1、微生物的遗传变异微生物的遗传变异与菌种选育与菌种选育了解微生物遗传变异的物质基础。了解微生物遗传变异的物质基础。掌握基因突变的实质、类型、特点和机制。掌握基因突变的实质、类型、特点和机制。了解不同类型微生物的基因重组。了解不同类型微生物的基因重组。学会依据微生物的遗传特性设计工业微生物学会依据微生物的遗传特性设计工业微生物菌种的筛选程序，并能合理保藏所得菌种。菌种的筛选程序，并能合理保藏所得菌种。目的要求目的要求主要内容主要内容1、微生物遗传变异的物质基础、微生物遗传变异的物质基础2、微生物的基因突变、微生物的基因突变3、微生物的基因重组、微生物的基因重组4、微生物的菌种选育、微生物的菌种选育
2、5、微生物菌种保藏及复壮、微生物菌种保藏及复壮遗传（遗传（heredity）:上一代生物将自身的一整套遗传基因稳定地上一代生物将自身的一整套遗传基因稳定地传递给下一代的特性传递给下一代的特性。变异（变异（variation）：）：生物体在某种外因或内因的作用下，发生遗生物体在某种外因或内因的作用下，发生遗传物质结构或数量的改变，而且这种改变稳传物质结构或数量的改变，而且这种改变稳定，具有可遗传性定，具有可遗传性。几个概念几个概念1.遗传与变异遗传与变异遗传保证了微生物种的相对稳定性、种的存在和延续，遗传保证了微生物种的相对稳定性、种的存在和延续，而变异则推动了种的进化和发展。而变异则推动了种的
3、进化和发展。2.遗传型和表型遗传型和表型遗传型（遗传型（genotype）表型表型(phenotype)某一生物体个体所含有的全部遗传因子，某一生物体个体所含有的全部遗传因子，即基因的总和即基因的总和，又称为基因型。又称为基因型。某一生物体所具有的一切外表特征及内某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和在特性的总和。遗传型遗传型表型表型环境条件环境条件代谢、发育代谢、发育饰变（饰变（modification）表型的差异只与环境有关。不涉及遗传物质结构改变而只发生表型的差异只与环境有关。不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型改变。在转录、转译水平上的表型改变。谷氨酸发酵的温
4、度敏感菌株在谷氨酸发酵的温度敏感菌株在3030时菌体生长而不产生氨基时菌体生长而不产生氨基酸，但是当温度提高到酸，但是当温度提高到3737时，菌体大量合成谷氨酸。时，菌体大量合成谷氨酸。3.饰变饰变特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。特点：暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为。比表面积大；比表面积大；个体易变异；个体易变异；便于建立纯系；便于建立纯系；作为遗传研究材料作为遗传研究材料4、微生物是遗传学研究中的明星一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验二、遗传物质在细胞内存在部位和方式二、遗传物质在细胞内存在部位和方式肺炎双球菌转化实验（
5、讲）肺炎双球菌转化实验（讲）-遗传物质是遗传物质是DNA噬菌体的感染实验噬菌体的感染实验-病毒重建实验病毒重建实验遗传物质是遗传物质是RNA1928年年F.Griffith，1944年年Avery，肺炎双球菌的转化实验，肺炎双球菌的转化实验1）动物实验）动物实验活的活的S菌菌抽心血分离证明：DNA是转化所必需的转化因子2）细菌培养实验）细菌培养实验热死热死S菌菌不生长不生长3）S菌的无细胞抽提液实验菌的无细胞抽提液实验活活R菌菌+S菌的无细胞抽提液菌的无细胞抽提液长出大量长出大量R菌和少量菌和少量S菌菌Avery抽提细胞抽提细胞DNA、RNA、蛋白质、荚膜多糖、蛋白质、荚膜多糖活R菌加加S菌的
6、菌的DNA加加S菌的菌的DNA+DNA酶以外的酶酶以外的酶加加S菌的菌的DNA+DNA酶酶分别加分别加S菌的菌的RNA、蛋白质、荚膜多糖、蛋白质、荚膜多糖长出S菌只长出R菌肺炎双球菌肺炎双球菌活活R菌菌热死热死S菌菌+活活R菌菌长出长出R菌菌长出大量长出大量R菌菌+极少极少S菌菌培养培养培养培养1952年年Hershey，Chase，噬菌体感噬菌体感染实验染实验T2噬菌体感染试验示意图噬菌体感染试验示意图 植物病毒的重建实验证明杂种病毒的蛋白质外壳来自TMV还是HRV,可用血清学反应鉴定证明核酸（证明核酸（RNA）是遗传的物质基础）是遗传的物质基础血清学反应说明病毒蛋白质的特性由核酸而定H.F
7、raenkel-Conrat(1956年)病斑的特性和病毒核酸一致二、遗传物质在细胞内存在的部位和方式二、遗传物质在细胞内存在的部位和方式（一）七个水平（一）七个水平细胞水平细胞水平（单核，多核）（单核，多核）细胞核水平细胞核水平（真核，拟核，（真核，拟核，质粒质粒）染色体水平染色体水平核酸水平核酸水平（DNA，部分病毒为，部分病毒为RNA；双链，少数病毒为单链）；双链，少数病毒为单链）基因水平基因水平（遗传功能单位）（遗传功能单位）密码子水平密码子水平（遗传信息单位）（遗传信息单位）核苷酸水平核苷酸水平（最低突变单位和交换单位）（最低突变单位和交换单位）（一套，两套）（一套，两套）是实体，其
