1、核酸的制备及基因组文库的构建核酸的制备及基因组文库的构建一、核酸制备的基本原理二、核酸制备的基本方法三、质粒DNA的制备四、基因组DNA的制备五、RNA的制备六、基因组、cDNA文库的构建主要内容主要内容一、核酸制备的基本原理DNA主要存于细胞核中，其它如线粒体和质体等，也含有少量DNA。RNA主要存于细胞质中，其它如线粒体和核仁等也含有RNA。在生物体中，DNA和RNA都一般以核蛋白的形式存在。核酸不溶于一般有机溶剂。原核细胞与真核细胞 菌毛原核细胞简示图原核细胞的主要结构有细胞膜、细胞质、核糖体，以及由一条裸露的 DNA 双链所构成的拟核。拟核没有与细胞质部分相隔开的界膜（核膜），这是与真
2、核细胞的主要区别。真核细胞中只有植物细胞有细胞壁。原核细胞中的DNA没有组蛋白(histone)与之结合。无有丝分裂(mitosis)和减数分裂(meiosis),DNA复制后，细胞随即分裂为二。拟核 核糖体真核细胞简示图真核细胞含有细胞核。DNA与组蛋白等蛋白质共同组成染色体结构，在核内可看到核仁。真核生物进行有性繁殖，并进行有丝分裂。也有些真核生物的细胞也能进行无丝分裂，如人的肝脏细胞。核酸制备的基本原理1、细胞破碎2、将核蛋白解联，即利用解联剂将核蛋白裂解为核酸和蛋白。3、精致纯化核酸注意事项：操作过程应避免核酸的降解，包括化学因素（如过酸过碱），物理因素（如强烈振荡、高温、辐射等），生
3、物酶等二、核酸制备的基本方法（一）细胞破碎1、物理方法 机械碾碎：对于动物组织（如鼠肝），一般多采用匀浆的方法。组织捣碎器：是一种剧烈的破碎的方法，必须保持低温，时间不宜太长。超声波：借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器的有效方法。压榨法：是一种温和、彻底破碎细胞的方法。即用高压迫使几十毫升细胞悬液通过一个小于细胞直径的小孔，使细胞被挤压破碎。2、溶胀和自溶 溶胀：在低渗溶液（如低浓度的稀盐溶液中），由于存在渗透压差，溶剂分子将大量进入细胞，致使细胞膜膨胀破裂。自溶：细胞结构在本身所具有的各种水解酶作用下，发生溶解。应用此法要特别小心，防止目的核酸被分解。3、化学处理用脂溶性的溶剂（如丙酮、氯
4、仿、甲苯等）或表明活性剂（SDS）处理细胞时，可使细胞壁和细胞膜的结构部分溶解，导致细胞破碎。4、生物酶降解如溶菌酶等生物酶有降解细胞壁的功能。在用此法处理细菌细胞时，先是细胞壁消融，然后是渗透压引起的细胞膜破裂，导致细胞破碎。各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法 应用1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母4超声法细胞混悬液5反复冻融法培养细胞6冷热交替法细菌、病毒7高压破碎细菌、细胞8有机溶剂细菌、酵母9去垢剂组织、培养细胞10酶解法细菌、酵母简单介绍几种常用的细胞破碎仪器（二）核酸提取1、阴离子去污剂（SDS）法:SDS（sodium dodecyl sulfate）即十二烷
5、基硫酸钠，是一种有效的细胞消溶剂、核酸酶抑制和蛋白变性剂。利用SDS的非极性基团破坏蛋白分子的次级键，使蛋白变性，使核蛋白解联。应注意的是：变性后蛋白仍在溶液中，可在室温条件下加入1/2体积饱和硫酸铵使蛋白沉淀。2、酚抽提法:酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用。现有许多派生的方法。（1）酚水法 一般向溶液中加入等体积用水或缓冲溶液饱和的重蒸酚（除去氧化物醌），在室温下或低温下摇动混合。变性蛋白分子表面由于含有很多极性基团与苯酚相似相溶，从而变性蛋白分子（以及细胞残渣）溶于酚相，而核酸和多糖溶于水相。其中间为不溶性变性蛋白质。离心分层后取出水层，多次重复操作，直至中间层无明显变性蛋
6、白为止。然后合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀核酸。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。酚抽提法示意图受pH影响很大，若pH为中性偏酸，利于RNA的抽提；若pH略偏碱，利于DNA的抽提。例如，DNA在水饱和酚的酸性条件下容易留在有机相。因此，DNA和RNA的酚抽提法的pH值是不同的。（2）酚/氯仿法：由于酚水法中的缺点是：能溶解10-15%的水，从而溶解一部分核酸。因此，加入氯仿。氯仿的作用是氯仿的作用是：克服酚的缺点，加速有机相与水相分层。另外，最后用氯仿抽提还可去除核酸溶液中的迹量酚（酚易溶于氯仿中）。该法中也常加入异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。（3
7、）热酚法 此法系向抽提液中加入热酚，于65度水浴振荡抽提，离心去酚后，再反复抽提3-4次（加热时间不要超过10min）。目前该法已成为由动物和细菌细胞制备RNA的标准方法。（4）SDS-酚法 酚与SDS结合，是适用范围最广的方法之一。Phase Lock Gel-酚/氯仿抽提核酸的最佳伴侣 对于核酸纯化，常使用酚/氯仿抽 提。然而，实验中常需要面对不同相层的不稳定。为避免将蛋白杂质或有机相连同上清水相一起吸出，我们往往会弃去一部分上清，这样会造成相当一部分样品损失，特别是小体积的酚抽。反之，如果不小心混入了有机相，又会对下游实验产生抑制作用。国内天根（Tiangen）公司有个产品：Phase
