1、实验一 普通光学显微镜的使用与维护ALEX11/10/2022前前 言言 显微镜是一种高精密的仪器显微镜是一种高精密的仪器,目前已广目前已广泛应用于生命科学、材料科学、医学等学科泛应用于生命科学、材料科学、医学等学科领域。领域。第一代为第一代为光学显微镜，光学显微镜，第二代为电子显第二代为电子显微镜，第三代为扫描隧道显微镜。微镜，第三代为扫描隧道显微镜。11/10/2022光光学学显显微微镜镜电电子子显显微微镜镜扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜11/10/2022一、实验目的一、实验目的 1.1.掌握显微镜的正确使用掌握显微镜的正确使用 2.2.熟悉显微镜的工作原理、基本结构、性能参数熟悉显微镜的
2、工作原理、基本结构、性能参数 3.3.了解显微镜的拆装技术和主要性能参数的设定了解显微镜的拆装技术和主要性能参数的设定11/10/2022二、显微镜二、显微镜 1.1.光学显微镜的成像原理光学显微镜的成像原理 要要获得清获得清晰的像，晰的像，被观察被观察标本标本ABAB应位于应位于物镜前物镜前焦点外焦点外至两倍至两倍焦距之焦距之间。间。标本标本ABAB经两级放大，在眼的明视范围内看到放大的经两级放大，在眼的明视范围内看到放大的ABAB像。像。11/10/20222 2、普通光学显微镜的结构、普通光学显微镜的结构 普通显微镜在结构上分：普通显微镜在结构上分：光学系统，机械系统。光学系统，机械系统
3、。光学系统包括光学系统包括物镜、目镜、物镜、目镜、聚光镜、反光镜聚光镜、反光镜等。等。机械系统包括底座、镜臂机械系统包括底座、镜臂粗调手轮、微调手轮、载粗调手轮、微调手轮、载物台、物台、转换器转换器等。等。11/10/2022 1.1.物镜物镜 显微镜光学系显微镜光学系统最核心的部统最核心的部件件，其性能直，其性能直接关系到显微接关系到显微镜的性能和成镜的性能和成像质量像质量。显微镜的光学系统显微镜的光学系统11/10/2022 2.2.目镜目镜 也称接目镜，也称接目镜，实质上是放大实质上是放大镜，其作用是镜，其作用是把物镜分辨和把物镜分辨和放大的实像再放大的实像再放大并映入观放大并映入观察者
4、眼中。察者眼中。显微镜的光学系统显微镜的光学系统11/10/2022聚光镜聚光镜光源光源(灯在底座内灯在底座内)3.3.光源光源 4.4.聚光镜聚光镜 显微镜的光学系统显微镜的光学系统11/10/2022聚光镜聚光镜孔径光阑孔径光阑11/10/2022物镜转换器载物台调节手轮单目镜镜筒物镜转换器显微镜的机械系统显微镜的机械系统11/10/2022聚光器升降螺旋玻片夹调焦螺旋调焦螺旋锁显微镜的机械系统显微镜的机械系统11/10/20223 3、普通光学显微镜的正确使用、普通光学显微镜的正确使用（1 1）.显微镜取镜放置：显微镜取镜放置：移取时右手握住镜臂，左手托住镜座，移取时右手握住镜臂，左手托
5、住镜座，保持显微镜平直保持显微镜平直 显微镜放置在稳定的台面上，离台边显微镜放置在稳定的台面上，离台边一定距离（一定距离（6cm6cm以上）以上）正确连接接地良好的电源。正确连接接地良好的电源。11/10/2022将 主 开 关 打将 主 开 关 打开，调 节 亮开，调 节 亮度度将样品置于将样品置于载物台，移载物台，移入光路入光路以转换器使以转换器使低倍物镜入低倍物镜入光路光路转动调焦旋转动调焦旋钮，对样本钮，对样本聚焦聚焦调 节 目 镜调 节 目 镜瞳 间 距 和瞳 间 距 和屈光度屈光度调节孔径光调节孔径光阑和视场光阑和视场光阑阑将观察物镜将观察物镜转入光路，转入光路，再聚焦再聚焦再次调
6、节亮再次调节亮度，开始观度，开始观察察（2）.普通光学显微镜的基本观察步骤普通光学显微镜的基本观察步骤3 3、普通光学显微镜的正确使用、普通光学显微镜的正确使用11/10/20223 3、普通光学显微镜的正确使用、普通光学显微镜的正确使用（3 3）.清洁收镜：清洁收镜：观察完毕，移去标本，扭转转换器，使两观察完毕，移去标本，扭转转换器，使两低倍物镜镜头呈低倍物镜镜头呈V V字形于载物台上方字形于载物台上方 用擦镜纸擦净油镜镜头，绸布擦拭镜身用擦镜纸擦净油镜镜头，绸布擦拭镜身 是有张力的部件处于松弛状态（聚光镜、是有张力的部件处于松弛状态（聚光镜、载物台）载物台）调节光亮度旋钮将光亮度调至最暗，