8、物质基础是是实体，其物质基础是DNA（或（或RNA）；）；是一个含有特定遗传信息的是一个含有特定遗传信息的DNA分子区段；分子区段；是遗传信息传递和性状分化发育的依据；是遗传信息传递和性状分化发育的依据；基因是可分的，根据功能不同，分为：基因是可分的，根据功能不同，分为：编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因 结构基因（结构蛋白，酶）结构基因（结构蛋白，酶）调节基因（阻遏蛋白或激活蛋白）调节基因（阻遏蛋白或激活蛋白）无翻译产物的基因无翻译产物的基因 tRNA基因（简称基因（简称 tDNA）rRNA基因（简称基因（简称rDNA）不转录的不转录的DNA区段区段 启动子（启动子（promotor）操纵基因
9、（操纵基因（operator）基因是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，它基因是一个含有特定遗传信息的核苷酸序列，它是遗传的功能单位。是遗传的功能单位。微生物的微生物的 质粒和转座因子质粒和转座因子质粒（质粒（plasmid）：）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。转座因子（转座因子（transposable element）：位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置位于染色体或质粒上的一段能改变自身位置的的DNA序列，广泛分布于原核和真核细胞中。序列，广泛分布于原核和真核
10、细胞中。质粒分子的大小范围从质粒分子的大小范围从1kb左右到左右到1000kb；质粒性质：质粒性质：自主复制；自主复制；转移性；转移性；质粒的不亲和性；质粒的不亲和性；质粒可消除性；质粒可消除性；包括插入序列包括插入序列IS、转座子、转座子Tn和某些特殊病毒和某些特殊病毒Mu。效应：插入突变、染色体畸变、基因移动和重排。效应：插入突变、染色体畸变、基因移动和重排。质粒的主要类型质粒的主要类型根据质粒所根据质粒所编码的功能编码的功能和赋予宿主和赋予宿主的表型效应的表型效应分类分类:致育因子（致育因子（Fertility factor，F因子）因子）抗性质粒（抗性质粒（Resistance fac
11、tor，R因子）因子）产细菌素的质粒（产细菌素的质粒（Bacteriocin production plasmid）毒性质粒（毒性质粒（virulence plasmid）代谢质粒（代谢质粒（Metabolic plasmid）隐秘质粒（隐秘质粒（cryptic plasmid）2m质粒质粒根据拷贝数或复制特点，质粒可分为：根据拷贝数或复制特点，质粒可分为：高拷贝数高拷贝数(high copy number)质粒质粒（每个细胞中可以有10100个拷贝,其复制和染色体的复制不同步）如ColE1、ColE2等 松弛型质粒松弛型质粒(relaxed plasmid)低拷贝数低拷贝数(low copy
12、 number)质粒质粒（每个细胞中只有12个拷贝,其复制行为与染色体的复制同步）如F因子，R100 严谨型质粒严谨型质粒(stringent plasmid)窄宿主范围质粒窄宿主范围质粒(narrow host range plasmid)（只能在一种特定的宿主细胞中复制）（只能在一种特定的宿主细胞中复制）广宿主范围质粒广宿主范围质粒(broad host range plasmid)（可以在许多种细菌中复制）5.2 5.2 微生物的基因突变微生物的基因突变1、突变的类型、突变的类型2、突变的特点、突变的特点3、突变的机制、突变的机制野生型野生型:-从自然界分离到的菌株一般称野生型菌株从自然
13、界分离到的菌株一般称野生型菌株（wild type strain），简称野生型。），简称野生型。突变株突变株:-野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，称为突变株（称为突变株（mutant）。）。染色体畸变：染色体畸变：是指染色体较大范围内结构的变化，如缺失、是指染色体较大范围内结构的变化，如缺失、重复、倒位、易位等以及染色体数目的变化。重复、倒位、易位等以及染色体数目的变化。1 1、突变的类型、突变的类型突变突变：指遗传物质突然发生稳定的可遗传的变化，影：指遗传物质突然发生稳定的可遗传的变化，影响生物正常遗传的表型和性能的现象。响生物正常遗传的表型和性能的
14、现象。1）突变涉及的范围，可分为）突变涉及的范围，可分为:基因基因(点点)突变：是指一个基因内部遗传结构或突变：是指一个基因内部遗传结构或DNA序列的序列的任何改变，涉及一对或少数几对碱基的置换、缺失或插入任何改变，涉及一对或少数几对碱基的置换、缺失或插入碱基置换：各种类型的转换和颠换碱基置换：各种类型的转换和颠换移码突变：碱基对的增减则造成增减变异点以后全部密移码突变：碱基对的增减则造成增减变异点以后全部密码及其编码的氨基酸改变。码及其编码的氨基酸改变。？1.营养缺陷突变型营养缺陷突变型：2.抗性突变型：抗性突变型：抗药抗药、紫外线、噬菌体；、紫外线、噬菌体；3.条件致死突变型：条件致死突变