8、Lock Gel(PLG)。只需将酚氯仿和样品的混合物加入预装有PLG的管子里，离心，PLG化合物就会在水相和有机相之间形 成一层致密的固体，将中间层的蛋白杂质和下层有机相完全锁在固体之下，这样，全部水相样品可轻松吸出，完全不用担心混入杂质，也不用担心酚氯仿会不小心流 出来。3、浓盐法:高浓度的盐可以破坏核酸和蛋白质之间的次级键，使核蛋白解联。一般先用1MNaCl或1MNaClO4进行抽提，再加入氯仿/异戊醇（起消泡作用），变性蛋白停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中，然后用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来。该法对核酸的损伤较小，但去除蛋白不够彻底，常与其它方法结合使用。如
9、经高氯酸钠处理后，采用CsCl密度梯度离心，便可将蛋白全部去除。4、高通量的RNA分离技术:（1）微量移液法 借助毛细管或微量移液管直接提取细胞的内含物，进行RNA的抽提。（2）激光微解剖法 将被冷冻或被石蜡包埋的组织切成薄片，然后所需部位被激光解剖下来，再利用黏膜吸附，转移到RNA提取液。（3）原生质体分离法 此法首先将荧光蛋白（GFP）转入受体细胞，用酶处理破壁后，通过紫外照射使那些表达绿色荧光蛋白的细胞产生荧光，再通过荧光感受分离仪将其分离出来，进而制得RNA。（三）核酸的浓缩和沉淀1、核酸的浓缩DNA含量低且容积大时，需浓缩。（1）真空干燥法 此法比较温和，适用于小量样品的浓缩（2）丁
10、醇抽提浓缩法 丁醇能吸收大量水，而DNA不溶于丁醇。（3）聚乙二醇（PEG）吸收沉淀法。将DNA溶液装入透析袋，包埋在PEG中，PEG吸水液化，DNA溶液体积减小。2、核酸的沉淀核酸是多聚阴阳离子的水溶性化合物，它与钠、钾、鎂形成的盐在多种有机溶剂中不溶解，也不会变性。（1）常用于沉淀核酸的盐类：NaAC，NaCl，KAC，MgCl2等。（2）沉淀核酸的有机溶剂：乙醇，异丙醇，PEG等。（3）离心（四）核酸的纯化核酸纯化的方法很多，如酚/氯仿抽提法、超速离心、柱层析、免疫沉淀、凝胶电泳等。柱层析法以硅基质作为填充层析柱的树脂，DNA在高盐的条件下，DNA的磷酸二酯骨架脱水，通过暴露的磷酸盐残基
11、与硅基质结合，而蛋白等杂质不能结合到柱上，可用75%的乙醇洗去杂质；而在低盐条件下，DNA又可从柱子上释放处理，所以可通过再加入TE或水，离心洗脱。讨论 核酸的分离与鉴定质质 粒粒 DNA DNA 制制 备备 质粒质粒(plasmid)(plasmid)是是细菌内独立于基因组（大细菌内独立于基因组（大环状环状DNADNA）并能自我复制的小环状并能自我复制的小环状DNADNA分子分子 其大小范围从其大小范围从lkblkb至至200200kbkb以上不等。以上不等。这些质粒都是独立于细菌基因组这些质粒都是独立于细菌基因组DNADNA之外进行之外进行复制和遗传的复制和遗传的辅助性遗传单位辅助性遗传单
12、位。质粒是携带质粒是携带外源基因外源基因进入细菌中扩增或进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种表达的重要媒介物，这种基因运载工具基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术本的实验技术 质粒的结构特点质粒的结构特点v 分子量相对较小分子量相对较小v 共价闭合分子共价闭合分子v 双链环状结构双链环状结构具有更强的抗切割和抗变性能力具有更强的抗切割和抗变性能力质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag，筛选标记/报告基因等 细菌收集纯化质粒DNA细菌培养细菌裂解质粒质粒
13、DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 质粒质粒DNADNA的提取和纯化的提取和纯化 一、细菌的培养一、细菌的培养 (bacterial culture)(bacterial culture)l l 先分离单个菌落，接种到含少量适当抗先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒，质粒DNADNA也在自主复制。也在自主复制。二、细菌的收集二、细菌的收集(bacterial collection(bacterial collection)细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒提高质粒DNAD
