1、 王彦杰王彦杰 黑龙江八一农垦大学黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院生命科学技术学院 HLJ August First Land Reclamation University发酵工程及设备发酵工程及设备Fermentation Engineering and Equipment分批培养中微生物的生长分批培养中微生物的生长迟滞期迟滞期对数生长期对数生长期稳稳 定定 期期死亡期死亡期第三节发酵控制与中间补料 补料的理由q 初始培养基中葡萄糖过多引起抑制初始培养基中葡萄糖过多引起抑制q 代谢后碳氮源不平衡、微量元素缺乏代谢后碳氮源不平衡、微量元素缺乏q 次级代谢产物的合需补加前体次级代谢产物的合需
2、补加前体q 初始培养基营养过于丰富造成菌浓过大初始培养基营养过于丰富造成菌浓过大q 中后期营养不足，菌体过早衰老中后期营养不足，菌体过早衰老一、中间补料的方法、意义及内容方法：采用较低浓度的基础培养基，待菌体长到一定阶段，补入适当的营养物质，延长发酵产物合成期。意义：控制菌的生长速率、培养中期的代谢活动，延长合成期，推迟菌体自溶；加入前体增加合成产物的中间体，从而使产量大幅度提高。中间补料内容1、碳源2、氮源3、前体4、无机盐和水控制和引导产生菌在培养过程中，特别是中期的生化代谢活动向着有利于产物合成和分泌的方向发展。二、补料控制补什么？怎么补？如何控制？1、补充微生物所需的能源和碳源、补充微
3、生物所需的能源和碳源碳源是微生物菌体生长时需要量碳源是微生物菌体生长时需要量最大的物质，在发酵前期消耗很快，最大的物质，在发酵前期消耗很快，到了产物合成阶段菌体要维持活性必到了产物合成阶段菌体要维持活性必须补充碳源，以便延长产物合成期。须补充碳源，以便延长产物合成期。实例：谷氨酸实例：谷氨酸在原发酵控制工艺的基础上，减少初糖在原发酵控制工艺的基础上，减少初糖浓度，增加生物素用量达浓度，增加生物素用量达5ug/L，加大接种，加大接种量到量到10%左右，以利于菌体迅速繁殖，获左右，以利于菌体迅速繁殖，获得生产需要的足够量的菌体。得生产需要的足够量的菌体。当进入产酸期，残糖达当进入产酸期，残糖达2%
4、左右，连续左右，连续补糖，维持糖浓度在补糖，维持糖浓度在2%左右，提高温度到左右，提高温度到3637，通氨或流加尿素维持，通氨或流加尿素维持pH7.07.5，利用菌体所形成的酶系继续进行发酵，产利用菌体所形成的酶系继续进行发酵，产酸可达酸可达10%，提高了，提高了30%以上。以上。后来补糖方法在抗生素发酵中普遍采用。后来补糖方法在抗生素发酵中普遍采用。补糖控制考虑的因素补糖控制考虑的因素补糖时间、补糖量、补糖方式补糖时间、补糖量、补糖方式参考数据：参考数据：糖耗速率、残糖浓度、糖耗速率、残糖浓度、pH变化、菌体浓变化、菌体浓度、菌丝形态、发酵液粘度、溶氧浓度等。度、菌丝形态、发酵液粘度、溶氧浓
5、度等。指标：指标：1.根据还原糖水平，如赤霉素还原糖降到根据还原糖水平，如赤霉素还原糖降到0.6%就要补糖。就要补糖。2.根据总糖水平，根据菌的酶系和根据总糖水平，根据菌的酶系和pH变化变化的大小决定。的大小决定。注意：不同的发酵阶段控制的残糖浓度不同注意：不同的发酵阶段控制的残糖浓度不同补糖时间补糖时间补糖时间控制很重要，过早会剌激菌体补糖时间控制很重要，过早会剌激菌体生长，加速糖的消耗，补糖过迟会使菌体所生长，加速糖的消耗，补糖过迟会使菌体所需要的能量供应跟不上，干扰菌的代谢。需要的能量供应跟不上，干扰菌的代谢。例：四环素例：四环素补糖时间（补糖时间（h)96h效价效价(u/ml）2060
6、004510000626000说明说明开始补糖的时间必须根据代谢的变化开始补糖的时间必须根据代谢的变化情况来决定，根据基础培养基的碳源种类情况来决定，根据基础培养基的碳源种类及用量，菌丝生长情况，糖的消耗速率及及用量，菌丝生长情况，糖的消耗速率及残留水平来综合考虑，不能单纯以时间为残留水平来综合考虑，不能单纯以时间为依据。依据。例：根据残糖浓度补料发酵提高纳他霉素产量例：根据残糖浓度补料发酵提高纳他霉素产量实验条件：实验条件：当发酵液中葡萄糖浓度分别降至当发酵液中葡萄糖浓度分别降至3%、2.5%、2%、1.5%时开始补糖，维持糖时开始补糖，维持糖浓度分别在浓度分别在3%、2.5%、2%、1.5
