1、 3.1 3.1 引言引言 3.2 3.2 材料与方法材料与方法 3.3 3.3 结果结果与分析 3.4 3.4 讨论讨论 3.5 3.5 结论结论 概念引言又称前言前言、绪言绪言、绪论绪论，introductionintroduction内容：主要交代该研究的来龙去脉来龙去脉，即回答为什么为什么要研究相关的课题。目的：引出作者研究成果的创新论点创新论点，使读者对论文要表达的问题有一个总体的了解总体的了解，引起读者阅读的阅读的兴趣兴趣。格式要求长度约占正文的1/10-1/8。中文引言部分一般不立“引言”等小标题英文引言部分一般有“introduction”小标题 引言主要内容包括：研究意义与研
2、究进展本研究的切入点本研究的主要结果或结论引言注意事项：研究意义、进展与切入点意义与进展描述切忌空泛，要注意文献的恰当引用；进展中尽量少或者避免介绍人所共知的普通专业知识；时刻注意进展要与本研究的切入点（创新点）关联；进展与切入点的承接要自然；把该放到讨论部分的内容放到进展中；引言注意事项：研究的主要结果或结论避免使用自夸性词语：“填补了一项空白”“达到了什么级先进水平”“前人从未研究过”等；避免使用客套话：“才疏学浅、疏漏谬误之处，恳请指教”“不妥之处还望多提宝贵意见”引言的书写方法：以研究对象加以展开。适用于研究对象有其特殊性的论文。例如：“藏雪鸡雏鸡的生长发育”（俞世福等，1994）藏雪
3、鸡又名淡腹雪鸡，是青藏高原特产的珍禽，对其地理分布、生态习性等均做过报道17，唯对其生长发育的观测资料很少，笔者于1992年对做了较为详细的观察和测定，现将结果报告如下：引言的书写方法：以研究方法展开。适用于研究对象比较一般，而观测指标或处理因素、实验方法有特殊性的科技论文。例如：自从在发现以来，国内外学者进行了广泛研究，目前公认的有方法，但还未有采用方法进行的，有鉴于此，我们。例 随着甘蓝型黄籽油菜新品种选育的发展,油菜籽粒颜色分析愈来愈重要。前人探索了多种油菜种子颜色评价的方法,归纳起来可分为3 类:目测法:;仪器直接测量法:；数字图像分析法:。本研究在前人研究基础上,进一步探索数字图像分
4、析法,引入色彩管理技术对粒色进行鉴定,并自行编制油菜种子颜色分析软件,旨在建立一个科学、实用的油菜种子颜色的评价方法.例 Li和Quirost（2001）发明了一种新型分子标记技术SRAP(Sequence-related almplified polymorphism)，即相关序列扩增多态性。Li和Quirost 采用此技术对86个羽衣甘蓝X花椰菜的RI系作图，；Li等利用该技术对花椰菜与花茎甘蓝的杂交双二倍体进行了研究，；卢泳全等应用SRAP标记技术对大米草的耐盐性状进行了差异显示研究，。目前在油菜上还没有采用此方法开展研究的报道，鉴于此，本研究探索cDNA-SRAP差异显示在甘蓝型油菜黄
5、、黑籽粒色差异表达研究上的可行性，。引言的书写方法：以研究领域展开适用于大多少的研究论文利用利用RNAiRNAi技术沉默麦长管蚜与桃蚜细胞色素技术沉默麦长管蚜与桃蚜细胞色素P450P450【研究意义】麦蚜（尤其是麦长管蚜）是危害中国小麦生产的主要害虫之一，据统计，造成了很大的经济损失。近年来，其危害日趋严重2。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。挖掘和利用新型抗蚜基因并通过基因工程培育小麦和蔬菜抗蚜新种质具有重要意义。【前人研究进展】植物介导的RNAi 技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，通过寄主植物表达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫
6、取食植物后沉默其相应的基因从而达到控制害虫危害的目的。RNAi现象其作用过程是双链RNA（dsRNA）进入生物体内，被Dicer 酶切割成2123 nt 的siRNA3-4，siRNA 与RNA 诱导沉默复合物结合，与互补序列的靶mRNA结合，被Dicer 识别，造成靶基因表达量的下降5。近年来，利用dsRNA 体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析6。棉铃虫肠道中特异P450 可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性，试验表明，利用表达棉铃虫P450 dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内