14、NA的纯度，的纯度，离心弃上清，细菌离心弃上清，细菌沉淀最好用沉淀最好用STESTE或生理盐水悬浮或生理盐水悬浮，漂洗，漂洗l-2l-2次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净。净。三、细菌裂解细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱裂解法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择。v大质粒（大质粒（15kb）的处理方法：的处理方法：采用温和处理方法采用温和处理方法，使用蔗糖、溶菌酶、，使用蔗糖、溶菌酶、EDTA，后再使用后再使用SDS裂解，使裂解，使plasmid损伤减少损伤减少
15、v小质粒（小质粒（15kb）的处理方法：的处理方法：无需特殊处理，无需特殊处理，碱裂解方法碱裂解方法等均可使用等均可使用1.在NaOH存在的强碱性（pH12.012.6）条件下，用碱和SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。2.在pHl2.0-12.6碱性环境中，大分子量细菌基因组DNA完全变性，而共价闭环(CC)质粒DNA的大部分氢键也断裂，但两条互补链不会完全分离。3.将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，大部分基因组DNA（无法复性）和蛋白质形成沉淀，而CC质粒DNA复性，仍然为可溶状态。4.经离心分离，质粒DNA保留在上清液中。5.再用酚/氯仿
16、抽提或柱层析法进一步纯化质粒DNA。碱裂解法原理碱裂解法原理14ml培养细菌收集培养细菌收集细菌菌体重悬细菌菌体重悬细菌破裂溶解、染色体基因组和蛋白质细菌破裂溶解、染色体基因组和蛋白质变性、变性、质粒变性质粒变性变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、变性的细菌基因组形成网状、蛋白质变性、质粒复性质粒复性Solution ISolution IISolution III进一步分离、纯化质粒进一步分离、纯化质粒DNA碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分碱裂解法提取质粒的试剂及主要成分50 mM葡萄糖/25 mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0,100ug/ml RNAse0.2 M
17、 NaOH/1%SDS（要柔和）4M 盐酸胍，0.75MKAc，用HAc调pH为44.5。碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。质粒质粒DNADNA的进一步纯化的进一步纯化 1.CsCl-EB法 2.聚乙二醇沉淀法 3.柱层析法 4.酚/氯仿法CsCl-EB 密度梯度离心法vEB插入相邻的碱基之间，降低了DNA的浮力密度。在过量EB存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；RNA密度最大沉于管底；DNA位于中间。vCsCl可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。简单介绍 利用试剂盒提取质粒DNA 建立基因组文库；建立基因组文库；克隆特定的基因；克隆特
18、定的基因；用用 Southern 印迹检测某一基因的存在和拷贝数；印迹检测某一基因的存在和拷贝数；用用 PCR 反应检测基因的存在及突变等反应检测基因的存在及突变等.从细胞或组织中提取的基因组从细胞或组织中提取的基因组 DNA 的目的的目的基因组基因组 DNA 的制备的制备1 1、DNADNA样品准备样品准备 常见的标本：常见的标本：血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织：生物组织：最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 70 70或液氮或液氮基因组基因组 DNA 的制备步骤的制备步骤2、DNA提取提取 （1 1）酚抽提
19、法：）酚抽提法：首先用首先用EDTAEDTA、SDS SDS（对于细菌也可用溶菌酶）（对于细菌也可用溶菌酶）、蛋白、蛋白酶酶K K溶液破碎细胞，消化蛋白溶液破碎细胞，消化蛋白，然后用，然后用pH8pH8的的TrisTris饱和饱和酚或酚酚或酚-氯仿氯仿抽提抽提DNADNA，然后然后0.1 0.1 倍体积的倍体积的 3 M NaAC 3 M NaAC 和和 2.5 2.5 倍体积的倍体积的 100%100%乙醇沉淀乙醇沉淀 DNADNA,并用并用 70%70%乙乙醇除去醇除去 DNA DNA 沉淀中的盐离子沉淀中的盐离子。最后将基因组最后将基因组 DNA DNA 溶溶解在解在 TE TE 缓冲液