15、型：4.形态突变型：形态突变型：5.抗原突变型：抗原突变型：6.产量突变型：产量突变型：2）突变的表型可分为：）突变的表型可分为：（1）营养缺陷型（）营养缺陷型（auxotroph）一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素一种缺乏合成其生存所必须的营养物（包括氨基酸、维生素、碱基等）的突变型。、碱基等）的突变型。营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段表型判断的标准：表型判断的标准：在在基本培养基基本培养基上能否生长上能否生长特点：特点：在选择培养基（一般为基本培养基）上不生长负选择标记负选择标记突变株不能通过选择平板直接获得营养缺陷型的表示方法：营养缺陷型的表
16、示方法：基因型：基因型：所需营养物的前三个英文小写斜体字母小写斜体字母表示：hisC（组氨酸缺陷型，其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变）表型：表型：同上，但第一个字母大写，且不用斜体：第一个字母大写，且不用斜体：HisC在具体使用时多用hisC-和hisC+，分别表示缺陷型和野生型。（2）抗药性突变型（）抗药性突变型（resistant mutant）使菌株对某种或某几种药物（如抗生素），产生抗性。使菌株对某种或某几种药物（如抗生素），产生抗性。特点：特点：正选择标记正选择标记（突变株可直接从抗性平板上获得（突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。）表
17、示方法：表示方法：所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示表示strr 和 strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性（3）条件致死突变型（）条件致死突变型（conditional lethal mutant）在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下能正常在某一条件下具有致死效应，而在另一条件下能正常生长、繁殖的突变型。生长、繁殖的突变型。常用的条件致死突变是温度敏感突变温度敏感突变，用ts（temperature sensitive）表示，这类突变在高温下（如42）是致死的，但可以在低温（如25-30）下得到这种突变。特点：特点：负选择标记负选择标记这
18、类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因（4）形态突变型（）形态突变型（morphological mutant）造成形态改变的突变型造成形态改变的突变型特点：特点：非选择性突变非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长，但可从形态特征上进行区分。举例：产蛋白酶缺陷突变株的筛选菌落颜色变化半乳糖苷酶基因的插入失活，使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开。形成芽孢缺陷菌株（5）抗原突变型）抗原突变型 由于突变引起的细胞抗原结构发生由于突变引起的细胞抗原结构发生变异的类型。变异的类型。细胞壁缺陷变异细胞壁缺陷变异荚膜、鞭毛成分变异荚膜、鞭毛成分变异（6）产量突变型）产量突变型 通过基因突变而产生的
19、在代谢产物通过基因突变而产生的在代谢产物产量上明显有别于原始菌株的突变。产量上明显有别于原始菌株的突变。正突变（正突变（plus mutant）负突变（负突变（minus mutant）3）突变的条件和原因）突变的条件和原因自发突变：在自然条件下微生物发生的基因自发突变：在自然条件下微生物发生的基因突变。突变率为突变。突变率为10-8个左右。个左右。诱发突变：人工理化因素处理微生物引起的诱发突变：人工理化因素处理微生物引起的突变。突变。物理诱变：物理诱变：化学诱变：化学诱变：复合诱变：复合诱变：定向培育和驯化：定向培育和驯化：1）自发性）自发性2）非对应性非对应性3）稀有性）稀有性4）独立性）
20、独立性5）可诱变性）可诱变性6）稳定性）稳定性7）可逆性）可逆性2、基因突变的特点、基因突变的特点突变性状与突变原因不对应突变性状与突变原因不对应(如何证明如何证明)突变基因的性状是稳定的突变基因的性状是稳定的诱变剂可提高突变率，诱变剂可提高突变率，10-106倍倍不同基因的突变互不影响不同基因的突变互不影响自发突变几率低，自发突变几率低，10-6-10-9回复突变回复突变证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！三个经典实验三个经典实验变量实验（讲）变量实验（讲）、涂布实验、影印实验、涂布实验、影印实验基因突变自发性和非对应性的证明基因突