7、P450 的表达量下降、发育受阻，表现出抗棉铃虫性能8-9;【本研究切入点】小麦和蔬菜抗蚜虫种质资源缺乏，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效，每年给农业生产造成巨大经济损失。迫切需要挖掘和鉴定新型抗蚜基因并通过基因工程育种提高小麦和蔬菜抗蚜特性。细胞色素P450 是一类广泛存在于许多生物中的血红素铁结合蛋白的超基因家族，在多种类型的生化反应、代谢有毒物质和提高昆虫对寄主的适应性方面都发挥着重要的作用12。已经克隆到的昆虫P450 超过了1 000 个13。但利用RNAi 技术沉默麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450及通过植物介导的RNAi 技术提高小麦和蔬菜抗蚜性能的研究尚无报道。【拟解决的关键
8、问题】本研究利用体外合成的麦长管蚜和桃蚜的细胞色素P450保守序列dsRNA 结合人工饲料饲喂麦长管蚜和桃蚜，观察dsRNA 饲喂浓度和时间对蚜虫的生长发育和死亡率影响，通过RT-PCR 分析取食后蚜虫细胞色素P450 表达水平的变化情况，为利用RNAi 技术创制抗蚜虫小麦和蔬菜提供依据。【研究意义】麦蚜（尤其是麦长管蚜）是危害中国小麦生产的主要害虫之一，据统计，造成了很大的经济损失。近年来，其危害日趋严重2。目前，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染。挖掘和利用新型抗蚜基因并通过基因工程培育小麦和蔬菜抗蚜新种质具有重要意义。【前人研究进展】植物介导
9、的RNAi 技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，通过寄主植物表达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其相应的基因从而达到控制害虫危害的目的。RNAi现象其作用过程是双链RNA（dsRNA）进入生物体内，被Dicer 酶切割成2123 nt 的siRNA3-4，siRNA 与RNA 诱导沉默复合物结合，与互补序列的靶mRNA结合，被Dicer 识别，造成靶基因表达量的下降5。近年来，利用dsRNA 体外饲喂或注射来筛选RNA靶标基因，导致靶标基因表达和沉默，已经广泛应用于昆虫生长发育关键基因的鉴定和功能分析6。棉铃虫肠道中特异P450 可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐
10、受性，试验表明，利用表达棉铃虫P450 dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450 的表达量下降、发育受阻，表现出抗棉铃虫性能8-9;【本研究切入点】小麦和蔬菜抗蚜虫种质资源缺乏，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效，每年给农业生产造成巨大经济损失。迫切需要挖掘和鉴定新型抗蚜基因并通过基因工程育种提高小麦和蔬菜抗蚜特性。细胞色素P450 是一类广泛存在于许多生物中的血红素铁结合蛋白的超基因家族，在多种类型的生化反应、代谢有毒物质和提高昆虫对寄主的适应性方面都发挥着重要的作用12。已经克隆到的昆虫P450 超过了1 000 个13。但利用RNAi 技术沉默麦长管蚜和桃蚜
11、体内细胞色素P450及通过植物介导的RNAi 技术提高小麦和蔬菜抗蚜性能的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】本研究利用体外合成的麦长管蚜和桃蚜的细胞色素P450保守序列dsRNA 结合人工饲料饲喂麦长管蚜和桃蚜，观察dsRNA 饲喂浓度和时间对蚜虫的生长发育和死亡率影响，通过RT-PCR 分析取食后蚜虫细胞色素P450 表达水平的变化情况，为利用RNAi 技术创制抗蚜虫小麦和蔬菜提供依据。u 各部分具备，进展描述基本切题 进展中对RNAi原理的介绍多余，切入点不自然【研究意义】麦蚜（尤其是麦长管蚜）是危害中国小麦生产的主要害虫之一，据统计，造成了很大的经济损失。近年来，其危害日趋严重2。目前，
12、由于小麦和蔬菜抗蚜虫种质资源缺乏，抗性机制尚不明确，常规育种难以奏效，蚜虫防治以喷洒农药为主，但大量使用农药，不仅对人畜有害，而且造成了严重的环境污染，迫切需要挖掘和鉴定新型抗蚜基因并通过基因工程育种提高小麦和蔬菜抗蚜特性。【前人研究进展】植物介导的RNAi 技术已成为农作物抗虫基因工程的热点之一，通过寄主植物表达相应昆虫特异基因的dsRNA，昆虫取食植物后沉默其相应的基因从而达到控制害虫危害的目的。，。细胞色素P450 是一类广泛存在于许多生物中的血红素铁结合蛋白的超基因家族，在多种类型的生化反应、代谢有毒物质和提高昆虫对寄主的适应性方面都发挥着重要的作用12。已经克隆到的昆虫P450 超过