20、缓冲液中，使其终浓度为中，使其终浓度为 1 mg/ml1 mg/ml，置，置 4 4 C C 保存。保存。一些RNA，尤其是mRNA会在苯酚处理过程中去除，但大多数RNA和DNA一起保留在水相，因此最有效去除RNA污染的方法就是加RNAse。（2 2）甲酰胺解聚法：甲酰胺解聚法：v破碎细胞同上，然后用破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解高浓度甲酰胺解聚蛋白质与聚蛋白质与DNADNA的结合的结合，再透析获得，再透析获得DNADNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNADNA的的复合物，可以使蛋白质变性。复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚减少了酚多次抽提的步骤多次抽提的步骤
21、v甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的子量的DNADNA样品。可得样品。可得DNA 200kbDNA 200kb左右。左右。（3 3）玻璃棒缠绕法：玻璃棒缠绕法：v用用盐酸胍裂解细胞盐酸胍裂解细胞，将裂解物，将裂解物铺于乙醇上铺于乙醇上，然后用带钩，然后用带钩或或U U型玻璃棒在型玻璃棒在界面轻搅，界面轻搅，DANDAN沉淀液绕于玻棒沉淀液绕于玻棒。生成。生成DNADNA约约8080kbkb。（4 4）表面活性剂快速制备法：表面活性剂快速制备法：v用用Triton X-100Triton X-100或或NP40NP40表面活性剂破碎细胞表面活性剂破碎细胞，
22、然后用蛋，然后用蛋白酶白酶K K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。v方法包括方法包括透析、层析、电泳及选择性沉透析、层析、电泳及选择性沉淀。淀。v电泳法简单、快速，是电泳法简单、快速，是DNA样品纯化最样品纯化最重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺重要的方法。琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺电泳。电泳。3、DNA的纯化的纯化4、DNA的浓缩v1 1、固体聚乙二醇（固体聚乙二醇（PEGPEG）浓缩：浓缩：v2 2、丁醇抽提浓缩：丁醇抽提浓缩：DNADNA溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但DNADNA不会。因此重复几次可显著减少不会。因此重复几次可显
23、著减少DNADNA体积。体积。5、DNA的检测溴乙锭染色溴乙锭染色：在在254254nmnm紫外光下检测，如需回收最好在紫外光下检测，如需回收最好在300300nmnm紫外光紫外光下割胶，否则易使嘌呤断链，在下割胶，否则易使嘌呤断链，在1 1cmcm宽带上可检到宽带上可检到1010ng DNAng DNA。银染法银染法：AgAg+与与DNADNA形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏形成复合物，在甲醛还原下可染成黑褐色，灵敏度高度高200200倍，但不能回收。倍，但不能回收。6、DNA的回收由于基因组DNA片段大，在离心过柱时可能被“扯断”，因此常规的离心过柱的方法并不 适合大片段DNA的
24、回收。经典方法是电洗脱。其原理是是将含DNA片断的凝胶放在一个用半透膜隔离的空间中，通过电泳的电流使得DNA离开凝胶进入液相，回收液相后纯化沉淀其中的DNA分子。低熔点琼脂糖（需加热到65溶解）和琼脂糖酶消化也是常用方 法，均使DNA溶回溶液，然后使用酚抽提法回收DNA。另外还有玻璃珠洗脱法或者其它纯化填料。玻璃珠洗脱法是将琼脂糖凝胶溶于高浓度的碘化钠溶液，然后加入玻璃珠结合DNA，经分离、洗涤后，在低盐缓冲液中将DNA洗脱下。(1)防止内源性防止内源性 DNase 裂解缓冲液中的裂解缓冲液中的 EDTA使使 DNA免遭免遭 DNase 的降解。的降解。(2)保证得到高分子量的基因组保证得到高
25、分子量的基因组 DNA 在制备基因组在制备基因组 DNA 过程中应减少物理机械作用，过程中应减少物理机械作用，防止基因组防止基因组 DNA 的损伤。的损伤。(3)保证基因组保证基因组 DNA 不被蛋白质所污染，否则将影响不被蛋白质所污染，否则将影响限制性内切酶对限制性内切酶对 DNA 的酶切作用。的酶切作用。高纯度高纯度 DNA 的的 OD260/OD 280 值大于值大于 1.7。制备基因组制备基因组 DNA 时应注意时应注意哺乳动物基因组哺乳动物基因组 DNA1,6.DNA/HindIII;2,3.大鼠基因组大鼠基因组 DNA；4,5.小鼠基因组小鼠基因组 DNA基因组基因组 DNA 的检
26、测的检测细菌基因组细菌基因组 DNA1.1 Kb Plus DNA Ladder;2,3.M.sm 基因组基因组 DNA1 2 31 2 3 4 5 6讨论 细菌基因组DNA的提取磁珠法磁珠法DNA提取提取 其原理是磁珠表面带有特定活性基团，在特定的条件下能够与目的物质进行特异性结合，同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便的实现定向移动与富集，进而实现对目标物质的分离纯化。适用于不同的标本类型及标本量。如全血、血浆、咽拭子、组织、痰、脑脊液等生物标本。RNA的提取每个细胞的RNA量约为510 g。RNA可分为：80%-85%rRNA（核糖体RNA）、10%-15%tRNA、1%-5%