21、变自发性和非对应性的证明驯养论？驯养论？变量实验（fluctuation analysis）Salvador Luria and Max Delbruck（1943）The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969对噬菌体对噬菌体T1敏感的敏感的E.coli 对数期培养物对数期培养物，稀释至，稀释至103/mL,分装两试管，各分装两试管，各10 mL 与甲管分装的各小管与甲管分装的各小管同时保温同时保温2436h甲管 乙管 Newcombe的涂布实验（的涂布实验（1949）在涂布过的一组中，在涂布过的一组中，共长出抗性菌落共长出抗性菌落353个，比未
22、经涂布过的个，比未经涂布过的（28个菌落）高得多个菌落）高得多约繁殖了约繁殖了12.3代代选用对选用对T1 噬菌体敏感的噬菌体敏感的E.coli，以相等数目涂布于，以相等数目涂布于12个平板上个平板上影印实验（影印实验（replica plating）Joshua Lederberg and Esther Lederberg（1952）通过使菌不接触抗性环境而检查其抗性菌落的方法J.Lederberg is awarded the Noble Prize in Medicine and Physiology in 19583、基因突变的机制、基因突变的机制3.1自发突变的机制自发突变的机制3.
23、2诱发突变的机制诱发突变的机制突变真的与选择压力无关吗突变真的与选择压力无关吗？3.1自发突变的机制自发突变的机制1）多因素低剂量的诱变效应：）多因素低剂量的诱变效应：2）微生物自身代谢产物的诱变效应）微生物自身代谢产物的诱变效应：咖啡碱、硫氰：咖啡碱、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮丝氨酸化合物、二硫化二丙烯、重氮丝氨酸；H2O23）互变异构效应：）互变异构效应：正正-反的互变：碱基反的互变：碱基-脱氧核糖键旋转造成。脱氧核糖键旋转造成。4）环状突变效应）环状突变效应：向外环出：向外环出 恢复正常恢复正常 错配错配 3.2诱发突变的机制诱发突变的机制碱基对的置换碱基对的置换移码突变移码突变染色
24、体畸变染色体畸变直接直接间接间接该类诱变剂与碱基起化学反应，改变碱基的结构，导致错配。该类诱变剂与碱基起化学反应，改变碱基的结构，导致错配。亚硝酸：亚硝酸：G-C A-T 转换互变转换互变 各种烷化剂各种烷化剂：G-C A-T 互变互变羟胺：只引起羟胺：只引起G-C A-T 转换（专一性与转换（专一性与C起反应）起反应）1）碱基置换）碱基置换1）直接）直接讲讲1次2次烷化剂烷化剂甲基磺酸乙酯（甲基磺酸乙酯（EMS）甲基磺酸甲酯（甲基磺酸甲酯（MMS）硫酸二乙酯（硫酸二乙酯（DES）N-甲基甲基-N-硝基硝基-N-亚硝基胍亚硝基胍(NTG)氮芥、硫芥氮芥、硫芥环氧乙烷环氧乙烷亚硝基胍：亚硝基胍：
25、诱变作用强，称为诱变作用强，称为超强诱变剂超强诱变剂（突变率（突变率1%）；）；能诱发邻近位置的基因同时发生突变，即所谓能诱发邻近位置的基因同时发生突变，即所谓并发突变并发突变。很多烷化剂除了能诱发点突变外，还能诱发染色体畸变除了能诱发点突变外，还能诱发染色体畸变。由于染色体畸变常为辐射所诱发，所以这些物质又称为拟辐射物质拟辐射物质。烷化剂作用的主要机理是引起碱基上某些能形成氢键的基团发生烷基化。烷化位点主要在鸟嘌呤的N 7位和腺嘌呤的N 3位上，烷化后的碱基也像碱基结构类似物一样能引起碱基配对的错误。烷化剂的另一作用是使嘌呤整个地从DNA链上脱下来，产生一个缺口，在与缺口相对应的位点上就能配
26、上任何一个碱基，从而引起转换或颠换。1）碱基置换）碱基置换2）间接）间接它们在它们在DNA复制中能掺入复制中能掺入DNA 分子中，由于其产生异构体的频分子中，由于其产生异构体的频率高，因此发生的错误配对可引起碱基的置换。率高，因此发生的错误配对可引起碱基的置换。一类与正常碱基结构相似的物质，称为一类与正常碱基结构相似的物质，称为碱基类似物碱基类似物。如：如：5-BU,8-NG,2-AP等。A-TA-TA-BUA-TG-BUG-CA-BU加入5-BU扁平的三个苯环结构类似于扁平的三个苯环结构类似于碱基对碱基对的化合物，能插的化合物，能插入入DNA碱基对间，使碱基增加或缺失而造成。碱基对间，使碱基
27、增加或缺失而造成。吖啶、吖啶黄、吖啶橙，吖啶、吖啶黄、吖啶橙，5-氨基吖啶、溴化乙锭。氨基吖啶、溴化乙锭。2）移码突变）移码突变紫外线紫外线（UV）、x射线、射线、射线等、亚硝酸及烷化剂射线等、亚硝酸及烷化剂 3）染色体畸变）染色体畸变常用的非电离辐射诱变因子。常用的非电离辐射诱变因子。作用机制：作用机制：DNA链的断裂、链的断裂、DNA双链的交联、双链的交联、嘧啶的水合作用嘧啶的水合作用 相邻碱基形成嘧啶二聚体（相邻碱基形成嘧啶二聚体（TT,TC,CC）等。）等。其中最主要的效应是其中最主要的效应是TT的形成的形成(链间、链内链间、链内)。影响解链影响解链复制与转录复制与转录死亡死亡影响氢键