13、了1 000 个13。研究表明，棉铃虫肠道中特异P450 可提高棉铃虫幼虫对棉花次生代谢物质和棉酚的耐受性，利用表达棉铃虫P450 dsRNA的转基因烟草和棉花叶片饲喂棉铃虫幼虫，可导致幼虫体内P450 的表达量下降、发育受阻，表现出抗棉铃虫性能8-9。【本研究切入点】当前，利用RNAi 技术沉默麦长管蚜和桃蚜体内细胞色素P450及通过植物介导的RNAi 技术提高小麦和蔬菜抗蚜性能的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】本研究利用体外合成的麦长管蚜和桃蚜的细胞色素P450保守序列dsRNA 结合人工饲料饲喂麦长管蚜和桃蚜，观察dsRNA 饲喂浓度和时间对蚜虫的生长发育和死亡率影响，通过RT-PCR
14、 分析取食后蚜虫细胞色素P450 表达水平的变化情况，为利用RNAi 技术创制抗蚜虫小麦和蔬菜提供依据。利用利用RNAiRNAi技术沉默麦长管蚜与桃蚜细胞色素技术沉默麦长管蚜与桃蚜细胞色素P450P450 在过去的20年里，人们对于高等植物花发育调控分子机制的认识有了长足进展，这得益于在拟南芥等双子叶模式植物中的广泛深入研究。拟南芥，然而，由于禾本科植物本身有着一些独特的花或花序结构，人们对这些物种的花发育调控仍然了解得不够深入。小穗是一个典型的禾本科植物特有的花序结构，前人的研究。这些研究让人们意识到水稻等禾本科植物的小穗发育调控不同于拟南芥等双子叶植物，然而目前鉴定的相关基因还太少，一个重
15、要的原因是相关突变体缺乏。本研究报道一个与水稻小穗发育相关的突变体，主要表现,定位，为该基因的图位克隆和功能分析奠定了基础。水稻多小花小穗突变体水稻多小花小穗突变体mf1的鉴定与基因定位的鉴定与基因定位u 没有明确的研究意义 水稻花器官发育的基因调控已成为近年来的研究热点。作为单子叶的代表植物和禾本科的模式作物，水稻花器官发育基因调控的研究对于阐明单子叶植物（特别是禾本科作物）的花器官发育模式有非常重要的意义。同时，水稻产量和品质的形成受到花器官发育的直接影响，研究其基因调控机制将有助于水稻分子育种的发展。低磷胁迫水稻根部基因表达谱研究 磷是植物体内一系列重要物质的组成成分,核酸、蛋白质、磷脂
16、、植酸、ATP 和含磷酶等都离不开磷的存在.磷矿是一种不可再生的自然资源,据估计按目前的开采速度,6090 年以后,世界上的磷矿资源将会枯竭.植物体在低磷胁迫下,根构型会发生改变25,有机酸分泌增加6,7,同时一些基因,如磷酸盐转运蛋白810、酸性磷酸酶11,12、RNA 酶13,14等的基因的表达表达都加强.低磷胁迫还会诱导体内代谢副通路的形成15,16.真核生物酵母中磷调节元件可以调节一系列低磷反应基因的表达17,18.在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中一个对低磷信号传导起重要作用的PHR1基因,属于MYB 类转录因子,它能够控制下游几个低磷反应基因的表达19.PHO3,
17、PSR1,PDR2 等基因在低磷信号传导过程中也发挥着重要作用,因为这些基因的突变都能不同程度地损害磷酸盐饥饿信号的传导2022.在高等植物中,植物体如何传导低磷信号以及植物体适应低磷的具体调节机制,目前尚不十分清楚.随着功能基因组学研究的不断深入,基因表达谱研究在植物抗病23、非生物胁迫24,25、低氮营养26,27、低磷营养2831等方面取得了一定的进展.本研究所用水稻(Oryza sativa)寡核苷酸芯片由北京华大基因研究中心提供.该芯片BGI-Rice-Chip30K 由6 万个基因特异的寡核苷酸片段(70 mer)点在两张玻片上.本实验研究了水稻根部在低磷胁迫和正常营养条件下表达谱
18、的差异,希望能够更进一步揭示水稻适应低磷环境的生物学机制.切入点？内容：使用的材料、采用的方法、研究的过程 目的：评价论文结果的可信性和可靠性给同行提供方法上的借鉴 要求：只描述，不解释简练且详细 材料：材料的基本情况及需要说明的情况 基本情况：名称、来源等 需要说明的情况：选取标准、数量、培养条件、分组情况等 实验用试剂等：名称、厂商、规格等 实验仪器和设备：名称、厂商、型号、规格等 非标准试剂、自配试剂、自制设备等，需详细描述至别人能重复 方法：实验方法：使用众所周知的方法，仅指出方法名称和参考文献。如对原法做了修改，只写出方法名称和修改部分，并解释为什么进行了修改；对作者自行设计和创造的