27、mRNA、前体RNA；其它RNA：hnRNA（不均一核RNA）、snRNA、snoRNA等RNA的提取在操作程序上虽然与DNA的提取大致相同，但由于RNA极易被RNA酶降解。RNase除胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中。RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复。Rnase不需要二价阳离子激活。因此在具体操作上有许多需要特别注意的地方，而去除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键。v必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。内源性内源性RNA酶酶外源性外源性RNA酶酶主要来源：v
28、 被污染的缓冲液 细菌或微生物污染，高压不能去除RNA酶，必须丢弃v 自动移液装置制备制备RNARNA时，最重要的是使时，最重要的是使RNaseRNase灭活：灭活：所有容器都要经过所有容器都要经过高温处理高温处理，不能高温高压的用，不能高温高压的用0.10.1焦碳酸二乙酯（焦碳酸二乙酯（DEPCDEPC）处理。处理。设置专门设置专门RNA移液、电泳装置。所用化学试剂为移液、电泳装置。所用化学试剂为RNase free的。的。加入加入强变性剂强变性剂（如胍盐）使（如胍盐）使RNaseRNase失活；失活；在在RNARNA的反应体系内加入的反应体系内加入RNaseRNase的的抑制剂抑制剂（如（
29、如RNasin)RNasin)变性剂变性剂(denaturant)(denaturant)v选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂，最强的是异硫氰酸胍和盐酸胍，使蛋白质转换成随机卷曲状态。）v使用蛋白酶v使用阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠RNARNA酶变性剂和抑制剂酶变性剂和抑制剂RNARNA酶抑制剂酶抑制剂(RNase inhibitor)(RNase inhibitor)DEPC（焦碳酸二乙酯）高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。DEPC非选择性的修饰蛋白质和RNA，且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化RNA的
30、过程中不使用DEPC。RNARNA酶的蛋白抑制剂，酶的蛋白抑制剂，该类蛋白质可与RNA酶结合形成非共价复合物从而抑制RNA酶活。商品化的RNA酶蛋白抑制剂的名称各异（如RNAsin等）。联合使用RNase的特异抑制剂（如DEPC与RNasin等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。注意：注意：DEPC是潜在的致癌剂，须小心操作。是潜在的致癌剂，须小心操作。还原剂还原剂v加入-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。异硫氰酸胍异硫氰酸胍-酚酚-氯仿一步法氯仿一步法v首先以含异硫氰酸胍、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂
31、解细胞。v然后在pH4.0的条件下，酚/氯仿抽提细胞裂解溶液。v最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA。在酸性条件下，加入氯仿后，DNA未能进入水相，而RNA在水相，离心吸取上清RNA，就去除了DNA。当然也可用RNAse free 的DNase处理。本法具有简便、快速、经济、高效及提取的RNA质量高等优点。商品化的单相裂解试剂法分商品化的单相裂解试剂法分RNARNAv本法是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案。v以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相。v变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。v保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉
32、淀与75%乙醇洗涤而制备。TRIzol 试剂试剂(Invitrogen 公司公司)的主要成分为异硫氰酸胍、的主要成分为异硫氰酸胍、-巯巯基乙醇、十二烷基肌氨酸钠和苯酚。基乙醇、十二烷基肌氨酸钠和苯酚。用用 TRIzol 试剂处理细胞或匀浆组织试剂处理细胞或匀浆组织氯仿萃取蛋白质氯仿萃取蛋白质沉淀沉淀 RNA洗涤洗涤 RNA 沉淀沉淀用用 RNase-free ddH2O 溶解溶解 RNA，并置，并置-20 C保存保存检测检测 RNA(加加 l RNA到到%琼脂糖凝胶中琼脂糖凝胶中)用用 TRIzol 试剂制备总试剂制备总 RNA 为防止单链为防止单链 RNA 形成空间结构，需用形成空间结构，需