28、影响氢键扭曲变形扭曲变形碱基配对碱基配对突变或死亡突变或死亡DNA紫外损伤的修复系统（研究较详细）紫外损伤的修复系统（研究较详细）光复活作用光复活作用（讲）（讲）切除修复作用切除修复作用重组修复作用重组修复作用紧急呼救（紧急呼救（SOS）修复系统）修复系统光复活作用光复活作用光解酶光解酶 “T-T”结合结合 酶酶-DNA专一识别专一识别黑暗黑暗光解光解光照光照“T-T”拆开，酶再释放拆开，酶再释放提高诱变率方法：用紫外线照射菌液后，要在红提高诱变率方法：用紫外线照射菌液后，要在红灯下操作处理，再于暗室中或用黑布包起来培养。灯下操作处理，再于暗室中或用黑布包起来培养。原理原理可见光可大大降低经紫
29、外线照射后微生物死亡率的现象。可见光可大大降低经紫外线照射后微生物死亡率的现象。一种普遍的修复系统。能移去TT和修复大多数引起的DNA扭曲损伤。该修复系统不需要可见光，通过酶切作用移去损伤的碱基（包括损伤位点附近的一些碱基），随后合成一段正常DNA链。内切核酸酶 4种酶参与种酶参与 外切核酸酶 DNA聚合酶 DNA连接酶切除修复（切除修复（excision repair，又称暗修复），又称暗修复）重组修复重组修复一种越过损伤而进行的修复。一种越过损伤而进行的修复。这种修复不将损伤的碱基除去这种修复不将损伤的碱基除去，而是通过复制后，经，而是通过复制后，经染色体染色体交换，使子链上的空隙部位不交
30、换，使子链上的空隙部位不再面对着嘧啶二聚体，而是面再面对着嘧啶二聚体，而是面对着正常的单链，在这种情况对着正常的单链，在这种情况下，下，DNA聚合酶和连接酶便能聚合酶和连接酶便能起作用，把空隙部分进行修复起作用，把空隙部分进行修复。留在亲链上的二聚体仍要依。留在亲链上的二聚体仍要依靠再一次的切除修复加以除去靠再一次的切除修复加以除去，或经细胞分裂而稀释掉。，或经细胞分裂而稀释掉。这是细胞经诱导产生的一种应急反应这是细胞经诱导产生的一种应急反应.细胞中有许多细胞中有许多基因和操纵子受基因和操纵子受RecRecA A蛋白协同调控和蛋白协同调控和LexLexA A阻遏蛋白阻遏蛋白的抑制。的抑制。SO
31、SSOS修复系统是由修复系统是由RecARecA蛋白诱导的，由于存在较蛋白诱导的，由于存在较多多DNADNA损伤时，损伤时，RecARecA蛋白构型改变显示出激活态。激蛋白构型改变显示出激活态。激活态的活态的RecARecA蛋白切开蛋白切开LexALexA阻遏蛋白，从而解脱受抑阻遏蛋白，从而解脱受抑制的的制的的recArecA和其他修复基因和其他修复基因,对形成的对形成的“T-TT-T”进行切进行切除修复。除修复。SOS修复系统修复系统 诱变剂与致癌物质诱变剂与致癌物质Ames试验试验a）利用各种诱变剂获得各类遗传突变；）利用各种诱变剂获得各类遗传突变；c）危害人类自身的健康）危害人类自身的健
32、康b）对有害微生物进行控制；）对有害微生物进行控制；许多种化学物质，能以各种机制导致许多种化学物质，能以各种机制导致DNA的突变的突变补充补充美国加利福尼亚大学的Bruce Ames教授于1966年发明，称为Ames试验生物化学统一性生物化学统一性法则：人和细菌在人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的，能的结构及特性方面是一致的，能使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的使微生物发生突变的诱变剂必然也会作用于人的DNA，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良，使其发生突变，最后造成癌变或其他不良的后果。的后果。超过超过95%95%的致癌物质对微生物有诱变作用。的致癌物质对微生物有诱变作用。9
33、0%90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用。鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型菌株在基本培养基平板上鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型菌株在基本培养基平板上不能生长；如果该菌株接触化学试剂后再接种到基本不能生长；如果该菌株接触化学试剂后再接种到基本培养基平板上能生长；则表明在基本培养基上得到了培养基平板上能生长；则表明在基本培养基上得到了该菌株的突变株，进而推断所接触的化学试剂具有诱该菌株的突变株，进而推断所接触的化学试剂具有诱变作用，因而表明其为变作用，因而表明其为“三致三致”试剂。试剂。Ames试验原理：试验原理：Ames试验丙丙烯烯酰酰胺胺黄黄曲曲霉霉素素氨氨基基芴
34、芴对对照照回复突变自发回复突变可疑“三致”样品鼠肝匀浆（含加氧酶）保温吸入滤纸片吸入滤纸片回复突变回复突变阳性阳性阴性阴性 由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体由于生物体内、体外可能存在的差异，可在体外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测外加入哺乳动物（如大鼠）微粒体酶系统，使待测物活化，使物活化，使Ames试验的准确率达试验的准确率达80-90%。证明Ames试验重要性的应用实例（自己阅读）：国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反反应停应停”，由于其药效显著，在，由于其药效显著，在60-7060-70年代十分流行年代十分流行.但随后人们就发