19、新方法应详细描述。分组设计及对照设置：说明具体分组方法、设计方法及设置何种对照，每组数量等。观测指标：包括指标名称，测试方法和使用的仪器等。数据处理和统计方法 水稻多小花小穗突变体mf1的鉴定与基因定位1 1 材料与方法材料与方法1.1 1.1 材料材料 mf1是一个天然的水稻花器官突变体,来源于杂交育种中间材料,经多代自交,遗传稳定。将mf1与12个恢复系杂交,F1和F2用于遗传分析。以IR24mf1的F2群体为初步定位群体,以IR24mf1的F3代分离群体为精细定位群体。1.2 1.2 形态和组织学分析形态和组织学分析 选取抽穗期的突变体和野生型小穗,在尼康SM1500体视镜下观察照像分析
20、。参照Xiao等的方法13,选取抽穗期的野生型和突变体小穗于FAA(50%无水乙醇,0.9 mol L-1的冰乙酸和3.7%甲醛)中4固定16 h以上,经乙醇梯度脱水和二甲苯透明后用石蜡包埋。切片厚度为10 m,经1%番红和1%快绿对染后于尼康E600光学显微镜下观察照像分析。1.3 1.3 基因定位基因定位 采用BSA法定位目标基因14，即根据F2植株表型，分别选取10株正常单株和10株突变单株，剪取等量叶片，构成正常基因池和突变基因池。按CTAB法提取亲本和基因池DNA15，按碱煮法提取群体DNA 16。SSR引物序列参照http:/www.gramene.org/microsat/，由上
21、海生工生物技术公司合成。PCR总体系为25 L，含2.5 L 10PCR buffer、1.3 L 25 mmol L-1 MgC12、1.0 L 2.5 mmol L-1 dNTPs、16.0 L ddH2O、2.0 L 10 mol L-1引物、2.0 L模板DNA、0.2 L 5U L-1 Taq酶。PCR程序为，94 预变性5 min；94 变性30 s，55 退火30 s，72 复性1 min，35个循环；72 延伸10 min。PCR产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,快速银染后观察16-17。1.4 图谱构建图谱构建 将具有mf1突变亲本带型的单株记为B，具有正常亲本IR24带
22、型的单株记为A，具有杂合带型的单株记为H，用软件MMQTX18计算遗传距离并构建遗传图谱。根据gramene网站提供的水稻序列信息构建物理图谱。材料材料 植物材料：mf1突变体、12个恢复系、mf1突变体与恢复系杂交的F1和F2 仪器：尼康SM1500体视镜、尼康E600光学显微镜 切片机、PCR仪、电泳仪等 试剂：无水乙醇、冰乙酸和、甲醛、二甲苯、番红、快绿、PCR试剂 DNA提取、电泳等相关试剂方法方法 实验：石蜡切片、DNA提取、PCR、电泳 观察指标：形态学和组织学的观察（体视镜、光镜）F2群体分离情况 SSR分析的带型 统计：遗传分析、软件MMQTX18计算遗传距离L-L-茶氨酸通过
23、乙酰胆碱受体多巴胺奖赏通路抑制尼古丁依赖1.1 1.1 试剂 改进的Dulbecco Eagles(DMEM)高糖培养基购自GIBCO(Grand Island,NY,USA);胎牛血清(FBS)购自Hyclone(logan,UT,USA);2-NBDG 购自Invitrogen Co.(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA);胰酶,青霉素,链霉素,EDTA(ethylenediaminotetraaceticacid),-羟基刺桐定溴酸盐(DHE)等购自Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO,USA);L-茶氨酸由杭州禾田生物技术有限公司馈赠,纯度为9
24、8.11%(HPLC分析);尼古丁由郑州烟草研究院提供;乙酰胆碱受体AChR4(sc-74519),AChR2(sc-11372),AChR7(sc-11372),TH(sc-25269),c-FOS(sc-52)和Actin(sc-1616-R)抗体购自Santa Cruz Biotechnology(SantaCruz,CA,USA);Vectastain ABC 和DAB 试剂盒购自VECTOR Corporation(Brulingame,USA).其余化学试剂均为国产分析纯.L-L-茶氨酸通过乙酰胆碱受体多巴胺奖赏通路抑制尼古丁依赖1.2 1.2 实验动物和处理 68 周雌性C57B
