1、一、实验目的（一）掌握血标本的采集方法、检验程序（二）掌握鲍曼不动杆菌的分离培养与鉴定。（三）熟悉鲍曼不动杆菌的菌落特点、菌体形态及染色性。2020/11/142二、实验器材和试剂v器材：酒精灯、火柴、取菌环、载玻片、普通光学显微镜、血平板v试剂：3%过氧化氢、氧化酶试剂、革兰染色液、生理盐水、生化管v药敏纸片：哌拉西林/他唑巴坦PIP/TA、替卡西林+克拉维酸TIC/CA、头孢他啶CAZ、头孢吡肟FEP、头孢噻肟CTX、头孢曲松CRO、阿米卡星AN、妥布霉素TM、美罗培南MPN、环丙沙星CIP2020/11/143三、实验内容2020/11/144四、实验步骤v1、标本采集 菌血症患者病原菌
2、是周期周期性性出现在血液中，尽管临床症状可能很严重，但患者血液中病原菌浓度水平相当低病原菌浓度水平相当低，因此要求临床多次采血多次采血液标本进行肉汤增菌培养，但24小时内一般不超过3次。怀疑为菌血症的患者，原则上应在抗菌药物使抗菌药物使用前用前采取，对已开始抗菌药物治疗的患者可在下次给药前采取，标本大多由肘静脉肘静脉采取，多部位采集血液标本也可增加阳性率。2020/11/145v标本采集注意事项：采血部位的皮肤消毒采用三步消毒法三步消毒法：即先用70%酒精擦拭皮肤，再用碘酒消毒，然后用70%酒精脱碘。采集的血液标本应分别注入硫酸镁葡萄糖肉汤（需氧培养）和硫乙醇酸钠肉汤（厌氧培养）培养瓶中。硫酸
3、镁葡萄糖肉汤中和多种抗生素，硫乙醇酸钠肉汤含有硫乙醇酸钠、葡萄糖等还原剂吸收其中的氧，为厌氧菌提供较低的氧化还原电位。血液与培养基的比例应为1：51：10 儿童婴幼儿一般1-5ml 成人一般10ml 2020/11/146常见致病菌检验及报告方式v（1）将血液细菌培养瓶置35度孵育，每日观察一次，连续观察至第七天。注意观察血液细菌培养瓶的变化。v（2）如怀疑血液细菌培养瓶中有细菌生长，用无菌技术取瓶内液体进行涂片，革兰染色检查。如发现细菌，根据细菌的染色性及形态特征发出初步报告初步报告（电话通知主管医生）。v（3）根据涂片结果选择相应的抗菌药物，直接从血培养瓶抽取适量液体做初步药敏试验，并于1
4、824小时后报告初步药敏结果。2020/11/1472020/11/1482020/11/149血液标本中常见的细菌v革兰阳性球菌：金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、A群、B群链球菌、草绿色链球菌、肺炎链球菌、肠球菌、厌氧链球菌、v革兰阳性杆菌：产单核李斯特菌、炭疽芽胞杆菌、产气荚膜杆菌。v革兰阴性球菌：脑膜炎奈瑟菌、卡他布兰汉菌。v革兰阴性杆菌：大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、气单胞菌等。2020/11/1410（6）报告方式 v 在增菌过程中培养瓶中怀疑有细菌生长，经涂片、革兰染色证实，可报告“疑有XX细菌生长”；v经分离培养、生化试验及血清学鉴定后，可报告“血液细菌培养X天，有XX
5、细菌生长”，并同时报告体外抗菌药物敏感试验结果；v如果增菌培养至七天，培养瓶中仍无细菌生迹象，经盲目传代证实无细菌生长，可报告“血液细菌培养七天，无细菌生长”。2020/11/1411注意事项v1、一般应在抗菌药物使用前采集血液标本，如果患者已用过抗菌药物或情况不明时，应使用硫酸镁肉汤增菌液。v2、对疑为波浪热、亚急性细菌性心内膜炎的患者，培养瓶应孵育至第四周，盲目接种后无菌生长，方可报告阴性。2020/11/1412注意事项v3、为了尽快发现病原菌，在7天的孵育期内应至少盲目接种两次，第一次在标本孵育1218小时后。在以后的孵育期中应每天观察瓶内的变化，如有细菌生长现象，需及时接种和涂片染色
