1、会计学1PCR技术教程技术教程一、一、PCR技术技术二、定量二、定量PCR技术技术三、数字三、数字PCR技术技术第1页/共71页一、一、PCR原理原理Polymerase Chain Reaction(PCR)：在体外特异性地扩增某个基因。：在体外特异性地扩增某个基因。1、历史、历史1971年，Khorana提出体外人工复制DNA的设想。1985年Cetus公司科学家使设想变成现实，采用大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37），并获1993年诺贝尔化学奖。1988年R.K.Saiki 应用Taq DNA聚合酶（水生栖热菌）于PCR反应；同年，Cetus公司发明自动热循环仪。第2页/共71页
2、2、原理、原理预变性变性退火延伸变性退火延伸保存循环（循环（30次）次）95预变性1 min95变性 1 min目的：DNA双链成单链56退火目的：引物先与模板匹配72延伸1-2 min 目的：聚合酶在引物3端加核苷酸，合成新链12保存循环循环特异性强、灵敏度高、快速、简便特异性强、灵敏度高、快速、简便第3页/共71页循环次数循环次数DNA数量数量122438201048576301073741824第4页/共71页1、Taq酶酶：具有53聚合酶和外切酶活性，无35外切酶活性，不能修复错误的碱基配对，因此必须测序。需激活剂：Mg2+2、pfu DNA 聚合酶聚合酶：有53和35外切酶活性，出错
3、率最低，但PCR产物平端。3、Taq Plus DNA 聚合酶聚合酶：是Taq和pfu的混合物，Taq PCR产物3端带A。4、引物引物：互补；引物长度；3碱基序列必须与模板配对；尽量提高GC含量；避免连续相同碱基排列或开成回纹结构；避免形成引物二聚体。5、Tm=(G+C)4+(A+C)26、primer 5.07、模板纯度模板纯度：不一定要纯，但要确定不含蛋白变性剂、DNA酶、Mg2+螯合剂等。模板量（100ng/100l）8、dNTP浓度浓度2.5 mM each特殊说明：特殊说明：第5页/共71页普通PCRRT-PCRTAIL-PCR Real-time PCR数字PCRPCR类型：类型
4、：第6页/共71页普通PCR仪梯度PCR仪原位PCR仪定量PCR仪数字PCR仪第7页/共71页二、实时荧光定量二、实时荧光定量PCR（Real-time quantification PCR）1、历史、历史实时荧光定量实时荧光定量PCR技术于技术于1996年由美国年由美国Applied Biosystems公司推出，该技术不仅实现了公司推出，该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它的特异性更强、更能有效解决相比，它的特异性更强、更能有效解决PCR污染问题、自动化程度更高等特点。污染问题、自动化程度更高等特点。第8页/共71页第9页/共71
5、页原理原理：在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料（如SYBR GREEN 1）或特异性的荧光探针（如Taqman探针），利用荧光信号累积实时检测整个PCR过程，再通过标准曲线或内参基因对未知基因进行定量分析 的方法。也就是通过荧光的变化，获得不同样品达到一定荧光信号（阈值）所需要的循环次数Ct（Cycle Threshold）。Ct值的含义：值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。第10页/共71页1、荧光探针和荧光染料：、荧光探针和荧光染料：分别用探针或荧光染料与特异序列结合来指示扩增产物，前者特异性高，后者操作简单。SYBR GREEN 1：结合双链DNA小沟后
6、，荧光强度增强，但也会结合引物二聚体或单链引起的二级结构。变性时，双链分开，荧光消失。特别说明：特别说明：TaqMan探针探针：寡核苷酸探针，荧光基团连接在5端，淬灭基因连在3端。5端荧光基团吸收能量后转移给临近的3端淬灭基团，发生共振能量转移（FRET），只要探针完整，能量就会被淬灭。第11页/共71页荧光定量荧光定量PCR的优点的优点1.荧光信号的强弱可实时反映DNA的扩增；2.灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量；3.既能用于定性，判断一段DNA序列的有无，也可用于定量，确定起始DNA拷贝数。第12页/共71页一对引物一对引物引物之间一条寡核苷酸，即探针引物之间一条寡核苷酸，即探针报告基