25、L/6J 小鼠购自中国医学科学院实验动物中心,饲养于无特定病原体级SPF(specificpathogen free)环境中,自由取食.尼古丁、L-茶氨酸、尼古丁受体抑制剂DHE溶于生理盐水,采用皮下注射方式给药;小鼠按以下方式分组,每组10 只.对照组:小鼠皮下注射生理盐水;尼古丁组:皮下注射尼古丁(0.5 mg/kg/天);Th-L,L-茶氨酸低剂量组:小鼠皮下注射L-茶氨酸(250 mg/kg/天);Th-H,L-茶氨酸高剂量组:小鼠皮下注射L-茶氨酸(500 mg/kg/天);Th-L(N),尼古丁和L-茶氨酸低剂量组:小鼠皮下注射L-茶氨酸(250 mg/kg/天)15 min 后皮
26、下注射尼古丁(0.5 mg/kg/天);Th-H(N),尼古丁和L-茶氨酸高剂量组:小鼠皮下注射L-茶氨酸(500 mg/kg/天)15 min 后皮下注射尼古丁(0.5 mg/kg/天);DHE(N),尼古丁和抑制剂组:小鼠皮下注射抑制剂(2.0 mg/kg/天)15 min后皮下注射尼古丁(0.5 mg/kg/天)17.动物每日注射尼古丁(0.5 mg/kg/天)或生理盐水连续不同时间.拟南芥F-box基因FOA1参与ABA信号转导1.3 ABA 1.3 ABA 和NaCl NaCl 处理、种子萌发及根长分析 将拟南芥种子用75%酒精浸泡30 s,然后用10%NaClO 浸泡10 min,
27、无菌水清洗46 次后,置于4黑暗环境春化4 天,分别用于ABA 和NaCl 处理、种子萌发及根长分析.(1)ABA和NaCl 处理.用0.1%的琼脂糖悬浮种子,均匀点播于MS 固体培养基(含0.8%琼脂)上,转移至温度为2223,光强为50 mol s1 m2 的全日照培养箱.14 天后,将野生型Col-0 幼苗的根泡在含ABA(10 mol/L)或NaCl(100 mmol/L)的MS液体培养基中分别处理0,1,2,4,6 和8 h,用于分析外源ABA和NaCl 对FOA1 基因表达的调节;此外,将野生型Col-0 和foa1 突变体幼苗同时用含ABA(100 mol/L)的液体培养基处理0
28、 和6 h,用于比较分析ABA 及胁迫应答基因在野生型和foa1 突变体中的表达变化情况.处理材料收集后放入液氮速冻,80保存用于RNA 提取和基因表达分析.(2)种子萌发分析.用0.1%的琼脂糖悬浮种子,均匀点播于含不同浓度ABA(0,0.3,0.6mol/L)的MS固体培养基(含0.8%琼脂)表面,转移至培养室.于第5 天统计种子萌发率.结果取3 次独立实验的平均值标准误差,每次实验约统计100 粒种子的萌发率.(3)根长分析.用0.1%的琼脂糖悬浮种子,均匀点播于MS 固体培养基上,在培养箱培养3 天后,将幼苗移植到含不同浓度ABA(0,5,10 mol/L)的MS固体培养基(含0.8%
29、琼脂)表面,继续培养6 天后,测其根长.结果取3 次独立实验的平均值标准误差,每处理统计20 棵幼苗根的长度.1.4 1.4 气孔观察与气孔开度的测定气孔观察与气孔开度的测定 参照Pei 等人的研究方法24,取生长在同一条件下45 周龄大的野生型、缺失突变体、过量表达植株的莲座叶,在气孔开放缓冲液中(10 mmol/L KCl,7.5mmol/L 亚氨二醋酸,10 mmol/L 乙磺酸,10 mmol/LTris-HCl,pH 6.2)浸泡10 h 使气孔充分开放,然后加入不同浓度(0,1 和10 mol/L)ABA 继续浸泡2 h,在倒置显微镜(NICON TE2000)下测定叶片下表皮气孔
30、纵横径,并拍照.每个处理重复3 次.1.5 1.5 蒸腾失水速率的测定蒸腾失水速率的测定 参照Shan 等人25的方法,取约3 周龄大的野生型、缺失突变体、过量表达植株的莲座叶各4 片称取其初重,放在室温25、60%湿度的环境下干燥,每隔30 min 称重1 次,统计数据后计算蒸腾失水率.每个材料重复3 次.详细描述自创方法多种处理的描述低磷胁迫水稻根部基因表达谱研究1.1 1.1 实验材料 以水稻品种中早18(indica)为材料.中早18 种子浸种、催芽后,转入营养液水培,营养液中各营养元素含量分别为:1.44 mmol/L NH4NO3,0.3 mmol/LNaH2PO4,0.5 mmo
31、l/L K2SO4,1.0 mmol/L CaCl2,1.6mmol/L MgSO4,0.17 mmol/L NaSiO3,50 mol/L Fe-EDTA,0.06 mol/L(NH4)6Mo7O24,15 mol/L H3BO3,8 mol/L MnCl2,0.12 mol/L CuSO4,0.12 mol/L ZnSO4,29 mol/L FeCl3,40.5 mol/L Citric acid,pH 5.5.3 天换一次营养液.水培至四叶一心 时进行低磷胁迫处理(低磷营养液中磷的浓度为上述 营养液浓度的1/30,其他成分不变),对照材料营养液不变.设置3 次生物学重复,即种植3 批材料