7、%，研究，研究对纳他霉素产量的影响，发酵周期均为对纳他霉素产量的影响，发酵周期均为96h,结果如表结果如表2。采用间歇补料分批发酵，补加时间以发酵采用间歇补料分批发酵，补加时间以发酵液中还原糖水平为控制指标。液中还原糖水平为控制指标。补糖量 补糖量的控制以控制菌体浓度不增加或略增加为原则，使产生菌的代谢活动有利于产物合成。不同补糖速率对发酵的影响 初糖浓度为80g/L，发酵30h后,分别以10g/Lh、25g/Lh、40g/Lh的补糖速度进行补糖，结果见表3。补糖方式可分为：连续流加少量多次大量少次补糖方式连续流加效果最好，可以避免因一次大量加入引起环境突然改变给菌体代谢带来的影响。例：例：L
8、缬氨酸补料分批发酵的研究缬氨酸补料分批发酵的研究分别用不同的补料方式进行补料分批发酵分别用不同的补料方式进行补料分批发酵一次定量加入：一次定量加入：在发酵在发酵30h，残糖浓度为，残糖浓度为12%时，一次性补加时，一次性补加467ml补料液（补料液（60%葡萄糖溶液），使总糖浓度达到葡萄糖溶液），使总糖浓度达到15%。间歇定量加入：间歇定量加入：在初糖浓度降为在初糖浓度降为12%时补加时补加117ml的补料液，每的补料液，每当残糖浓度降为当残糖浓度降为12%时补加，共分时补加，共分4次补完。次补完。间歇恒速流加：间歇恒速流加：每当残糖浓度降为每当残糖浓度降为12%时就以时就以25g/Lh的速度
9、流的速度流加料液，直至加料液，直至467ml补料液全部补完。补料液全部补完。在三种补料方式中，采用恒速流加方在三种补料方式中，采用恒速流加方式发酵结束后残糖最低，间歇定量相对较式发酵结束后残糖最低，间歇定量相对较低，残糖量较高的是一次定量流加方式，低，残糖量较高的是一次定量流加方式，从缬氨酸的产量，糖酸转化率及菌体浓度从缬氨酸的产量，糖酸转化率及菌体浓度比较也是恒速流加的补料方式效果好。比较也是恒速流加的补料方式效果好。不同的流加方式会有不同的结果例:不同的补料方式对酵母生产谷胱甘肽的影响q 恒速流加补料分批培养q 指数流加补料分批培养q 恒一pH补料分批培养流流加加补补料料模模式式培养条件
10、装量3L,接种量5%.空气流量为1L/L min 用适量的酸、碱调节培养液的pH至.5 温度30，转速150r/min，培养12 h，然后流加40g/L的葡萄糖，72h培养结束。好处：解除了底物抑制葡萄糖阻遏效应，结果延长了菌体的生长周期，增加了菌体浓度和GSH产量，图2表示了恒速流加的实验结果。恒速流加培养 在培养过程中以恒定的流速加入葡萄糖。指数流加分批培养F1=u*V0X0exp(u*t)/Yx/y(SF-S)理由：恒速流加过程由于葡萄糖流加的速度始终恒定，在发酵前期菌体浓度低，葡萄糖难以完全消耗，而在发酵的后期，菌体浓度很高，葡萄糖又不能满足菌体生长的需要，因此采用指数流加的方式利于菌
11、体的生长，图3表示了指数流加的实验结果。图3表明：在培养72h之后，发酵液中可以达到极高的菌体浓度，然而经与图2比较后发现，尽管菌体浓度提高，获得的酵母菌体中的GSH含量有所降低，发酵液中的GSH总量增加不大。这可能是后期较高的葡萄糖流加速度抑制了GSH的合成。恒一pH补料的培养模式 根据培养基pH变化，流加40g/L的葡萄糖，当pH降低时，加入碱液调节pH，达到设定的数值。根据糖的消耗加入适量的葡萄糖，由于葡萄糖的分解使pH下降，当pH下降至一定程度之后，则又加入适量的碱液使pH升高，如此反复至60h流加结束，72h培养结束。图4表示了恒pH补料分批培养的实验结果，可以看出，采用恒一pH补料