33、用变性变性的琼脂糖凝的琼脂糖凝 胶即胶即甲醛甲醛-琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶分离分离 RNA分子。分子。为防止外源性为防止外源性 RNase 的污染，所用的倒胶槽、梳子、的污染，所用的倒胶槽、梳子、电泳槽等需要用电泳槽等需要用 DEPC 或或 H2O2 处理；所用缓冲液用处理；所用缓冲液用 0.1%DEPC 的来配制。的来配制。RNA 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳RNA Markers(0.28-6.58 kb);2.小鼠脑组织中的总小鼠脑组织中的总 RNA;3.大鼠脑组织中的总大鼠脑组织中的总 RNA1 2 3 RNA Markers(0.5-9.0 kb);2.大肠杆菌总大肠杆菌总 RNA18S
34、 rRNA28S rRNA16S rRNA23S rRNA1.5 kb3.0 kb6.58 kb4.98 kb1 21.90 kb1.38 kb3.64 kb 2.60 kb 0.96 kb0.62 kb0.28 kb直接裂解过柱法直接裂解过柱法 加入足量缓冲液RLT或RLC。剧烈涡旋裂解细胞，记住加入BME。将溶液转移到置于收集管中的QIAshredder 旋转柱中，最大速度离心2 min，丢弃柱子，收集下液。加0.5体积的乙醇（96-100%）至澄清的溶液中，上下吹吸混匀，然后转移到RNeasy旋转柱中。离心丢掉流动的液体部分。加缓冲液RW1到RNeasy旋转柱中，离心对旋转柱膜进行清洗。
35、丢掉流动的液体部分。加缓冲液RPE到RNeasy旋转柱中，离心对旋转柱膜进行清洗。丢掉流动的液体部分。将RNeasy旋转柱置于新的1.5 ml 收集管中。在旋转柱中直接加30-50 l无RNase的水。离心收集下液，即为提取的RNA。目前较先进的方法，采用裂解液（不含苯酚，氯仿）直接裂解，RNA/DNA同时过柱子，然后在柱子上面直接分离RNA/DNA。商业化有Qiagen RNeasy Plant Mini KitRNeasy Plant Mini Kit。mRNAmRNA的分离纯化的分离纯化v除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端带有长短不同的poly（A）尾巴。v利用碱
36、基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA。vDNA的短期贮存：4或-20存放于TE（tris和EDTA，pH8）缓冲液中。vDNA的长期贮存：在70乙醇，或在DNA溶液中加一滴氯仿，-70保存。vRNA的贮存：溶于0.3mol/L的醋酸钠溶液或双蒸水，也可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，在-70保存。核酸的贮存基因组文库的构建基因组文库的构建定义：某种生物基因组的全部遗传信息通 过克隆载体储存于某一受体菌的群 体中，这个群体就称为该生物基因 组的文库(genomic library)目的：a）分离
37、有用的目的基因 b）保存某种生物的全部基因基因组文库或cDNA文库用于基因克隆的DNA材料的来源从特定组织提取的染色体基因组DNA-基因组文库mRNA反转录成的cDNA拷贝-cDNA文库用于基因克隆的DNA材料的选择如果研究的目标是弄清一种蛋白质的氨基酸顺序，可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列的结构直接推导出来；如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或是在mRNA中不存在的某种特定序列，有关这类的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。相对于cDNA文库，基因组文库的优点：vcDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，v cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映
38、着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；v 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段的序列，不能用于研究基因编码区外侧的调控序列的结构与功能。基因组、cDNA文库的构建流程组织可克隆之DNA载体DNAcDNAmRNA部分酶解DNADNA长度分级双链cDNADNA与载体连接 引入宿主细胞鉴定文库的完备性扩增后供长期储存筛选出所需要的克隆基因组DNA文库的构建简图限制性内切酶限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装基因组文库构建步骤一、基因组DNA的提取 染色体DNA、质粒