32、,每批材料种植时间间隔5 天。自制试剂低磷胁迫水稻根部基因表达谱研究1.3 microarray 荧光探针的标记、杂交、洗脱和扫描 中早18 处理和对照材料mRNA 各取2.0 g 作为模板,在400 U Superscript反转录酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)催化下加入6.0 g Oligo dT(18)(Takara,Japan),40 L 反应体系中包含10 mmol/L DTT,40 U RNase 抑制剂(Promega,Madison,Wisconsin,USA),dATP,dCTP 和dGTP 各500 mol/L,dTTP 和aa-dUTP各200 mol
33、/L(Sigma,St.Louis,Missouri,USA)以及1第一链合成缓冲液.在42反应3 h 合成cDNA 第一链,随后94变性3 min 终止反应,加入RNaseH(Promega,Madison,WI),然后37反应15 min 去除mRNA,酚/氯仿抽提反应混合物,YM-30 柱(Millipore,USA)纯化产物.缩写：cDNA合成体系40 L，包含2.0 g mRNA，.。42反应3 h，94 3 min 终止反应，加入RNaseH(Promega,Madison,WI),37反应15 min 后酚/氯仿抽提，产物过柱(YM-30,Millipore,USA)纯化。注意注
34、意1 1、繁琐、繁琐 水稻多小花小穗突变体mf1的鉴定与基因定位1.3 1.3 基因定位 采用BSA法定位目标基因14,即根据F2植株表型,分别选取10株正常单株和10株突变单株,剪取等量叶片,构成正常基因池和突变基因池。按CTAB法提取亲本和基因池DNA15,按碱煮法提取群体DNA16。SSR引物序列参照http:/www.gramene.org/microsat/,由上海生工生物技术公司合成。PCR总体系为25 L,含2.5 L 10PCR buffer、1.3 L 25 mmol L-1 MgC12、1.0 L 2.5 mmol L-1 dNTPs、16.0 L ddH2O、2.0 L
35、10 mol L-1引物、2.0 L模板DNA、0.2 L 5 U L-1 Taq酶。PCR程序为,94预变性5 min;94 变性30 s,55退火30 s,72复性1 min,35个循环;72延伸10 min。PCR产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,快速银染后观察16-17。1.41.4 图谱构建 将具有mf1突变亲本带型的单株记为B,具有正常亲本IR24带型的单株记为A,具有杂合带型的单株记为H,用软件MMQTX18计算遗传距离并构建遗传图谱。根据gramene网站提供的水稻序列信息构建物理图谱。筛选亲本及基因池间表现多态性的SSR标记，经单株验证表现与突变性状连锁后用于分析F2群体
36、中的所有突变单株，连锁标记与突变位点之间的注意注意2 2、过于简化、过于简化 水稻多小花小穗突变体mf1的鉴定与基因定位1.3 DNA的提取与SSR分析 按CTAB法提取亲本和基因池DNA15,按碱煮法提取群体DNA16。SSR引物序列参照http:/www.gramene.org/microsat/,由上海生工生物技术公司合成。PCR总体系为25 L,含2.5 L 10PCR buffer、1.3 L 25 mmol L-1 MgC12、1.0 L 2.5 mmol L-1 dNTPs、16.0 L ddH2O、2.0 L 10 mol L-1引物、2.0 L模板DNA、0.2 L 5 U
37、L-1 Taq酶。PCR程序为,94预变性5 min;94 变性30 s,55退火30 s,72复性1 min,35个循环;72延伸10 min。PCR产物经10%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,快速银染后观察16-17。1.4 基因定位与图谱构建 采用BSA法定位目标基因14,即根据F2植株表型,分别选取10株正常单株和10株突变单株,剪取等量叶片,构成正常基因池和突变基因池。筛选亲本及基因池间表现多态性的SSR标记，经单株验证表现与突变性状连锁后用于分析F2群体中的所有突变单株，将具有mf1突变亲本带型的单株记为B,具有正常亲本IR24带型的单株记为A,具有杂合带型的单株记为H,用软件MMQTX