7、关闭调节光亮度旋钮将光亮度调至最暗，关闭电源。电源。11/10/2022（1 1）.数值孔径数值孔径 4 4、显微镜的性能参数、显微镜的性能参数又称镜口率，是物体与物镜间又称镜口率，是物体与物镜间媒质的折射率媒质的折射率 n n 与物镜孔径角与物镜孔径角的一半（的一半（）正弦值的乘积，）正弦值的乘积，用用NANA表示。即：表示。即：NANAn nsin sin 数值孔径与分辨率成正比，与放大率成正比，数值孔径与分辨率成正比，与放大率成正比，NANA增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。11/10/2022（2 2）.放大倍数放大倍数 又称为放大率，指显
8、微镜经多次成像后最终所观察到又称为放大率，指显微镜经多次成像后最终所观察到的物像大小相对于原物体大小的比值，常记作的物像大小相对于原物体大小的比值，常记作M M。即：。即：M Mmaqmaq m m是物镜的放大倍数是物镜的放大倍数 a a为目镜的放大倍率为目镜的放大倍率 q q是在双目显微镜中所增设的棱镜产生的放大倍数是在双目显微镜中所增设的棱镜产生的放大倍数（双目显微镜取值为（双目显微镜取值为1.61.6倍，单目显微镜倍，单目显微镜q q值为值为1 1）。11/10/2022 物镜一般刻有放大倍数物镜一般刻有放大倍数NANA（数值（数值孔径）如：孔径）如：4 40.1 0.1 （1 1组镜片
9、）组镜片）10 100.25 0.25（2 2组镜片）组镜片）40 400.65 0.65（3 3组镜片）组镜片）100 1001.251.25（4 4组镜片）组镜片）160/0.17 160/0.17（机械镜筒长（机械镜筒长/盖玻盖玻 片的厚度）片的厚度）11/10/2022（3 3）.工作距离工作距离 指显微镜正常观察物像时物镜表面到被观察标本间的指显微镜正常观察物像时物镜表面到被观察标本间的距离距离 显微镜使用过程中习惯所说的显微镜使用过程中习惯所说的“调焦调焦”指的就是调整指的就是调整物镜的工作距离物镜的工作距离 它与物镜的数值孔径成反比，它与物镜的数值孔径成反比，一般情况下，物镜的数
10、一般情况下，物镜的数值孔径越大，其工作距离越小。值孔径越大，其工作距离越小。11/10/2022（4 4）.视野视野 视野又称视场，是指通过显微镜所能看到的标本范围。视野又称视场，是指通过显微镜所能看到的标本范围。视野成圆形视野成圆形 视野大小决定于物镜的倍数及目镜光阑的大小，小的视野大小决定于物镜的倍数及目镜光阑的大小，小的放大倍数和大光阑可获得较大的视野，反之则视野较放大倍数和大光阑可获得较大的视野，反之则视野较小小 因为视野的局限，一般均要通过机械装置移动、分区因为视野的局限，一般均要通过机械装置移动、分区观察标本。观察标本。11/10/2022（5 5）.景深景深 又称焦点深度，是指在
11、成一幅清晰物像的前提下，像又称焦点深度，是指在成一幅清晰物像的前提下，像平面不变，景物沿光轴前后移动的距离平面不变，景物沿光轴前后移动的距离 显微镜观察时，不仅位于聚焦平面上的点是清楚的，显微镜观察时，不仅位于聚焦平面上的点是清楚的，而且在景深范围内的各点也是清楚的而且在景深范围内的各点也是清楚的 景深与总放大倍数及物镜的分辨率成反比（垂直鉴别景深与总放大倍数及物镜的分辨率成反比（垂直鉴别能力）能力）11/10/2022三、实验器材三、实验器材 1.1.普通光学显微镜一台普通光学显微镜一台 2.2.红细胞悬液红细胞悬液 3.3.骨髓片骨髓片 4.4.微量吸管、一次性塑料吸管等微量吸管、一次性塑
12、料吸管等11/10/2022四、操作步骤四、操作步骤1 1、显微镜光学系统的拆卸和组装（仅示教）、显微镜光学系统的拆卸和组装（仅示教）拆卸：拆的次序是由下而上，即先拆光源、后拆聚光镜、拆卸：拆的次序是由下而上，即先拆光源、后拆聚光镜、物镜、目镜物镜、目镜 组装：装的次序是由上而下，即先目镜、后物镜、聚光镜、组装：装的次序是由上而下，即先目镜、后物镜、聚光镜、光源光源2 2、普通光学显微镜的调试、普通光学显微镜的调试3 3、显微镜光学性能参数的设定、显微镜光学性能参数的设定4 4、正确使用光学显微镜观察不染色标本和染色标、正确使用光学显微镜观察不染色标本和染色标本，并总结其不同之处本，并总结其不