39、DNA二、基因组DNA的不完全酶切1.根据实验需要选择合适的限制性内切酶 当识别序列为 4 个和 6 个碱基时，它们分别平均在每 256 个和 4096 个碱基中会出现一个识别位点（44=256，46=4096）2.分离目的酶切片段大小的确定 a)克隆单个基因：10 kb b)克隆基因族：99%对于人-珠蛋白基因（1.5kb）的例子，N值应是：（0.99）N=1-（1.5 100/3106）=9.2 106基因组大小酶切片段大小文库克隆子数的关系基因组大小酶切片段大小文库克隆子数的关系基因文库的质量标准：除尽可能高的完备性外，理想的基因文库还应具备：克隆总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力；载体
40、的装载量必须大于基因的长度；含有相邻DNA片段的重组克隆之间，需存在足够长度的重叠区，以利于克隆排序；克隆片段易于从载体分子上完整卸下；重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。三、酶切片段与克隆载体连接、酶切片段的分离与纯化）低熔点琼脂糖回收目的片段）试剂盒回收目的片段、酶切片段与克隆载体连接重要的是克隆载体的选择除质粒(10 kb)、噬菌体载体(20 kb)、粘粒(Cosmid)（40 kb）外，还有酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome，YAC)（100-2000kb），细菌人工染色体（BAC)、噬菌体P1克隆系统以及哺乳动物人工染色体（MAC)等载体。四、重组转化
41、受体细胞四、重组转化受体细胞、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞、重组质粒转化受体细胞、重组质粒转化受体细胞1）转化法(transformation)：氯化钙处理的大肠杆菌很容易摄取外源性DNA，转化特指将质粒DNA 或以它为载体构建的重组子直接导入细菌细胞的过程。2）转导法(transduction)：在分子克隆技术中，转导特指以噬菌体DNA 为载体，将外源DNA 导入细菌细胞的过程。3）转染法(transfection)：转染特指“将外源基因导入哺乳动物细胞的一系列技术的通称”。哺乳动物细胞很难捕获外源DNA，近年来通过摸索已建立了几种高效的将外源基
42、因导入哺乳动物细胞的方法，如脂质体包裹DNA 转染法、磷酸钙转染法、DEAE 葡聚糖介导转染法、电击法等。五、基因组文库克隆子的保存与筛选五、基因组文库克隆子的保存与筛选、基因文库的保存、基因文库的保存 1)影印滤膜保存法 该法需要两个滤膜，首先将无菌主滤膜平铺于培养基平板上，用一灭菌涂布棒将接种液均匀涂在主滤膜上，37C培养过夜。然后将带有编号的影印滤膜放于带有细菌菌落的主滤膜上（菌落面朝上），将两张滤膜紧密的压在一起，并用针头沿每对硝酸纤维素膜边缘不对称地打孔使两张滤膜相对定位。剥离两张滤膜，温育影印滤膜，然后密封贮存。2）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上刮取已长出的克隆子（
43、不是单个）转入含适当的抗生素培养基中，混合的细菌生长数代后，其培养物于-70oC储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致文库中某些特定的序列过多或过少。3)保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合适的含抗生素的培养基中，菌体生长到一定浓度后，加入终浓度为25%的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大2、基因文库的筛选、基因文库的筛选v表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选v抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄 二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长v分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选
44、v免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选vPCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段当我们要对某一基因结构和功能进行研究时，首先要获得此基因，最简便的方法就是直接从基因文库中获取，即基因文库的筛选。讨论讨论 基因组文库的构建基因组文库的构建cDNA文库的构建文库的构建定义：某种生物基因组转录的全部mRNA 经反转录产生的cDNA片段分别与克隆 载体重组，储存于某种受体菌中，该 群体就称该生物基因组的cDNA文库 （cDNA Library）.原理：将带poly（A）的mRNA经酶促反应 转变为双链DNA，再与原核载体连接.cDNA文库的构建流程v 细胞总 RNA 的提取和 mR