38、18计算连锁标记与突变位点之间的遗传距离并构建遗传图谱。根据gramene网站提供的水稻序列信息构建物理图谱。注意注意3 3、分段不合理、分段不合理低磷胁迫水稻根部基因表达谱研究1.1 1.1 实验材料 以水稻品种中早18(indica)为材料.中早18 种子浸种、催芽后,转入营养液水培,营养液中各营养元素含量分别为:1.44 mmol/L NH4NO3,0.3 mmol/LNaH2PO4,0.5 mmol/L K2SO4,1.0 mmol/L CaCl2,1.6mmol/L MgSO4,0.17 mmol/L NaSiO3,50 mol/L Fe-EDTA,0.06 mol/L(NH4)6M
39、o7O24,15 mol/L H3BO3,8 mol/L MnCl2,0.12 mol/L CuSO4,0.12 mol/L ZnSO4,29 mol/L FeCl3,40.5 mol/L Citric acid,pH 5.532.3 天换一次营养液.水培至四叶一心 时进行低磷胁迫处理(低磷营养液中磷的浓度为上述 营养液浓度的1/30,其他成分不变),对照材料营养液不变.设置3 次生物学重复,即种植3 批材料,每批材料种植时间间隔5 天.1.2 样品采集和RNA 分离 分别在低磷胁迫6,24,72 h 对水稻中早18 低磷胁迫处理和对照材料根部取样.样品置于70冰箱中保存.水稻中早18 根在液
40、氮中研磨后,利用Trizol试剂(GIBCOL/BRL)抽提总RNA(http:/).利用Oligo dT(25)magetic Dynal beads 从总RNA 中分离mRNA(http:/)(Oslo,Norway).处理和对照材料的总RNA 抽提、mRNA 分离同步进行.处理与对照设置样品采集注意注意3 3、分段不合理、分段不合理低磷胁迫水稻根部基因表达谱研究1.1 1.1 实验材料 以水稻品种中早18(indica)为材料.中早18 种子浸种、催芽后,转入营养液水培,营养液中各营养元素含量分别为:1.44 mmol/L NH4NO3,0.3 mmol/LNaH2PO4,0.5 mmo
41、l/L K2SO4,1.0 mmol/L CaCl2,1.6mmol/L MgSO4,0.17 mmol/L NaSiO3,50 mol/L Fe-EDTA,0.06 mol/L(NH4)6Mo7O24,15 mol/L H3BO3,8 mol/L MnCl2,0.12 mol/L CuSO4,0.12 mol/L ZnSO4,29 mol/L FeCl3,40.5 mol/L Citric acid,pH 5.532.3 天换一次营养液.水培至四叶一心时进行低磷胁迫处理(低磷营养液中磷的浓度为上述 营养液浓度的1/30,其他成分不变),对照材料营养液不变.设置3 次生物学重复,即种植3 批材
42、料,每批材料种植时间间隔5 天.分别在低磷胁迫6,24,72 h 对处理和对照材料根部取样置于70冰箱中保存.1.2 RNA 1.2 RNA 分离分离 水稻根经液氮研磨后利用Trizol试剂(GIBCOL/BRL)抽提总RNA(http:/)，利用Oligo dT(25)magetic Dynal beads 从总RNA 中分离mRNA(http:/)(Oslo,Norway).注意注意3 3、分段不合理、分段不合理u 描写发生了什么。u 以文字、表格、图片、动画、视频来等表达与论文有关的实验数据、观察结果。结果书写要求：要简明扼要要具体清晰要注意逻辑顺序表格、图片要有自明性，要避免与文字的重
43、复研究者的评论、评价、分析和推理要适当不要夹杂以前和他人的工作不要使用原始实验数据 结果书写要求：要简明扼要2.2 mf1突变体的遗传分析 在抽穗期,调查mf1和12个恢复系及其杂交组合的F1和F2群体的表型,发现所有组合的F1植株都表现正常,而在所有组合的F2 群体中,野生型和突变型出现31分离(表1),表明mf1突变性状受控于隐性单基因。2.3 rl12(t)的遗传分析 用卷叶突变体rl12(t)为父本与平展叶西农1A杂交,F1植株叶片性状与rl12(t)表现相同,老叶片全部卷曲,新叶不卷,其余叶片中上部约1/3位卷曲、中下部2/3不卷曲,说明该突变体由显性基因控制。F2代群体中出现了明显
