1、大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响主讲：房向东主讲：房向东The effect of Emodin on the human renal tubular epithelial to mesenchymal transition induced by albumin大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响1研究背景研究背景1技术路线与方法技术路线与方法2结结 果果3讨讨 论论4结结 论论5概概 要要大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响2 蛋白尿不仅仅是肾脏损伤的生物学标志，蛋白尿不仅仅是肾脏损伤的生物学标志，还是加速肾脏疾病向终末期肾衰进展的主还是加速肾脏疾病向终末期
2、肾衰进展的主要危险因素之一。要危险因素之一。研究背景研究背景大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响3肾脏损伤肾脏损伤蛋白尿蛋白尿临床表现临床表现反作用反作用物理损伤物理损伤诱导化学趋化因子、炎症因子诱导化学趋化因子、炎症因子激活补体激活补体促进细胞凋亡促进细胞凋亡损伤及加速损伤及加速纤维化机制纤维化机制大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响41、正常肾单位的丢、正常肾单位的丢失和肾结构的破坏失和肾结构的破坏 2、成纤维细胞及肌成、成纤维细胞及肌成纤维细胞的大量增生纤维细胞的大量增生 3、细胞外基质的产生、细胞外基质的产生和积聚和积聚 病理变化病理变化 肾脏纤维化肾脏纤维化研究背
3、景研究背景大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响5肾间肾间质纤质纤维化维化肾小肾小球硬球硬化化肾脏纤维化肾脏纤维化肾间质纤维化是关键！肾间质纤维化是关键！间质纤维化的程度更能预测间质纤维化的程度更能预测肾功能的变化！肾功能的变化！研究背景研究背景大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响6 肾小管上皮细胞肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化（肌成纤维细胞转分化（TEMT）在肾间质纤维化的发生发展中有着重要的作用，它被定义为肾小管上皮细胞丢失了上皮表型，而获得肾小管上皮细胞丢失了上皮表型，而获得新的肌成纤维细胞特征的过程新的肌成纤维细胞特征的过程。研究背景研究背景转分化转分化ECMEC
4、MECM上皮细胞肌成纤维细胞大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响7化学名：3-甲基-1，3，8-三羟基蒽醌大黄素大黄素传统的生物学传统的生物学作用：抗菌消作用：抗菌消炎、抗肿瘤、炎、抗肿瘤、免疫抑制、保免疫抑制、保肝、肝、护肾护肾 研究背景研究背景保护肾脏作用：保护肾脏作用：清除氧自由基及清除氧自由基及炎症因子、抗细炎症因子、抗细胞增殖、促细胞胞增殖、促细胞外基质降解、阻外基质降解、阻滞滞TEMT大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响8 体内外研究发现大黄素可延缓糖尿病肾病、梗阻性肾病等肾脏纤维化发生，其中阻滞TEMT过程发挥重要地位。研究背景研究背景大黄素对白蛋白诱导人肾小
5、管上皮细胞转分化的影响9研究目的研究目的白蛋白能否诱导白蛋白能否诱导HK-2细胞转发生转分化过程细胞转发生转分化过程、促进细胞外基质合成、促进细胞外基质合成 大黄素对白蛋白产生的上述过程是否产生影响大黄素对白蛋白产生的上述过程是否产生影响?大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响10技术路线与分组技术路线与分组空白对照组空白对照组 大黄素对照组大黄素对照组大黄素干预组大黄素干预组白蛋白诱导组白蛋白诱导组HK-2细胞细胞无处理因素 20g/ml大黄大黄素作用素作用0、12、24、48h5mg/ml白蛋白白蛋白刺激时同时加入刺激时同时加入20g/ml大黄素作用大黄素作用0、12、24、48h