13、同之处（不染色标本制备：用微量吸管（不染色标本制备：用微量吸管吸取吸取EDTAEDTA抗凝血抗凝血20ul20ul，加入到，加入到5ml5ml生理盐水中，混匀，用一生理盐水中，混匀，用一次性塑料吸管滴加次性塑料吸管滴加3-53-5滴与洁净玻片上）滴与洁净玻片上）11/10/2022五、注意事项五、注意事项 1.1.转换物镜时须旋转转换器，勿转物镜，否则易损转换物镜时须旋转转换器，勿转物镜，否则易损坏光轴。坏光轴。2.2.目镜不要轻易拿下，否则灰尘会落入物镜中。目镜不要轻易拿下，否则灰尘会落入物镜中。3.3.不用时，使载物台落下，呈放松状态。不用时，使载物台落下，呈放松状态。4.4.光源灯不用时
14、关到最小，保护灯泡。光源灯不用时关到最小，保护灯泡。11/10/2022六、维护与保养六、维护与保养 1.1.保证良好的使用环境保证良好的使用环境 台面稳固、环境良好。台面稳固、环境良好。2.2.保持正确的使用方法保持正确的使用方法 操作轻巧、舒缓，正确旋转各操作轻巧、舒缓，正确旋转各类螺旋，合理使用照明光源和油镜类螺旋，合理使用照明光源和油镜 。3.3.定期进行清洁维护定期进行清洁维护 正确清洁，定期维护。正确清洁，定期维护。4.4.擦镜：擦镜：1 1）擦镜液的配制：乙醇：乙醚）擦镜液的配制：乙醇：乙醚=7=7：3 3或或80%80%：20%20%2 2）先用洗耳球吹去浮尘。）先用洗耳球吹去
15、浮尘。3 3）用长絮棉签沾檫镜液由中心向外擦。）用长絮棉签沾檫镜液由中心向外擦。11/10/2022常见故障常见故障原原 因因排除方法排除方法视场模糊、视场模糊、视场亮度视场亮度不均、不不均、不能看到完能看到完整视场整视场1 1物镜转换器未能正确物镜转换器未能正确定位（物镜未与光路同轴）定位（物镜未与光路同轴）1 1旋转物镜转换器直旋转物镜转换器直至选用物镜完全对中至选用物镜完全对中2 2聚光器位置太低聚光器位置太低2 2调整（升高）聚光调整（升高）聚光器位置得到良好物像器位置得到良好物像3 3视场光阑未对中视场光阑未对中3 3调整视场光阑使其调整视场光阑使其良好对中良好对中4 4视场光阑开得
16、太小视场光阑开得太小4 4适当开大光阑适当开大光阑七、常见故障与处理七、常见故障与处理11/10/2022常见故障常见故障原原 因因排除方法排除方法视场内有视场内有污迹或灰污迹或灰尘尘1 1目镜、物镜、聚光目镜、物镜、聚光镜等其它光学部件上有镜等其它光学部件上有污迹和灰尘（旋动目镜污迹和灰尘（旋动目镜时污物转动说明目镜上时污物转动说明目镜上有污物，否则污物在物有污物，否则污物在物镜或聚光镜上）镜或聚光镜上）1 1正确擦拭显微镜的正确擦拭显微镜的光学部件。擦拭目镜和光学部件。擦拭目镜和物镜时必须使用合格的物镜时必须使用合格的拭镜纸、蘸取无水乙醇拭镜纸、蘸取无水乙醇擦拭。要避免二次污染擦拭。要避免
17、二次污染2 2标本片上有污迹和标本片上有污迹和灰尘灰尘2 2正确擦拭标本片正确擦拭标本片七、常见故障与处理七、常见故障与处理11/10/2022常见故障常见故障原原 因因排除方法排除方法观察效果观察效果差、看不差、看不清细节、清细节、视场不均视场不均匀（反差匀（反差过大）过大）1 1标本片正反面错放标本片正反面错放 1 1翻转，使盖玻片向上翻转，使盖玻片向上2 2盖玻片太厚盖玻片太厚2 2使用标准厚度使用标准厚度（0.17mm0.17mm厚）的盖玻片厚）的盖玻片3 3油镜观察时未浸油油镜观察时未浸油3 3使用合格浸油，油镜浸使用合格浸油，油镜浸入入4 4油镜浸油内有气泡油镜浸油内有气泡4 4除去气泡（加浸油时避除去气泡（加浸油时避免空气进入；有气泡可用免空气进入；有气泡可用牙签等挑破而除去）牙签等挑破而除去）5 5干型物镜上有浸油干型物镜上有浸油或其他污物或其他污物5 5用专用擦镜头液擦拭用专用擦镜头液擦拭6 6光阑未能调整好光阑未能调整好（过大或过小）（过大或过小）6 6适当调整光阑适当调整光阑七、常见故障与处理七、常见故障与处理