35、现畸形儿的出生率明显增高，而但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高，而且生产畸形儿的妇女大多曾服用且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停反应停”，后来采，后来采用用AmesAmes试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用，因此这种药物被禁止使用，因此这种药物被禁止使用.5.3 微生物的基因重组微生物的基因重组基因重组（遗传传递）：指遗传物质从一个微生物基因重组（遗传传递）：指遗传物质从一个微生物细胞向另一个微生物细胞传递细胞向另一个微生物细胞传递(接触或不接触接触或不接触)而而达到基因的改变，形成新遗传型个体的过程。达到基因的改变，形成新遗传型个体的过程。
36、原核微生物的基因重组原核微生物的基因重组噬菌体的基因重组噬菌体的基因重组真核微生物的基因重组真核微生物的基因重组1.转化：转化：1928，Griffith2.转导：转导：1951，Lederberg和和 Zinder3.接合：接合：1946，Lederberg 和和 Tatum4.溶原性转变溶原性转变一、原核微生物的基因重组一、原核微生物的基因重组转化转化：受体细胞直接吸收供体细胞的受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段片段,并与其染色并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，使受体细胞获得新的遗传性体同源片段进行遗传物质交换，使受体细胞获得新的遗传性状的现象。状的现象。转化（转化（transfor
37、mation）转化因子转化因子受体细胞受体细胞感受态感受态转化子转化子高高1000倍倍吸附吸收吸附吸收整合整合供体供体(strR)ds DNA感受态受体感受态受体(strS)酶解与吸收单链酶解与吸收单链同源区段配对同源区段配对单链整合单链整合复制与分离复制与分离转化子转化子(strR)非转化子非转化子(strS)转化因转化因子进入子进入细胞细胞 转化因转化因子单链子单链配对与配对与整合整合 复制复制 分离分离 转导（转导（transduction）转导：转导：利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整
38、合，使后者获得携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。前者部分遗传性状的现象。由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为转导子转导子（transductant）携带供体部分遗传物质（携带供体部分遗传物质（DNA片段）的噬菌体称为片段）的噬菌体称为转导噬菌体。转导噬菌体。细菌转导的二种类型：普遍性转导普遍性转导特异性转导特异性转导1、普遍性转导（、普遍性转导（generalized transduction）通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，
39、称普遍性进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性转导。转导。(1)意外的发现意外的发现 1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌LT22A（P22）和LT2 实验：用“U”型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！沙门氏菌LT22A是携带P22噬菌体的溶源性细菌 另一株LT2是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过“U”型管滤板的P22噬菌体介导的(在接种LT22A
40、的一端出现了原养型)（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）沙门氏菌的普遍性转导沙门氏菌的普遍性转导 进入受体的外源进入受体的外源DNA通过与细胞染色体的通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子重组交换而形成稳定的转导子（完全转导）（完全转导）如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌DNA片段后，在其体内片段后，在其体内不不发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。这种转导被称为这种转导被称为流产转导流产转导.供体片段供体片段单单线线传传递递2.
