1、细胞培养王爱云王爱云参考书 司徒镇强司徒镇强细胞培养细胞培养细胞培养的基本概念细胞培养的基本概念 传代传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。新的培养器皿中。原代培养原代培养 取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长的细胞在传代之前称为原代培养。传代之前称为原代培养。u细胞培养：使用单个细胞悬液细胞培养：使用单个细胞悬液u组织培养：使用组织块（组织培养：使用组织块（O.51立方毫米）立方毫米）或薄片（厚或薄片（厚0.2 毫米）毫米）u器官培养：使用器官原基或器官的一部分器官培养：使用器
2、官原基或器官的一部分或整个器宫或整个器宫原代培养细胞的生命归宿原代培养细胞的生命归宿p原代培养期原代培养期p传代期传代期p衰退期衰退期n有限细胞系，无限细胞系有限细胞系，无限细胞系 n细胞系细胞系 cell linen细胞株细胞株 cell strain（就是从细胞系筛选出（就是从细胞系筛选出来的，有特殊属性的来的，有特殊属性的）细胞来源细胞来源国内细胞库国内细胞库:1.武汉细胞库武汉细胞库http:/www.cctcc.org/fzlbc/cell.doc2.昆明细胞库昆明细胞库http:/ http:/ http:/ 培养细胞的特性培养细胞的特性 培养细胞的生长方式培养细胞的生长方式贴附生
3、长贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞细胞悬浮生长悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种见于各种造血系统造血系统肿瘤细胞肿瘤细胞每代贴附生长细胞每代贴附生长细胞的生长过程的生长过程p 游离期游离期p 贴壁期贴壁期p 潜伏期潜伏期p 对数生长期对数生长期p 停止期（平台期）停止期（平台期）游离期游离期：细胞接种后在培养液中呈悬浮细胞接种后在培养液中呈悬浮 状态也称悬浮期。状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。10分钟分钟4
4、小时小时贴壁期贴壁期：细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟分钟一一4小时贴壁。小时贴壁。底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。着。进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合
5、成的功能基团）潜伏期潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期一般为细胞株潜伏期一般为624小时。小时。对数生长期对数生长期：细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。最适合进行实验研究。停止期停止期（平台期）：（平台期）：细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂分裂 机制：接触抑制、密度依赖性机制：接触抑制、密度依赖性培养细胞生长的条件培养细胞生长的条件1 细胞的营养需要细胞的营养需要2 细胞的生存环境细胞的生存环境 温度温度:37 O2 CO2:5%CO2+H2O
6、 H2CO3 H+HCO3-pH:7.2-7.4 渗透压渗透压 3 无污染无污染 4 无毒无毒实验准备实验准备实验用品实验用品 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸酸缸 CO2培养箱培养箱 倒置显微镜倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器酶标仪、微孔板震荡器 液氮液氮罐罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管冻存管u压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广u电热干燥箱：干热消毒（电热干燥箱：干热消毒（160 ，2小
7、时）。主要用干玻璃小时）。主要用干玻璃u器皿消毒器皿消毒 u滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、u酶液等均采用滤过法除菌酶液等均采用滤过法除菌 u超净工作台：为细胞操作提供无菌环境超净工作台：为细胞操作提供无菌环境u紫外灯紫外灯：紫外线消毒。：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料主要用于培养室空气、操作台、塑料u培养皿和培养板等表面消毒培养皿和培养板等表面消毒超净台超净台n超净工作台的工作原理是超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗效滤器除去空气中的尘埃颗
8、粒，使空气得到净化。净化粒，使空气得到净化。净化空气徐空气徐徐通过工作台面，使徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。工作台内构成无菌环境。三洋灭菌器三洋灭菌器滤器滤器COCO2 2培养箱培养箱uCO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为37 ，5CO2。u使用使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒保持培养箱内空气干净。定期消毒(90 ，14 h)。箱内火菌蒸馏水箱内火菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养
9、液蒸发。保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。自动双重纯水蒸馏器自动双重纯水蒸馏器纯水仪纯水仪微孔板震荡器微孔板震荡器酶标仪酶标仪培 养 板培养瓶，培养皿培养瓶，培养皿移液管，移液枪移液管，移液枪 常用玻璃器皿清洗常用玻璃器皿清洗 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小时）、小时）、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50烘干烘干清洁液的配制清洁液的配制2 细胞培养用液的配制细胞培养用液的配制水：新鲜配置的三蒸水或去离子水水：新鲜配置的三蒸水或去离子水平衡盐溶液：无平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液的缓冲液 PBS：NaCl 8.0
