1、质谱知识质谱知识 丁俊杰丁俊杰 Sunday,November 20,2022质谱分析法是通过测定被测样品离子的质荷比来对被测物进行定性定量分析的一种方法。1906年，JJThomson “Father of mass spectrometry”质谱是唯一可以给出分子量,确定分子式的方法,而分子式的确定对化合物的结构鉴定是至关重要的。发展发展o历史历史o1906年 J.Jthomson于1912年制造出第一台质谱仪o1946年 发明飞行时间质量分析器(Time-of-flight Analyzer)o1953-1958年 出现四极杆质量分析器(Quadrupole)o1956年 GC-MS开始
2、联用o1959年 质谱首次用于肽序测定o1965年 离子共振质谱出现o1968年 电喷雾离子源o1973年 LC-MSo1974年 Fourier transform ion cyclotor resonance MSo1987-1988年 Matrise assisted laser desorption ionizationo1996年 电喷雾离子源开始用于生物大分子的研究Nobel Prize in MSLC-MS 检测检测回答分析化学中最常见的问题回答分析化学中最常见的问题n 定性定性 -样品中有什么样品中有什么?n 定量定量-样品中有多少样品中有多少?药物色谱分析中不同方法的比例药物
3、色谱分析中不同方法的比例HPLCHPLC85%85%GC/MSGC/MS12%12%LC/MSLC/MS3%3%HPLCHPLC15%15%GC/MSGC/MS5%5%LC/MSLC/MS80%80%1990 年年 2000 年年数据来源数据来源：American Society for Mass Spectrometry,2002MSOMSGC-MSLC-MSQuadrupoleSSQTSQQ-Trap(3级)OrbitrapIon trap3D ITLITTOFQ-TOFSYNAPTTOF/TOFIT-TOFMALDI-TOF/MSFT-MSIMSDFA-MSICP-MSSIMS分类分类O
4、rbitrap:实现离子分离、裂解和多级质谱MSn功能，提供精确的质量分析和高分辨率检测SYNAPT:系统将UPLC分离、高效离子淌度（IMS）和正交飞行时间质谱融合IMSUPLC静电场阱LC-MS联用系统的组成联用系统的组成由机械真空泵机械真空泵(前极低真空泵)，扩散泵或分子泵分子泵(高真空泵)组成真空机组，抽取离子源和分析器部分的真空。只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。离子源离子源o电子轰击源（Electro-Impact source,EI）o化学电离源（Chemical Ionization,CI）o场致电离源（Field Ionization,F
5、I）o场解吸电离源（Field Desorption,FD）o快原子轰击（Fast atom bombardment,FAB）o液相色谱质谱联机的接口n大气压电离源（Atmospheric Pressure Ionization,API）o电喷雾电离（Electro Spary Ionization,ESI）&nano-ESIo大气压化学电离（Atmospheric Pressure Chemical Ionization,APCI）o大气压光喷雾电离(Atmospheric Pressure PhotoSpray Ionization,APPI）o基质辅助激光解析电离（matrix-assi
6、sted laser desorption-ionization,MALDI）分子量非极性极性EI/CIESIAPCI100,0001000哪种离子化方式哪种离子化方式?APPIMALDI质量分析器质量分析器o扇形磁场分析器扇形磁场分析器(Sector Magnetic)o四级杆分析器（四级杆分析器（quadrupole）o离子阱离子阱(ion trap,IT)o飞行时间质量分析器（飞行时间质量分析器（Time of flight,TOF）o傅立叶变换离子回旋共振傅立叶变换离子回旋共振(Fourier transform-ion cyclotron resonance,FT-ICR)种类种类检
7、测参数检测参数质量范围质量范围(Da)质量精度质量精度(Da)真空真空(Pa)优点优点缺点缺点扇形磁场动量/电荷比50-200000.0000110-4高可靠性不适合联用Quadrupole质核比50-30000.1 10-3体积小，成本低不适合MALDIIon trap频率50-20000.1 10-3多级（1-5）质量范围小1/3效应TOF飞行时间50-3000000.000110-4高分辨，高扫描速度对于ESI适应性较差FT-ICR频率50-100000.00001 10-7高分辨，多级价格昂贵质量分析器比较质量分析器比较MS Family进样系统离子源质量分析器MALDIESITOFI
