressa，又称吉非替尼/Gefitinib）和特罗凯（Tarceva，又称厄罗替尼/Erlotinib）的药物反应性有关联，因此检测EGFR基因突变对于指导非小细胞肺癌（NSCLC）临床患者用药具有重要参考价值。2009年9月新英格兰医学杂志发表的研究结果表明，在使用特罗凯和易瑞沙之前应该对EGFR基因进行检测 非小细胞肺癌（
26、NSCLC）、EGFR基因突变、与易瑞沙（Iressa）治疗 把握华法林临床用药剂量的重要性把握华法林临床用药剂量的重要性 European Atrial Fibrillation Trial Study Group,N Engl J Med 1995;333:5-10.决定华法林临床使用剂量的两个关键酶决定华法林临床使用剂量的两个关键酶 CYP2C9&VKORC1 以基因型为依据的华法林估计临床使用量以基因型为依据的华法林估计临床使用量 (mg/day)VKORC1 等位基因在不同人群的频率等位基因在不同人群的频率 Sconce et al.Blood 2005,Yuan et al.Hum
27、an Mol Genetics 2005,Schelleman et al.Clin Pharmacol Ther 2007,Montes et al Br J Haemat 2006 MTHFR C677T MTHFR C677T 基因型与同型半胱氨酸水平基因型与同型半胱氨酸水平 15.123.112.811.7051015202530CCCTTTTotalMTHFR C677T 基因型tHcy micromol/LP=0.000 P=0.000 Acta Universitatis Medicinalis Anhui 2006;41:639-642 高血压患者TT基因型Hcy水平约比CC/
28、CT基因型高一倍 MTHFR 677 C/T Biomarker 1)Prognostic 2)Predictive Lancet 2005;365:22432 荟萃分析：MTHFR 677 C/T TT 基因型与脑卒中显著相关 欧美：OR=1.26;95%CI:1.14-1.40；中国：OR=1.50;95%CI:1.23-1.84 Cerebrovasc Dis 2008;26:48 62 内容提要内容提要?药物基因组学发展历程?临床基因检测的关注点?基因检测的临床应用价值?我们开展的一些工作?肿瘤患者的基因个体化给药肿瘤患者的基因个体化给药?我院于2010年7月成立肿瘤诊治中心 我院临床
29、肿瘤基因组学数据采集示意图。关注点 西妥昔单抗 K-ras基因 贝伐单抗 血管内皮生长因子 VEGF 5-FU 二氢嘧啶脱氢酶（DPD）嘧啶核苷合成酶（TS）亚甲基四氢叶酸还原酶（MTH-FR）伊立替康 葡萄糖醛酸转移酶 奥沙利铂 核苷切除修复基因（XPD）我院开展的基因检测数量及种类汇总我院开展的基因检测数量及种类汇总 K-ras BRAF UGT1A1*28 HER-2 CYP2C19 ALDH2(Glu504Lys)IL-10 HBV VEGF DPD XPD?Population Pharmacokinetic Studyof Cyclosporine Based on NONMEM
30、in Chinese Liver Transplant Recipients CL/F=23.1+0.5(DT/200)-0.07HCT+0.04PR DT:CsA持续治疗时间；HCT:红细胞积压；PR:合用强的松剂量 Bo Sun,Xiaoyu Li,Gaolin Liu*.Therapeutics Drug Morning,2010,32:715-722 Impact of interleukin-10 gene polymorphisms on tacrolimus dosing requirements in Chinese liver transplant patients duri
31、ng the early posttransplantation period 结论：结论：1、FK506浓度与肝移植供体浓度与肝移植供体 CYP3A5、IL-10及受着及受着ABCB1基因多态性密切相关基因多态性密切相关 2、测定上述基因多态性可以指导 FK506个体化给药 Xiaoqing Zhang,Zhaozheng Wang,Gaolin Liu*.Europe Journal of Clinical Pharmacology.2011,67(8):803-813.Xiaoqing Zhang,Zhaowen Wang,Gaolin Liu*,et.al.Therapeutic Dr
32、ug Mornitoring.2012,34(2):126-133 初步建立了基于表达数量性状定位(Expression Quantitative Trait Loci,eQTL)和药物代谢酶转运蛋白遗传检测芯片（Drug Metabolizing Enzymes and Transporter,DMET）技术的他克莫司个体化给药技术研究平台?基因检测技术临床应用现状基因检测技术临床应用现状?药物基因组学的研究为新药的开发和研制提供了科学依据，但将该技术纳入药物临床试验的进程较为缓慢依据，但将该技术纳入药物临床试验的进程较为缓慢?方法学的成熟性有待进一步提高?卫生部门、医疗机构、医生和患者还未广泛接受该技术?检测费用较为昂贵，患者支付能力、医保因素等均影响该技术的推广?医药公司担心普遍开展该技术会影响相关药品的市场份额医药公司担心普遍开展该技术会影响相关药品的市场份额 谢谢各位聆听！谢谢各位聆听！
