1、HE染色试验技术及注意事项课件 HE染色又称苏木素-伊红染色法,是普通光学显微镜观察与鉴别细胞凋亡与细胞坏死的一种染色方法。课件报告内容lHE染色原理l试剂l染色步骤l注意事项l几种常见的染色问题课件HE染色原理苏木素苏木红蓝色色精分化和蓝化氧化+铝细胞核负电荷色酸(染料有色部分)伊红染色染色正负电荷的极性吸附正电荷色酸(染料无色部分)水解渗透作用或者弥散作用完成课件试剂l苏木素染液(细胞核着色)l盐酸乙醇分化液l稀氨水l伊红染液l二甲苯l梯度浓度乙醇课件染色步骤常常规规脱蜡脱蜡苏苏木素染色(木素染色(5-15min),水),水洗洗盐盐酸乙醇溶液分化(酸乙醇溶液分化(30s),),水洗水洗伊伊
2、红红染色(染色(1-3min),水),水洗洗氨水反氨水反蓝蓝(30s),),水洗水洗90%乙醇(乙醇(5min)80%乙醇(乙醇(30s)100%乙醇(乙醇(2次次10min)二甲苯(二甲苯(3次次5min)封片封片染色脱水透明封片脱蜡 染色的时间,应根据室温,及组织的具体情况来确定,染色的时间,应根据室温,及组织的具体情况来确定,做之前做预实验。做之前做预实验。课件课件注意事项l(1)脱蜡。切片脱蜡后才能染色,且脱蜡应彻底。脱蜡好坏主要取决于二甲苯的温度和时间,如果二甲苯是用过一段时间,切片又比较厚,室温低应增加脱蜡时间,脱蜡不净是影响染色不良的重要原因之一。l(2)染色。根据实际情况,通过
3、预实验得到最佳染色时间。一般情况下新配的苏木素染液中只需染13min 左右,应根据染片的多少,逐步把染色时间延长。分化时间不易过长,分化应在镜下观察,分化过度,应水洗后重新在苏木素染液中染色,在水洗分化和使切片在自来水或稀的氨水中充分变蓝(蓝化)。新配的伊红染色块,切片染色不易过长,应根据染切片的多少逐步延长染色时间,切片使伊红染后,分化时间要短。课件l(3)脱水。染色后通过各级酒精脱水,从低浓度到高浓度。低浓度酒精对伊红有分化作用,切片经过低浓度时要短,向高浓度逐渐延长脱水时间,脱水不彻底,使切片发雾,在显微镜下组织结构模糊不清。l(4)透明与封片。切片染色脱水后必须经二甲苯处理,使切片透明
4、,才能用树胶封片。应引起注意的是,二甲苯纯度不纯使切片透明不够,会影响切片质量。课件几种常见的染色问题l脱蜡脱蜡:切片中白色的区域脱蜡不彻底,染色液由于石蜡斑点的残留而不能渗透着色。原因:原因:烤(烘)片温度太低,脱蜡前没有充分烤(烘)干。二甲苯脱蜡时间不足,或二甲苯使用过久,造成脱蜡不尽。对策:对策:用无水乙醇去掉玻璃片上的水分,重新二甲苯脱去石蜡。切片需退回到脱蜡步骤,延长脱蜡时间,或跟换二甲苯,驼色、漂白、重新染色。课件l染色:染色:(1)苏木素染色)苏木素染色原因:原因:染色时间短;苏木素过度氧化,失去染色能力;分化时间过长。苏木素染色太浅,细胞核与细胞质颜色对比度差。对策:对策:切片
5、重新染色。课件 细胞核过染,核膜、核仁等不清晰,细胞质(尤其是皮肤上皮细胞)含有大量的细胞核染色液苏木精,导致细胞核与细胞质比例失调。原因:原因:与图2相反,染色液时间过长、切片太厚、分化步骤时间太短。对策:对策:如果切片不是因为太厚,脱色、漂白、重新染色,对于染色和分化时间做些适当的调整。若太厚则需要重新切片。课件 切片细胞核棕色,表明苏木精没有充分蓝化,或苏木精过度氧化失去染色能力原因:原因:苏木精染色液过度氧化和切片在苏木精染液染色后返蓝不足。对策:对策:染色前检查苏木精染色液的染色能力,过渡氧化,应及时更换。其次,在苏木精染色后,给切片以足够的蓝化时间。课件染色后有杂质原因:原因:苏木
6、精染色液中的金属膜,黏附在玻片上。对策:对策:每天染色前仔细过滤苏木精染色液,或建议使用半氧化苏木精染色液。课件(2)伊红着色 切片中央区域伊红染色不均匀,可能为弱碱性溶液残留导致伊红拒染所致原因:原因:伊红染液的pH 值可能大于5;也可能是蓝化液残留过多;切片太薄;或切片经伊红染色后在乙醇脱水时间过长。对策:对策:检查伊红染液的pH值,用乙酸将其调节在4.6-5.0 之间,使伊红染色色彩艳丽。确保每次蓝化后,用自来水冲干净。检查切片的厚度。脱水时不要让切片在低浓度乙醇停留时间过长,因为含水多的低浓度乙醇会将伊红的颜色分化掉。课件原因:原因:伊红染色液浓度太高;切片在伊红染色时间过长;切片在伊
7、红染色后经乙醇脱水步骤时过的太快,而使乙醇分化伊红的作用不能产生。对策:对策:适当稀释伊红染色液,减少伊红染色时间,或者使切片在乙醇脱水等步骤时,停留时间相对均匀。同样,也要检查切片的厚度是否合适。伊红深染导致细胞核与细胞质没有层次,缺乏对比课件 在显微镜下呈现大量水珠或云雾状改变原因:原因:切片经梯度乙醇处理后没有完全脱水,导致二甲苯透明中性树胶封固后残留大量水分。也可能是封片的时候出现的气泡。对策:对策:移去盖玻片,用二甲苯溶解封固剂如中性树胶。将切片置入新鲜的无水乙醇换几道。待切片重新脱水完全后,用新二甲苯透明,中性树胶封固。所有用于脱水和透明的液体,在使用一定时间以后,应即时更换。将切
8、片浸如二甲苯中,重新封片。l封片:封片:课件盖玻片上有封固剂所致切片组织模糊不清原因:原因:盖玻片上可能有封固切片的封固剂。对策:对策:移去盖玻片,重新用干净的盖玻片封片。课件 封片后镜下则会出现类似色素的点状结晶或类似“裸核”样的改变原因:原因:切片封片前放置在空气中时间太长,以至于二甲苯挥发切片干燥所致。对策:对策:移去组织切片上的盖玻片和封固剂,重新处理。将切片水洗数分钟,然后重新脱水、透明、封固。封片过程中要保持组织切片的轻度湿润,尽量不要让其干燥。课件原因:原因:盖玻片弯曲或不平整;封固剂含二甲苯过多,稀释过度。对策:移去盖玻片,重新找一张盖玻片,用干净的封固剂封片。如用手工封片法,每天保证盛装封固剂的容器,在封固结束的时候盖紧盖子。尽量使用小的容器盛装封固剂,一旦封固剂太粘稠,就可以废弃不再使用。课件l谢谢!课件