10、g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至加水至1000 ml 消化液消化液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胞分离。胰蛋白酶液浓度胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。度会损伤细胞。胰蛋白酶是一种黄白色胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无粉末，用无Ca2+Ca2+、Mg2+Mg2+的的PBSPBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是缓冲液配制常用的胰
11、蛋白酶液浓度是0.250.25。用滤。用滤器过滤除菌。器过滤除菌。胰蛋白酶液消化时间：胰蛋白酶液消化时间：2-102-10分钟。分钟。用含血清培养液终止其对细胞的消化作用用含血清培养液终止其对细胞的消化作用培养基培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。和合成培养基。天然培养基天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。缺点：来源受限。成分
12、复杂，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染易发生支原体污染 培养基培养基合成培养基合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。无机盐和其它一些辅助物质。优点优点：标准化生产，组分和含量相对固
13、定。：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低成本低 缺点缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。要。人工合成培养基只能维持细胞生存，人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。的天然培养基（如血清）。血清中含有血清中含有：多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）多种金属离子；多种金属离子；激素；激素；促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。各种生长因子各种生长因子转移蛋白转移蛋白
14、不明成分不明成分 一般说来含一般说来含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死但支持细胞生长一般需加不死但支持细胞生长一般需加 10血清血清 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚复杂成分至今尚未完全清楚 血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的
15、综合反应。特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞用无血清培养基培养细胞u无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各无血清培养基的主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如种必需因子，如激素、生长因子激素、生长因子、结合蛋白结合蛋白、贴壁和贴壁和扩展因子扩展因子 等。等。u无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。u1975年，年，Sato首次成功地用无血清培养基培养了垂体首次成功地用无血清培养基
16、培养了垂体细胞株，近细胞株，近20多年来已报道了几十种细胞系在无血清培多年来已报道了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。养基中成功地生长和增殖。u无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。各种细胞产物的程序。向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于向无清培养液中能促进细胞系生长的补加物都是独特的。适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株
17、的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需同源组织的不同细胞株，所需补加物补加物也不同。也不同。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 u血清质量好坏是实验成败的关键。血清质量好坏是实验成败的关键。u常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以清、马血清等，其中以胎牛血清胎牛血清质量最好。质量最好。u优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、
18、病毒污染。支原体、病毒污染。u血清的灭活（消除补体活性）：血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟分钟u血清的消毒：过滤除菌血清的消毒：过滤除菌抗生素的使用抗生素的使用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗生素，以抑制可在培养液配制后，培养液内常加适量抗生素，以抑制可能存在的细菌的生长。能存在的细菌的生长。通常是通常是青霉素和链霉素青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升霉素最终使用浓度为每毫升100单位。单位。庆大霉素：每毫升庆大霉素：每毫升100单位单位方便、广谱、稳定方便、广谱、稳定完全培养基的组成完全培养基的组成u基础培养基基础
19、培养基 8095u血清血清 520u碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g/Lu青、链霉素青、链霉素 各各100U毫升毫升培养基的配制培养基的配制 RPMI-1640培养粉培养粉 1袋袋 碳酸氢钠碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素青、链霉素 各各100单位毫升单位毫升 加三蒸水加三蒸水 至至 1000ml,过滤除菌。过滤除菌。调节调节pH值至值至7.2 加血清（终浓度加血清（终浓度 10）细胞传代方法细胞传代方法 根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。种。1 悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法传代：离心（1000转转/分分）去上清，沉淀物加新培养液后再）