8、on Trap(IT)Quadrupoles(Q)FTMSMALDI-TOF;MALDI-TOF/TOFESI-TOFESI-Qq-TOFESI-Ion TrapESI(or MALDI or.)FTMSESI(or MALDI or.)Q-q FTMSESI-triple QuadrupolesMany other hybrid configurations不同类型GCHPLCUPLCo杂化的分析器(hybrid MS)quadrupole+TOF（Q-TOF）TOF+TOF (TOF/TOF)quadrupole+ion trap（Q-trap）(Orbitrap)Suppliers of
9、 LC-MSoThermo-Fisher(USA)oAB(USA)（被Invitrogen 收购）oBruker Daltonics(Germany)oWaters(USA)oVarian(USA)oAgilent(USA)oShimadzu(JAPAN)我们接触的质谱我们接触的质谱UPLC-MS/MS：AB2000 Quattro micro,三重四级杆质谱仪LC-IT/MS：Thermo LCQ Fleet,离子阱质谱仪离子源离子源电喷雾电离源 Electrospray Ionization (ESI)大气压化学电离源 Atmospheric Pressure Chemical Ioniz
10、ation (APCI)两种离子源的比较两种离子源的比较种类ESIAPCI电离机理离子蒸发高压放电发生了质子转移产生离子MH+和加和峰MH+或M-H-液相流速0.2-0.3 mL/min0.2-1 mL/min断裂程度低温热不稳定的化合物会分解多电荷能不能质量范围可以到几十万98%)，然后用合适的溶剂(MeOH,ACN,H2O)使浓度范围在5-20g/mL。高速离心转移后便可以扫描。（尽量不用DMF&DMSO&吡啶&丙酮）u扫描时正负离子均要扫描，以便于解析结果，扫描范围要达到预计分子量的扫描时正负离子均要扫描，以便于解析结果，扫描范围要达到预计分子量的3倍倍u纯度足够的话是不用加色谱柱的，如
11、果不够可以连色谱柱做全扫描纯度足够的话是不用加色谱柱的，如果不够可以连色谱柱做全扫描 Full scan 常见的准分子离子峰常见的准分子离子峰正离子模式检测正离子模式检测负离子模式检测负离子模式检测M+H+酸性条件M-H+M+Na+;M+K+盐存在M+Cl-M+NH4+NH4缓冲盐M+X+X=溶剂或缓冲液阳离子M+X+X=溶剂或缓冲液阳离子2M+H+高浓度下2M+Na+高浓度下2M+K+高浓度下M+H+S+溶剂加合M-H+S+溶剂加合物M+2H2+(甲醇32,乙腈41,甲酸46,乙酸60)一些有用的规律一些有用的规律正离子模式检测正离子模式检测M+H+=M+1M+NH4+=M+18M+Na+=
12、M+23M+K+=M+39M+HCOOH+H+=M+47 M+CH3COOH+H+=M+61M+CH3OH+H+=M+33M+CH3CN+H+=M+42M+2H2+=(M+2)/2(甲醇甲醇32,乙腈乙腈41,甲酸甲酸46,乙酸乙酸60)负离子模式检测负离子模式检测M-H-=M-1M+Cl-=M+35M+H2O-H-=M+17M+HCOOH-H-=M+45 M+CH3COOH-H-=M+59M+CH3OH-H-=M+31M+CH3CN-H-=M+40M+H+c Full ms 50.00-300.00 50 100 150 200 250 300 m/z 0 20 40 60 80 100 R
13、elative Abundance 129.1 130.1 256.6 61.1 241.8 88.2 292.8 198.0 169.4 131.1 129.1+c Full ms 240.00-2000.003004005006007008009001000m/z020406080100Relative Abundance415.3456.2278.9437.3MW 414 M+H+CH3CN+MW 128 M+NH4+c Full ms 50.00-600.00100200300400500600m/z020406080100Relative Abundance567.7292.8568
14、.8293.9572.5566.5470.0338.7460.0256.1199.299.2MW 275M+H+221.1+c Full ms 50.00-500.0050100150200250300350400450500m/z020406080100Relative Abundance463.1441.2439.2322.2360.5213.890.3145.0243.2MW 220M+Na+2M+H+2M+Na+2M+NH4+(E)Doubly charged ion:M+2H2+c Full ms 240.00-1000.003004005006007008009001000m/z0
15、20406080100Relative Abundance350.1699.2278.9(MW 698)正离子检测方式正离子检测方式+c Full ms 50.00-1000.002004006008001000m/z020406080100Relative Abundance448.9471.0690.1224.8241.8695.2MW 224 M H -c Full ms 50.00-500.0050100150200250300350400450500m/z020406080100Relative Abundance220.8221.9340.9256.5 339.1219.0441.