6、观察各组细胞形态学变化，收集细胞总观察各组细胞形态学变化，收集细胞总RNA半定量检测半定量检测-SMA、E-cadherin、FNmRNA的表达的表达5mg/ml白蛋白蛋白作用白作用0、12、24、48h大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响11 各组各组实验重复实验重复3 3次，所有数据以次，所有数据以x xs s表示，行表示，行方差齐性检验方差齐性检验，多组间计量资料采用单因素，多组间计量资料采用单因素方差分析方差分析 用用SPSS12.0SPSS12.0软件对数据进行处理软件对数据进行处理 以以P P0.050.05为有显著性差异为有显著性差异,P,P0.010.01有非常有非常
7、显著性差异显著性差异大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响12 RT-PCRRT-PCR正常正常HK-2细胞仅表达少量的细胞仅表达少量的-SMA、FNmRNA，而而E-cadherinmRNA的表达较强。的表达较强。E-cadherin-SMA FNM 0 12 24 48h 大黄素对照组上述因子的表达与正常对照组无差异结结 果果大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响13白蛋白诱导白蛋白诱导HK-2细胞表型转化及大黄素干预后的效果细胞表型转化及大黄素干预后的效果 白蛋白可诱导白蛋白可诱导HK-2细胞发生表型转化，即细胞发生表型转化，即E-CadherinmRNA的表达下调，的表
8、达下调，-SMAmRNA的表达上调，与的表达上调，与0h比较，比较，12h后即有差异，后即有差异，48h后差异显著，后差异显著，p0.01。而同时加入。而同时加入20g/ml大黄素作用后，其变化趋势明显减弱。大黄素作用后，其变化趋势明显减弱。-SMA 白蛋白诱导白蛋白诱导大黄素干预大黄素干预M 0 12 24 48h 结结 果果大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响14白蛋白诱导白蛋白诱导HK-2细胞表型转化及大黄素干预后的效果细胞表型转化及大黄素干预后的效果 E-cadherin 大黄素干预大黄素干预白蛋白诱导白蛋白诱导M 0 12 24 48h M 0 12 24 48h 大黄素对
9、白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响15白蛋白诱导白蛋白诱导HK-2细胞分泌纤维连接蛋白（细胞分泌纤维连接蛋白（FN）的情况及）的情况及大黄素干预后的效果大黄素干预后的效果FN的表达随白蛋白刺激时间延长而逐渐增多，在大黄素干预的表达随白蛋白刺激时间延长而逐渐增多，在大黄素干预后其表达上调趋势亦明显减缓。后其表达上调趋势亦明显减缓。FN白蛋白诱导白蛋白诱导大黄素干预大黄素干预M 0 12 24 48h 大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响16 讨讨 论论蛋白尿与肾小管间质损伤蛋白尿与肾小管间质损伤 蛋白尿的水平反映了肾小球损伤的程度蛋白尿的水平反映了肾小球损伤的程度 MDRDMDRD
10、试验试验 把蛋白尿基础排出量作为独立的危险因素纳入把蛋白尿基础排出量作为独立的危险因素纳入加速慢性肾脏病进展的研究加速慢性肾脏病进展的研究 临床研究发现临床研究发现CKDCKD患者在应用患者在应用 ACEIACEI、ARBARB类药物可非依赖降类药物可非依赖降压作用减少尿蛋白量的排泄而延缓慢性肾脏病恶化速度压作用减少尿蛋白量的排泄而延缓慢性肾脏病恶化速度 降尿蛋白和延缓降尿蛋白和延缓GFRGFR下降之间有着紧密的联系，蛋白尿的程下降之间有着紧密的联系，蛋白尿的程度对度对CKDCKD预后具有很强的预测价值预后具有很强的预测价值 。大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响17讨讨 论论蛋白尿
11、与肾小管间质损伤蛋白尿与肾小管间质损伤 我们的实验结果发现，我们的实验结果发现，5mg/ml5mg/ml人纯化白蛋白刺激人纯化白蛋白刺激HK-2HK-2细胞一段时间内后，上皮细胞表型标志物细胞一段时间内后，上皮细胞表型标志物E-E-cadherinmRNAcadherinmRNA表达下调，肌成纤维细胞表型物表达下调，肌成纤维细胞表型物-SMAmRNASMAmRNA表达上调，且随白蛋白作用时间的延长表表达上调，且随白蛋白作用时间的延长表达水平逐渐增强。达水平逐渐增强。结果表明结果表明HK-2HK-2细胞发生表型转变，介导了肾小管细胞发生表型转变，介导了肾小管间质纤维化的发生。间质纤维化的发生。大