20、去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。混匀传代。直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半悬浮生长细胞传代半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3 贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液
21、。的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法贴壁生长细胞传代方法1 吸光培养瓶中的培养液吸光培养瓶中的培养液2 加入加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准）以消化液能覆盖整个瓶底为准）静置静置2-10 min（显微镜下动态监测）。（显微镜下动态监测）。3 吸去胰蛋白酶液，加入培养液。吸去胰蛋白酶液，加入培养液。4 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。5 吸取吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内。细胞悬液，接种于新的培养瓶内。6 加适量新鲜培养液于接种于细胞悬液的新培养瓶内。加适量
22、新鲜培养液于接种于细胞悬液的新培养瓶内。7 将后者放入培养箱中培养。将后者放入培养箱中培养。细胞计数细胞计数u血细胞计数器：手工计数细胞血细胞计数器：手工计数细胞uCoulter计数仪：非人工计数计数仪：非人工计数4 4个个1616格总数格总数4 4104个个/ml培养细胞活力测定培养细胞活力测定细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的细胞活力测定是肿瘤体外研究中应用最广的技术手段之一。技术手段之一。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。台盼蓝法台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染
23、成蓝色，用活细胞占活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞中细胞中的百分比表示细胞活力的百分比表示细胞活力 已淘汰已淘汰四唑盐（四唑盐（MTTMTT）比色法）比色法 四唑盐四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝商品名为噻唑蓝，四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四四吐盐比色法的原理：活细胞中脱氢酶能将四唑唑盐还盐还原成不溶干水的蓝紫色产物（原成不溶干水的蓝紫色产物（formazan)，并沉淀在细胞，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含
24、的formazan量成正比。再用酶标仪测定量成正比。再用酶标仪测定OD值值 MTTMTT法简单快速、准确，广泛应用于法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。等。操作步骤操作步骤 （1）单细胞悬液接种于）单细胞悬液接种于96孔培养板；孔培养板；103-104细胞细胞/孔，每孔培孔，每孔培养基总量养基总量200微升（微升（96孔培养板每孔容积孔培养板每孔容积370微升），微升），37、5CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入）加入2毫克毫升的毫克毫升
25、的MTT液（液（50微升孔）；继续培养微升孔）；继续培养3小时。小时。（3）吸出孔内培养液后，加入）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（液（150微升孔），将微升孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔）酶标仪检测各孔OD值（检测波长值（检测波长570nm）。记录结果。）。记录结果。细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特力、经费，减少污染，
26、减少细胞生物学特性变化。性变化。冻存和复苏的原则：慢冻快融冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。如果缓慢冷冻，可使细胞如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水逐步脱水，细胞内不致产生，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。成大冰晶
27、，即冰晶的重结晶。慢冻程序慢冻程序 标准程序标准程序：当温度在当温度在-25 以上时，以上时，12/min 当温度达当温度达-25 以下时，以下时，510/min 当温度达当温度达-100时，可迅速放入液氮中（时，可迅速放入液氮中（-196度）度）细胞冻存器细胞冻存器 简易程序简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，线绳，通过线绳将通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12 的速度，在的速度，在40分钟内降至液氮表面，停分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮分钟后，直
28、接投人液氮中。中。低温保护剂的应用低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。存效果。常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。胞的损伤。细胞冻存方法细胞冻存方法1.预先配制冻存液：预先配制冻存液：
29、20%血清培养基血清培养基+10%DMSO2.取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用用吸管吹打制成细胞悬液（吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞细胞/ml)3.加入加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷称和冷冻日期。冻日期。4.1年后，存活率可达年后，存活率可达8090。DMSO液用培养液配好，液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。避免因临时配制产热而伤害细胞。慢慢细胞复苏方法细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水水浴中，使其融化（浴中，使其融化（1分钟左右）。分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。倍以上。（3）低速离心）低速离心10分钟。分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。快快