44、分离,分别表现双亲性状,没有中间类型的卷叶植株出现。其中卷曲单株2 204株,正常单株704株,经2测验,卷叶 正常叶完全符合3 1分离比(2=0.92853.842(0.05,1),由此表明该卷叶突变体受一对完全显性基因控制。结果书写要求：要清晰具体能量化的结果一定要量化，少用不确定的词语对于一些形象化的结果，要转化成具体的文字 野生型水稻的小穗从基部到顶部依次由一对副护颖(退化的苞片)、一对护颖(退化的侧生小花,仅有不育外稃)和一个正常的顶生小花构成(图1-A,B和C)。顶生小花包括4轮花器官,第1轮是锁在一起的外稃和内稃,外稃具5条维管束儿而内稃只有3条;第2轮是两枚浆片着生在靠近外稃的
45、一侧;第3轮是6枚雄蕊,第4轮是1枚雌蕊位于小花的中心,雄蕊着生在其周围。野生型水稻小穗由一对副护颖、一对护颖、一对内外稃、两枚浆片、6枚雄蕊和1枚雌蕊组成(图1-A,B和C)。结果书写要求：要注意逻辑顺序 逻辑顺序：即按照事物或事理的内部联系及人们认识事物的过程来安排说明顺序。事物的内部联系包括因果关系、层递关系、主次关系、总分关系、并列关系等；认识事物或事理的过程则指由浅入深、有外到内、由现象到机理、由具体到抽象等等。水稻多小花小穗突变体mf1的鉴定与基因定位2 结果与分析2.1 mf1突变体的形态和组织学分析2.2 mf1突变体的遗传分析2.3 MF1基因的精细定位层递关系有外到内、由具
46、体到抽象利用RNAi技术沉默麦长管蚜与桃蚜细胞色素P4502 结果与分析 2.1 细胞色素P450与GFP的克隆 2.2 麦长管蚜与桃蚜细胞色素P450的序列比对 2.3 细胞色素P450 dsRNA饲喂对于麦长管蚜与桃蚜发育的影响 2.4 实时荧光定量PCR检测dsRNA饲喂后蚜虫体内P450表达分析层递关系由现象到机理因果关系拟南芥F-box基因FOA1参与ABA信号转导2 结果与分析2.1 FOA1 基因的组织器官表达模式分析2.2 外源ABA 和NaCl 诱导FOA1 基因的表达2.3 T-DNA 插入突变体及FOA1 过量表达植株分子鉴定2.4 FOA1 参与ABA 对种子萌发和根伸
47、长的抑制2.5 FOA1参与ABA调节气孔关闭和蒸腾失水速率2.6 FOA1 参与ABA 影响植物体内脯氨酸的积累2.7 FOA1 调节ABA 及胁迫应答基因的表达层递关系由浅入深、有外到内、由现象到机理、由早到晚 结果书写要求：表格、图片要有自明性，文字要避免与其重复恢复系Restorer602Che64Yh559J98Jh10Z11野生型WT plant304217425243418287突变型Mutant118641307813494卡方值(20.05=3.84)1.820.630.650.050.120.00恢复系RestorerR2727Z4R274R352Lh17IR24野生型WT
48、 plant40632668151141162突变型Mutant14510328474251卡方值(20.05=3.84)0.440.170.680.110.310.08表1 mf1和12恢复系及其杂交组合F2群体的表型分离调查1.2 mf1突变体的遗传分析 在抽穗期,调查mf1和12个恢复系及其杂交组合的F1和F2群体的表型,发现所有组合的F1植株都表现正常,而在所有组合的F2 群体中,野生型和突变型出现31分离(表1),表明mf1突变性状受控于隐性单基因。材料MaterialWTdh2株高Plant height(cm)115.3115.1每穗粒数Grain number per pani
49、cle176.5179.5每穗实粒数Filled grain number per panicle143.884.5*结实率Seed setting rate(%)81.4747.06*千粒重1000-grain weight(g)26.5414.32*2.3 2.3 农艺性状调查农艺性状调查 农艺性状调发现，和野生型相比，dh2突变体在株高和每穗粒数上面没有显著的变化，但是其每穗实粒数极显著降低，相较于野生型的81.47%的结实率，突变体仅为47.06%。另外，dh2突变体的千粒重也呈现极显著降低，仅为野生型的53.96%（表2）。表表2 野生型野生型(WT)和和dh2突变体的农艺性状分析突
50、变体的农艺性状分析Table 2 Agronomic characters of the wild type(WT)and dh2 mutant和野生型相比，dh2突变体在株高和每穗粒数上面没有显著的变化，但是其每穗实粒数、结实率和千粒重都呈现极显著降低，分别为野生型的58.76%、57.76%和53.96%（表2）。图1 mf1突变体及其野生型的形态和组织学分析A:抽穗期的野生型小穗;B:图A中的小穗去掉内外稃后的形态;C:野生型小穗的横切面;D:典型的包含两朵小花的mf1小穗;E:图D中的小穗去除外稃后的形态;F:典型的的mf1小穗的横切面。图F中红色虚线框内为1朵小花,图B、C、E和F中