41、特异性转导（特异性转导（specialized transduction）定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数 特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因 组整合、重组，形成转导子的现象。媒介：部分缺陷噬菌体（丢失自身一部分基因，并被 同等长度的宿主基因所取代）只能转导个别特定基因 大肠杆菌中大肠杆菌中噬菌体的正常裂解及半噬菌体的正常裂解及半乳糖基因转导噬菌体的形成过程乳糖基因转导噬菌体的形成过程galbiogalbiogalbiogalbiobiogal正常正常误切误切 溶原性转变（lysogenic conversion）：一个与转导相似又不同的现象定义:温和噬菌体感染细胞后使之发生溶
42、源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。溶原性转变与转导的不同？溶原性转变与转导的不同？a）噬菌体不携带任何供体菌的基因；b）这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；接合接合(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程。中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！为减少所培养的结果是回复突变的机会，采用双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想上的。F菌株F质粒的四种存在方式及相互关系质粒的四种存在方式及相互关系 高出几百高出几百倍以上倍以上 F+F-F+F-F+F+F+F+起点起
43、点接合管接合管断裂断裂进入进入滚环复制滚环复制合成互补链合成互补链分开分开接合管接合管染色体染色体DNAF因子因子复制起点，复制起点，开始复制开始复制1条链进入条链进入复制互补链复制互补链重组重组易断裂易断裂二、噬菌体的基因重组二、噬菌体的基因重组 烈性噬菌体烈性噬菌体 噬菌体噬菌体h+r-h-r+产生的四种子裔噬菌体形成的噬菌斑产生的四种子裔噬菌体形成的噬菌斑 透明而小透明而小半透明而大半透明而大半透明而小半透明而小透明而大透明而大温和性噬菌体：温和性噬菌体：溶原现象。溶原现象。无速溶性状无速溶性状,寄寄主范围扩大主范围扩大寄主范围正常寄主范围正常,但具速溶性状但具速溶性状1.有性杂交：指性
44、细胞间的接合和随之发生染色体有性杂交：指性细胞间的接合和随之发生染色体重组，并产生新遗传型后代的一种方式。重组，并产生新遗传型后代的一种方式。2.准性生殖：准性生殖：指两个体细胞融合，不经过减数分裂就能导指两个体细胞融合，不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程。致基因重组的生殖过程。菌丝联结：菌丝联结：形成异核体：独立生活。形成异核体：独立生活。核融合核融合(2倍体倍体)：10-5-10-7分离子的产生：有丝分裂过程中染色体会发生交换分离子的产生：有丝分裂过程中染色体会发生交换和单倍体化和单倍体化。三、真核微生物的基因重组三、真核微生物的基因重组 方法、地点、时间和周围环境记录方法、地点、时
45、间和周围环境记录纯种分离的原则就是使培养纯种分离的原则就是使培养物获得单个菌落：物获得单个菌落：1稀释平板稀释平板(倾注倾注/涂布涂布)分离法分离法 2平板划线分离法平板划线分离法 一、自然界工业菌种筛选程序一、自然界工业菌种筛选程序目标菌目标菌数量少数量少问题？具体实例问题？具体实例/如何鉴定如何鉴定1、步骤和方法、步骤和方法原菌株（出发菌株）原菌株（出发菌株）纯化纯化细胞或孢子悬浮液细胞或孢子悬浮液诱变处理诱变处理中间培养中间培养突变株分离突变株分离初筛初筛复筛复筛生产性试验生产性试验诱变预备实验诱变预备实验活细胞计数活细胞计数离心收集菌体离心收集菌体离心洗涤离心洗涤玻璃珠振荡分散玻璃珠振