16、878.9467.0MW 222负离子检测方式负离子检测方式-c ESI Full ms 50.00-800.00100200300400500600m/z020406080100Relative Abundance458.8228.9185.0274.8170.2169.2457.9 460.8275.8324.8273.8563.3417.02M H MW 230150200250300350m/z0.01.02.03.04.05.0Inten.(x10,000)331.1348.1375.2321.2399.2157.1184.9389.3285.1243.1302.9266.9199.
17、9359.2214.0天麻素天麻素(MW 286)M H 天麻素的一级负离子扫描图天麻素的一级负离子扫描图o M=286o M-H=285o M-H+H2O=303?o M+Cl=321o M-H+HCOOH=331o（1）选择离子监测（SIM）SIM用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子。228 m/z162 m/zMinutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00198 m/z和液相的
18、比较SIM fixed 接触的质谱LC-MS/MSUPLC-MS/MS：AB Quattro micro，三重四级杆质谱仪CID：collision-induced dissociation接触的质谱LC-MS/MS-三重四极杆工作模式模式模式Q1Q2Q3用途和特点用途和特点Q1扫描扫描离子不打碎，传输无分辨，传输了解样品基本信息子离子扫描固定过滤母离子打碎母离子扫描子离子研究母离子的结构特征母离子扫描扫描母离子打碎母离子固定过滤子离子筛选具有特征子离子（结构）的分子中性丢失扫描母离打碎子离子扫描子离子，与母离子有特征差异筛选有特征结构的分子，此结构不易形成子离子单离子监视SIM按表过滤离子不
19、打碎，传输无分辨，传输定量多反应检测MRM按表过滤母离子打碎母离子按表过滤子离子定量，假阳性低（3）多反应监测Multiple Reaction Monitoring(MRM)o 母离子和子离子均选定，定量专用o母离子分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物，尽管它们的母离子的质量可以不同，但在分裂过程中会生成共同的子离子，这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。（4 4）母离子扫描）母离子扫描PAR Scan（5 5）子离子扫描）子离子扫描DAU Scan o 选定一个母离子对这个母体产生的所有碎片信息进行记录。这种扫描功能在药物代谢研究中十分重要。中性丢失扫描分析可用来鉴定和确认类型已知的化合物
20、，例如新生儿遗传疾病筛查中某些检测项目。也可以帮助进行未知物结构判断。(6)中性丢失扫描中性丢失扫描CNL Scan 质量数质量数 中性丢失中性丢失质量数质量数 中性丢失中性丢失2 H230 HCHO17 NH334 H2S18 H2O36 HCl20 HF44 CO227 HCN74 C3H6O228 CO/C2H480 HBr注意事项1.定量都是用MRM模式要注意两个关键参数毛细管电压毛细管电压和裂解电压裂解电压2.定性会用到所有的功能仍然要注意裂解电压，如果做代谢的话有用到很多常量参数裂解电压，如果做代谢的话有用到很多常量参数接触的质谱LC-IT/MSLC-IT/MS：Thermo LC