12、黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响18讨讨 论论TEMT与肾小管间质纤维化与肾小管间质纤维化 TEMTTEMT在肾间质纤维化的发生发展过程中发挥重要作在肾间质纤维化的发生发展过程中发挥重要作用用 TEMTTEMT过程包括：肾小管上皮细胞的黏附属性缺失过程包括：肾小管上皮细胞的黏附属性缺失(E-(E-钙粘蛋白减少钙粘蛋白减少)，肾小管基底膜的破坏，表达，肾小管基底膜的破坏，表达-SMA-SMA的肌成纤维细胞增多及其向间质迁移最终导的肌成纤维细胞增多及其向间质迁移最终导致间质纤维化。致间质纤维化。大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响19 肾间质纤维化的另一决定因素是肾间质纤维化
13、的另一决定因素是ECMECM合成与降解平合成与降解平衡的调节衡的调节 肌成纤维细胞分泌肌成纤维细胞分泌FNFN参与参与ECMECM构成。构成。本研究选择本研究选择FNFN作为观察作为观察ECMECM聚积的评价指标聚积的评价指标TEMT与肾小管间质纤维化与肾小管间质纤维化讨讨 论论大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响20 我们实验结果发现正常肾小管上皮细胞因未发生我们实验结果发现正常肾小管上皮细胞因未发生明显转分化，其明显转分化，其FNmRNAFNmRNA的分泌甚微，的分泌甚微，而而5mg/ml5mg/ml人白蛋白诱导人白蛋白诱导HK-2HK-2细胞转分化的发生同细胞转分化的发生同时，
14、检测到时，检测到FNmRNAFNmRNA表达呈现时间依赖性增强，进表达呈现时间依赖性增强，进一步参与肾间质纤维化的形成。一步参与肾间质纤维化的形成。TEMT与肾小管间质纤维化与肾小管间质纤维化讨讨 论论大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响21 讨讨 论论大黄素阻滞大黄素阻滞TEMT在肾间质在肾间质 纤维化中的作用纤维化中的作用 实验中，我们通过使用实验中，我们通过使用20g/ml20g/ml大黄素与白蛋白共大黄素与白蛋白共同作用同作用HK-2HK-2细胞制造干预模型。细胞制造干预模型。实验结果发现，经大黄素干预后实验结果发现，经大黄素干预后HK-2HK-2细胞后其细胞后其E-E-ca
15、dherinmRNAcadherinmRNA的表达亦有渐降趋势，的表达亦有渐降趋势，-SMA mRNA-SMA mRNA表达上升，但在表达上升，但在48h48h内其下降内其下降/上升趋势呈明显减缓上升趋势呈明显减缓，较白蛋白诱导组有明显差异。，较白蛋白诱导组有明显差异。大黄素部分阻滞了大黄素部分阻滞了HK-2HK-2细胞的细胞的TEMTTEMT过程。过程。大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响22 讨讨 论论大黄素阻滞大黄素阻滞TEMT在肾间质在肾间质 纤维化中的作用纤维化中的作用 而通过对而通过对FNmRNAFNmRNA表达情况的检测发现：经大黄素干表达情况的检测发现：经大黄素干预后
16、，预后，FNmRNAFNmRNA表达亦受到部分抑制。表达亦受到部分抑制。原因可能为：原因可能为：1 1、大黄素阻滞了、大黄素阻滞了HK-2HK-2细胞的转分化细胞的转分化发生，使得发生，使得MyofMyof细胞生成减少，进而减少了细胞生成减少，进而减少了FNFN的表的表达和分泌来源；达和分泌来源；2 2、大黄素可抑制、大黄素可抑制MyofMyof细胞对细胞对FNFN的的表达和分泌过程。表达和分泌过程。大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响2320g/ml大黄素可在大黄素可在48h内呈时间依赖内呈时间依赖性的减轻白蛋白诱导的性的减轻白蛋白诱导的HK-2细胞转分细胞转分化过程，延缓肾间质纤维化的进展。化过程，延缓肾间质纤维化的进展。大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响24大黄素对白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响25