6、观察报告。7天孵育后仍无细菌生长迹象，进行盲目接种。每次接种羊血平板和巧克力琼脂平板羊血平板和巧克力琼脂平板，分别进行需氧和厌氧培养。革兰染色提示真菌生长，应移种至沙氏平板沙氏平板，L型菌须转种高高渗平板渗平板。2020/11/1413注意事项v4、血液细菌学培养是诊断菌血症和败血症的病原学依据，但血液标本在采集、接种、运送过程存在潜在污染的可能，尤其在静脉穿刺术中，因此皮肤消毒应严格按规程操作。v5、一般菌血症由一种细菌引起，但约5%-10%的菌血症患者是多菌性菌血症。2020/11/1414自动血培养仪v原理：自动血培养检测系统是检测细菌和真菌生长时所释放的二氧化碳二氧化碳来作为血液中有无
7、细菌的指标。检测技术有放射标记、颜色变化（CO2感受器）、荧光技术和压力检测等。自动血培养仪集培养、震荡和检测一体化。接种血液标本后，血培养瓶在培养、震荡的同时，由检测系统自动连续监测瓶中CO2的产生情况，所测得信号传送至电脑分析，绘制出每个瓶中微生物的生长曲线。一旦出现阳性结果，电脑自动报警，指示阳性瓶的位置。2020/11/1415血培养瓶厌氧瓶成人需氧瓶小儿需氧瓶2020/11/1416全自动血培养仪2020/11/1417自动血培养仪特点v自动血培养仪除了适用血培养外，还可以用于其他无菌部位标本如脑脊液、胸腹水、和关节液等的细菌和真菌培养的检测。v自动血培养仪与手工系统相比，提高了阳性
8、提高了阳性检出率检出率，灵敏度高，操作简单，能节省人力，缩短检验周期缩短检验周期，一般培养5天。但仪器、设备和消耗品的成本较高。2020/11/1418鲍曼不动杆菌v鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）为非发非发酵革兰阴性杆菌酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌。主要引起呼吸道感染，也可引发菌血症、泌尿系感染、继发性脑膜炎、手术部位感染、呼吸机相关性肺炎等。v是医院感染的重要病原菌。近年来的感染在增多，且其耐药性日益严重，对危重患者及ICU中的患者威胁很大。2020/11/14192020/11/1420步骤和方法1、形态观察 革兰阴性、球状或球杆菌，常成
9、双排列。2、菌落观察 在血平板上形成圆形、凸起光滑、边缘整齐、不透明、灰白色、有粘性的菌落。菌落较小，在麦康凯上生长良好，形成无色或淡粉红色菌落。2020/11/1421步骤和方法2020/11/1422药物敏感试验对于不动杆菌属，首选抗菌药物为头孢他啶、哌拉西林、替卡西林、次选阿米卡星、亚胺培南、环丙沙星。鲍曼不动杆菌对全部氨基青霉素，第一代、第二代头孢菌素和第一代喹诺酮类抗生素天然耐药。目前治疗多选用-内酰胺类药物内酰胺类药物+氨基糖氨基糖苷类联合用药苷类联合用药2020/11/1423药敏纸片抑菌圈直径头孢他啶 14 15-17 18头孢吡肟FEP 14 15-17 18头孢噻肟CTX
10、14 15-22 23头孢曲松CRO 13 14-20 21美洛培南MPN 13 14-15 16妥布霉素TM 12 13-14 15阿米卡星AN 14 15-16 17左氧氟沙星CIP 13 14-16 17哌拉西林/他唑巴坦PIP/TA 17 18-20 21替卡西林/克拉维酸TIC/CA 14 15-19 202020/11/1424注意事项1、染色、药敏试验、生化试验尽量挑取单个菌落，若用量大可挑取多个，尽量不要使用一区。2、由于不动杆菌的细菌进行革兰染色时不易脱色，有时易染成革兰阳性，误认为革兰阳性球菌，实验时应注意鉴别。2020/11/1425人有了知识，就会具备各种分析能力，明辨是非的能力。所以我们要勤恳读书，广泛阅读，古人说“书中自有黄金屋。”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识，培养逻辑思维能力；通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平，培养文学情趣；通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。有许多书籍还能培养我们的道德情操，给我们巨大的精神力量，鼓舞我们前进。