21、Q Fleet LC/MS，是美国Thermo公司产品，离子阱质谱仪SIRMRMMS(n)Auto MS(n)离子阱的信号衰减，一般做到4-5级1/3 cut-off of mass-to-charge ratio接触的质谱LC-IT/MS如何选择如何选择LC-MSLC-MS/MSLC-IT/MSLC-Q/TOF-空间上串联空间上串联时间上串联时间上串联空间上串联空间上串联主要功能Full ScanSIMFull ScanSIMSRMPAR scanDAU scanCNL scanFull ScanSIMSRMMS(n)(n=1-5)Auto MS(n)Full ScanSIMSRMMS(2)
22、Auto MS(2)特点价格实惠MRM灵敏度高多级信息，全扫描灵敏精确分子质量，高分辨适用性均一般定量(某些定性)定性定性，大分子分析条件的移植1.接口的选择：ESI APCI2.正、负离子模式的选择：o正离子模式：正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。o负离子模式：负离子模式：适合于酸性样品。样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负离子模式。3.流动相的选择o常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物oLC-MS接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液 甲酸（乙酸）0.2 三氟乙酸
23、0.1。含三乙胺 l。醋酸铵 5-10 mmoL/L4.流量和色谱柱的选择oESI的最佳流速0.2-0.3 mL/min 应用4.6 mm内径LC柱时要求柱后分流目前大多采用 1-2.1 mm内径的微柱oAPCI的最佳流速0.8-1 mL/min，常规的直径4.6mm柱最合适样品的预处理常用方法样品的预处理常用方法oa）超滤ob）溶剂萃取/去盐oc）固相萃取od）甲醇或乙腈沉淀蛋白oe）酸水解，酶解of）衍生化分析条件的移植基质效应 matrix effecto 离子抑制离子抑制o 原因：生物样品中内源性物质影响分析物离子化原因：生物样品中内源性物质影响分析物离子化o 后果：使信号强度下降，甚
24、至消失后果：使信号强度下降，甚至消失o 发现：发现：配制生物样品，与溶液样品对比配制生物样品，与溶液样品对比o 解决方法解决方法：改进样品预处理方法；色谱分离：改进样品预处理方法；色谱分离LC-MS中常见的本底离子中常见的本底离子om/z 50-150,溶剂离子，(H2O)nH+，n=3-112 om/z 102,H+乙腈+乙酸,C4H7NO2H+,102.0549om/z149,管路中邻苯二甲酸酯的酸酐,C8H4O3H+,149.0233om/z 288,2mm 离心管的产生的特征离子om/z 279,管路中邻苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+,279.1591om/z 316,2mm 离
25、心管的产生的特征离子om/z 384,瓶的光稳定剂产生的离子om/z 391,管路中邻苯二甲酸二辛酯,C24H38O4H+,391.2843om/z 413,邻苯二甲酸二辛酯+钠,C24H38O4Na+,413.2668om/z 538,乙酸+氧+铁（喷雾管),Fe3O(O2CCH3)6,537.8793 MS 的限制的限制o 样品必须离子化样品必须离子化n 离子能够运行、控制和质量分析o 必须有足够的真空度必须有足够的真空度n 离子飞行轨迹的路径必须绝对重视n 真空越高越好o 必须能够测量离子的质量必须能够测量离子的质量n 准确的质量/电荷数比（m/z）问 题1.一般的加合离子都是从哪来的？会出现M+H2O+H+有这个加合峰吗？在多级图谱中会出现S+Na+加合峰吗？2.一级质谱也会产生碎片离子吗？3.子离子m/z一定比母离子m/z小吗？4.三维离子阱和线性离子阱有什么区别？5.为什么用LC-MS/MS定量比LC-MS定量更灵敏？6.为什么气质有谱库而液质没有谱库 谢谢 谢谢!