12、分批培养既可以获得较高的菌体浓度，菌体中的GSH含量又较高，达到了菌体合成和GSH生产的相对统一，因此，发酵液中的总GSH含量最高。EndThanks!2.补充微生物所需的各种氮源补充有机氮源补充无机氮源：通氨、补硫酸氨生产上补氮有两种补氮是发酵控制的另一个重要项目，主要作用是调节pH和补充菌体所需的氮源，从而控制代谢活动。（1）补有机氮 添加某些具有调节生长代谢作用的有机氮源如尿素、酵母粉、蛋白胨、玉米浆，保持菌的活性，补充产物合成所需的氮源。有时与碳源一起配合补料，工厂称作补混合料。例：土霉素发酵前期补23次酵母粉，放罐单位比对照高1500u/ml。青霉素发酵47h开始加尿素，每6h补加一
13、次，结合补加乳糖，发酵单位可达40000u/ml以上。补料依据：氨基氮的消耗、菌的浓度、pH 在谷氨酸生产中，前 12h为菌体生长阶段，由于菌体生长快，氮被利用，使pH下降，这时要及时流加尿素，供给菌体生长所需的氮源并调节pH,生产阶段菌体生长停止，尿素补尿酶分解为氨，pH上升，氨被利用合成谷氨酸，使pH下降，再次添加尿素。pHt补无机氮源 通氨 通氨是某些抗生素提高产量的有效措施，它的作用是补充无机氮源和调节pH。通氨一般使用压缩氨气或氨水（20%），采用少量间歇添加或自动添加，由空气管道流入与发酵液均匀混合。氨浓度控制通过测定氨的比消耗速率，菌的比生长速率，产物比合成速率、pH值来控制补加
14、速率。补硫酸铵 例：林可霉素原来基础培养基中（NH4）2SO4为0.6%，18h后减少到7mg/100ml,发酵后期缺少氮源 改进工艺：将基础培养基中（NH4）2SO4减少为0.5，14.6h开始补加30%（NH4）2SO4溶液，根据培养液的pH和H2-N浓度控制补加量正常情况下H2-N保持在10mg/100ml以下，平均补加（NH4）2SO41.5%,提高了发酵单位。补氮控制：补氮时间、补氮量、补氮方式 根据氮的消耗速率、菌浓度、发酵液粘度、pH来决定补料的时间和补料的量。补充黄豆饼粉、酵母粉一般采取分批补料，而无机氮源和尿素一般采取流加的方式，因为这些氮源对pH 影响大，而且过多的氨离子会
15、对菌的生长产生抑制作用。q补料浓度的确定可以以摇瓶的基质残留浓度为依据进行试验。q当同时需要补充碳源和氮源时可以混合起来一起加入。补入碳源还是氮源以及它们的量要根据产物的分子结构及细胞组成来决定。有的发酵氮源很低也不需补氮源，是因为产物分子中几乎不含氮。3.补前体和无机盐 在发酵过程中添加前体可以显著增加产量及控制发酵方向。青霉素G合成的前体 内酰胺环：氨基已二酸、缬氨酸、半胱氨酸 侧链：苯乙酸前体确认实验 用同位素标记原子来证实 苯环中含H2的苯乙酸 D1-N 15缬氨酸 加入到发酵液中，测定所形成的青霉素分子内的H2，发现有92.5%的青霉素由该前体形成，而青霉素中的N 15只占2.69%
16、。证明苯乙酸部分进入青霉素苯乙酸对青霉素产量和类型的影响苯乙酸添加速度%苯乙酸添加速度%青霉素类型青霉素产量苯乙酸添总量%GXFFH00.0250.02500.180.405501321182313.62.10.231.882.896.222.87.31.917.65.11.2添加速率为0.05%，青霉素产量大，而且可使青霉素G含量提高。q苯乙酸具有毒性，青霉素是借苯乙酸与氨基酸结合形成青霉素而解毒，因此加入前体能形成青霉素，但必须适量而不能过量。q并非添加速率越大越好，据研究表明，加入苯乙酸浓度越高，苯乙酸的利用率越低。苯乙酸可被菌氧化，先氧化成邻羟苯乙酸，然后苯环被破坏形成酮戊二酸，再经T
17、CA循环氧化为CO2和H2O，苯乙酸作为碳源被消耗掉。添加时间的影响 在肌苷生产中发酵需添加次黄嘌呤作为前体，实验表明24h、48h补加，分别增加产量199%和130%，可见24h时补比48h补加增加产量更多。4.补水和无机盐 当发酵液过于粘稠时补水可以稀释发酵液，增加氧的溶解度，提高供氧能力。有的抗生素发酵中采用带放的措施提高总产量。有些金属离子特别是二价阳离子是酶的激活剂，适当时间补入无机盐可以提高酶活，从而提高产量。中间补料的优缺点优点：推迟菌的自溶期，延长产物分泌期，维持较高的生产速率，增加发酵液总体积，使产量大幅度上升。现在大多数抗生素都采取补糖措施。缺点：补糖使工艺复杂化，而且增加了染菌机会。因此工厂管理十分重要，一定要严格消毒，包括料液消毒和管道消毒。