46、荡分散过滤过滤活细胞计数活细胞计数物理方法：物理方法：紫外线、紫外线、射线、等离子等射线、等离子等化学方法：化学方法：与碱基反与碱基反应、碱基类似物、移应、碱基类似物、移码突变剂码突变剂复合法：复合法：形态突变：形态突变：淘汰淘汰平皿反应：平皿反应：挑取变异菌挑取变异菌株（变色圈、透明圈、株（变色圈、透明圈、生长圈、抑菌圈等）生长圈、抑菌圈等）二、诱变育种二、诱变育种90-99.9%2.筛选方法筛选方法（1）抗药性突变型的筛选）抗药性突变型的筛选（2）营养缺陷型突变体的筛选）营养缺陷型突变体的筛选什么叫营养缺陷型菌株什么叫营养缺陷型菌株?？指某些微生物通过诱变处理使其在一些营养物质的指某些微生
47、物通过诱变处理使其在一些营养物质的合成能力上出现缺陷，不能合成，只能外源提供。合成能力上出现缺陷，不能合成，只能外源提供。明确几种培养基明确几种培养基:基本培养基基本培养基(MM)完全培养基完全培养基(CM)补充培养基补充培养基(SM)营养缺陷型菌株筛选步骤营养缺陷型菌株筛选步骤诱变处理诱变处理淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株(浓缩缺陷型浓缩缺陷型)检出缺陷型检出缺陷型确定生长谱确定生长谱抗生素法抗生素法:诱变处理液在诱变处理液在MM中培养短时中培养短时,野生型生野生型生长活化长活化,缺陷型处于缺陷型处于“休眠休眠”,加入抗生素加入抗生素,杀死野生杀死野生型型,保存缺陷型保存缺陷型.青霉素、制霉菌
48、素。青霉素、制霉菌素。菌丝过滤法菌丝过滤法：丝状真菌。野生型孢子萌发菌丝而缺：丝状真菌。野生型孢子萌发菌丝而缺陷型不能，过滤除去菌丝，反复几次，达到浓缩。陷型不能，过滤除去菌丝，反复几次，达到浓缩。差别杀菌法差别杀菌法：细菌芽孢较营养体耐热。：细菌芽孢较营养体耐热。诱变处理诱变处理:同一般诱变处理同一般诱变处理.淘汰野生型菌株淘汰野生型菌株：百分之几至千分子几：百分之几至千分子几检出缺陷型检出缺陷型：方法四种方法四种基本培养基基本培养基含诱变处理后菌液的含诱变处理后菌液的基本培养基基本培养基基本培养基基本培养基第1次长出的菌落第2次长出的菌落夹层培养法夹层培养法完全培养基（第完全培养基（第1次
49、培养后，再倒）次培养后，再倒）逐个检出法逐个检出法完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基基本培养基基本培养基影印法影印法限量补充培养法限量补充培养法补充培养基补充培养基(如如0.01%蛋白胨蛋白胨)含菌的基本培养基含菌的基本培养基确定生长谱确定生长谱含菌含菌MM含某生长含某生长因子因子MM三、杂交育种三、杂交育种基因重组是杂交育种的理论基础。前述。基因重组是杂交育种的理论基础。前述。亲本菌株（供体和受体）已知性状；有方向性亲本菌株（供体和受体）已知性状；有方向性四、原生质体育种四、原生质体育种将遗传性状不同的两种菌（种内、间、属间）融合将遗传性状不同的两种菌（种内、间、属间）融合为一个新细胞
50、的技术。为一个新细胞的技术。五、基因工程技术用于工业菌种改良五、基因工程技术用于工业菌种改良基因工程技术：基因操作、基因克隆、DNA重组。将含目的基因DNA片段经体外操作与载体连接，转入一个受体细胞并使之扩增、表达的过程。目的基因目的基因载体选择载体选择体外重组体外重组导入细胞导入细胞筛选筛选鉴定鉴定分离、合成、逆转为分离、合成、逆转为cDNA、PCR扩增等扩增等质粒、噬菌体、病毒质粒、噬菌体、病毒工具酶、连接酶工具酶、连接酶原核细胞（转化、感染等）；真核细胞（微量注原核细胞（转化、感染等）；真核细胞（微量注射法、电穿孔法、基因枪法等）射法、电穿孔法、基因枪法等）抗性等抗性等5.4 微生物菌种