45、NA 分离；第一链 cDNA 合成；第二链 cDNA 合成；双链 cDNA 克隆到载体并导入宿主细胞中繁殖。一、mRNA的制备和分离需考虑：mRNA 的完整性（合成目的蛋白的能力、大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间以及指导合成cDNA的能力）mRNA 的丰度（高丰度mRNA占细胞质总RNA量的50-90%,；低丰度mRNA占细胞质总mRNA量的0.5%以下）mRNA 的富集（典型的哺乳动物细胞含有10 000-30 000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝）mRNA的丰度与文库克隆子数的关系：N=ln(1-P)ln(1-n)N:所需克隆数;P:要求
46、的概率;n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例1)按大小对mRNA进行分级分离*通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分 子，该方法的分离效果最好，但从凝胶中回 收的得率较低.*蔗糖梯度离心：加入破坏RNA二级结构的变 性剂如氢氧化甲基汞等，再进行蔗糖梯度离 心以分离不同分子量的mRNA.2)cDNA的分级分离*mRNA通过反转录形成cDNA，在插入到克 隆载体前，通过琼脂糖凝胶电泳，将不同 大小的cDNA分子分离开来.*优点：a）避免了分离过程中mRNA被污染的 RNA酶降解 b）增加了获得全长cDNA克隆的概率 c）获得更准确的分级分离效果（分子量）3）多聚核糖体免疫学纯化法*使用抗体
47、来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合 到免疫亲和柱（A蛋白-Sepharose柱）上，随后用EDTA将多聚核糖体解离下来，并通过 Oligo(dT)层析分离mRNA,利用该方法可将目 的mRNA纯化数千倍.目的mRNA在细胞中的 含量可为数十拷贝.二、二、cDNA第一链的合成第一链的合成利用反转录酶合成cDNA的第一链合成 DNA 时需要引物引导，目前常用的引物主要有两种，即 Oligo（dT）和随机引物。Oligo（dT）引物一般包含 1020 个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀有酶切位点的引物共同组成，随机引物一般是包含 610 个碱基的寡核苷酸短片段。三、三
48、、cDNA第二链的合成第二链的合成1.自身引导合成法自身引导合成法：单链cDNA的3端能够形成发夹状的结构作为引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链.缺点：在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导致对应于mRNA 5端的地方的序列出现缺失和重排.1、自身引导法2、置换合成法3、引导合成法4、引物衔接头合成法 2.置换合成法原理：以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口,产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合成cDNA的第二链.优点：a）合成cDNA的效率高 b）直
49、接利用第一链的反应产物，不需纯化 c）避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA首先是制备一端带有 Poly（dG）的片段 和带有 Poly（dT）的载体片段 ，并用片段 来代替 Oligo（dT）进行 cDNA 第一链的合成，在第一链 cDNA 合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链 cDNA 的 3-端加上一段 Poly（dC）的尾巴，同时进行酶切创造出另一端的粘端，与片段 一起形成环化体，这种环化了的杂合双链在 RNA 酶 H、大肠杆菌 DNA 聚合酶 和 DNA 连接酶的作用下合成与载体联系在一起的双链 cDNA。其主要特点是合成全长 cDNA 的比例较高，但操作比较复杂，形成的 cDN
50、A 克隆中都带有一段 Poly（dC）/（dA），对重组子的复制和测序都不利。3.引导合成法4.引物引物-衔接头法衔接头法通过改进引导合成法而来的。第一链合成后直接采用末端转移酶（TdT）在第一链 cDNA 的 3-端加上一段 Poly（dC）的尾巴，然后用一段带接头序列的 Poly（dG）短核苷酸链作引物合成互补的 cDNA 链，接头序列可以是适用于 PCR 扩增的特异序列或用于方便克隆的酶切位点的序列。这一方法目前已经发展成 PCR 法构建 cDNA 文库的常用方法。四、双链四、双链cDNA分子的克隆分子的克隆 1.同聚物加尾法同聚物加尾法 利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的