7、因与淬灭基团报告基因与淬灭基团完整探针，不发光；水解后，发光。完整探针，不发光；水解后，发光。FRET第13页/共71页变性（变性（95）退火（退火（60）第14页/共71页DNA聚合酶第15页/共71页53外切酶活性；可将探针5端的荧光基团切割下来。第16页/共71页荧光基团游离下荧光基团游离下来后发光了！来后发光了！第17页/共71页第18页/共71页因为探针是完全与目的基因互补，当它被水解因为探针是完全与目的基因互补，当它被水解后就发光，因此后就发光，因此发光的强度与目标基因量成正发光的强度与目标基因量成正比比。第19页/共71页只与双链结合，发光；不与单链结合，不发光。只与双链结合，发
8、光；不与单链结合，不发光。第20页/共71页第21页/共71页随温度升高，DNA双螺旋结构降解程度的曲线即熔解曲线，熔解曲线，可用对数图和线性图表示。在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解。染料法做，探针法不做第22页/共71页不适合染料法第23页/共71页第24页/共71页卤素灯（白光）卤素灯（白光）第25页/共71页定量定量线性图与对数图正好相反，基线期在对数图中增高。第26页/共71页第27页/共71页基线基线荧光阈值荧光阈值Ct值值DNA0基线基线：扩增线中的水平部分，由环境
9、的噪音产生。实验结束软件自动分析数据，基线取默认值3-15（循环数）。如果最小的Ct值18，保持默认；如果最小的Ct值18，基线终点改成最小的Ct值减3，重新分析。第28页/共71页荧光阈值荧光阈值：在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上。默认阈值默认阈值基线（背景）荧光信号的标准偏差的10倍。第29页/共71页Ct值的含义：值的含义：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。DNA0：样本起始DNA浓度。第30页/共71页第31页/共71页理论上PCR是一个指数增长的过程，但实际的PCR扩增曲线并标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着P
10、CR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR因素逐渐不满足要求，PCR效率越来越低，产物增长的速度逐渐减缓。第32页/共71页第33页/共71页第34页/共71页绝对绝对第35页/共71页第36页/共71页处理与对照处理与对照第37页/共71页第38页/共71页定量定量PCR仪特点仪特点，污染机会少，污染机会少第39页/共71页定量定量PCR的实验因素的实验因素DNA纯度：OD260/OD280=1.8,1.6-2.0之间DNA用量：0.05-100ngRNA纯度：OD260/OD280=2.0cDNA用量：1-100ng总RNA反转录的cDNA取1l
11、样品和标准品都需要重复，重复次数遵循统计学要求。第40页/共71页定量定量PCR实验要素：实验要素：目标基因：未知样品生成标准：曲线标准品梯度监控系统：阳性对照监控污染：阴性对照校准生物学误差：管家基因校准物理误差：参比荧光（ROX）降低其它误差：重复实验第41页/共71页ABI750096孔板，样品量大，仪器稳定，结果分析直观。ABI试剂ROX校正物理方面的误差：枪的误差（如试剂体积）耗材质量（如管盖厚度、透光性）仪器稳定性（如孔间、批间温度波动）第42页/共71页第43页/共71页Real-time PCR 方法的应用方法的应用绝对定量（Absolute Quantification）：拷
12、贝数；标准是已知拷 贝数的质粒DNA。相对定量（Relative Quantification）：相对变化量；内标定量。前提前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100%且 偏差在5%以内。第44页/共71页第45页/共71页第46页/共71页蛋白互作蛋白互作第47页/共71页第48页/共71页第49页/共71页第50页/共71页第51页/共71页第52页/共71页三、三、第53页/共71页第54页/共71页第55页/共71页第56页/共71页第57页/共71页第58页/共71页第59页/共71页第60页/共71页操作流程第61页/共71页第62页/共71页第63页/共71页第64页/共71页第65页/共71页第66页/共71页第67页/共71页第68页/共71页第69页/共71页我们班上的刘磊同学所拍我们班上的刘磊同学所拍第70页/共71页
