1、第七章 植物脱毒快繁技术 一、病毒危害 多数栽培植物，尤其多数栽培植物，尤其无性繁殖植物无性繁殖植物，都易受，都易受到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染。例如，到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染。例如，草莓染草莓染60多种病毒。并且随着培养时间的推移，多种病毒。并且随着培养时间的推移，侵染病毒的种类越来越多侵染病毒的种类越来越多。植物病毒病原体可植物病毒病原体可通过维管束传导通过维管束传导。因此，。因此，对无性繁殖的植物来说，一旦感染上病毒之后，对无性繁殖的植物来说，一旦感染上病毒之后，就会代代相传就会代代相传越趋严重越趋严重。受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量
2、产量大大幅度下降，幅度下降，品质品质变劣，甚至完全丧失商品价值。变劣，甚至完全丧失商品价值。病毒的危害给植物生产带来的损失很大，如草莓病病毒的危害给植物生产带来的损失很大，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产扇叶病毒使葡萄减产10101818，花卉病毒的危害一般，花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。变色等。由于病毒对植物造成如此严童的危害，所以世界各由于病毒对植物造成如此严童的危害，所以世界各国都积极开始重视这方面的研究
3、。国都积极开始重视这方面的研究。小麦黄矮病毒病小麦黄矮病毒病 草莓镶脉病毒西瓜病毒病 烟草普通花叶病烟草普通花叶病 目前，对细菌和真菌侵染的病害，可通过药目前，对细菌和真菌侵染的病害，可通过药物处理达到治愈的目的。但还物处理达到治愈的目的。但还没有治病毒的特效没有治病毒的特效药药。种子一般不带病毒，种子繁殖可得无毒植株。种子一般不带病毒，种子繁殖可得无毒植株。但对于无性繁殖植物，但对于无性繁殖植物，必须采取一些特殊方法脱必须采取一些特殊方法脱除病毒。除病毒。无病毒植株培育的意义无病毒植株培育的意义 1.1.去除病毒危害，提高作物品质与产量。去除病毒危害，提高作物品质与产量。采用生物、物理、化学
4、等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。而通过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量。因此，到60至70年代在花卉、蔬菜和果树等得到广泛的应用。2.2.减少环境污染，有利于保护环境减少环境污染，有利于保护环境 栽培去病毒植物可减少药剂的使用。二、脱毒方法 (一)热处理脱毒（一）发现：（一）发现：1889年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗(现证明为病毒病)，放在50-52的热水中保持30min，甘蔗就可去病生长良好。以后此方法被广泛用于防治许多植物的病毒病。热处理又称温治疗法。热处理又称温治疗法。1、热处理脱毒原理：病毒是病毒是DNADNA大分子，病毒进入植大分子，病
5、毒进入植物细胞后，随植物细胞物细胞后，随植物细胞DNADNA一起复制。一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒钝化病毒的活性的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。增殖停止，而失去病毒的侵染能力。热处理是一种物理效应，可加速植物细热处理是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。因此殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细加速分生组织细胞的分裂胞的分裂，能够获得无病毒植株。，能够获得
6、无病毒植株。依据依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利。利用这一差异，选择适当的温度和处理时间，进用这一差异，选择适当的温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。活，并加快分裂和生长。热处理区热处理区低低温温高高温温生长区生长区寄主无损伤寄主无损伤病原微生物被消除病原微生物被消除寄主被杀死寄主被杀死BAC(1)温汤浸渍处理(2)热空气处理 2、热处理脱毒方法（1 1）.温汤浸渍处理温汤浸渍处理 F 适用：适用：休
7、眠器官、剪下的接穗或种植的材料F 方法方法：50左右的温水中浸渍10min至数小时F 特点：特点：方法简便易行，但易使材料受伤。（2.2.）热空气处理热空气处理 F 适用：适用：对活跃生长的茎尖效果较好F 方法：方法：将生长的盆栽植株移人温热治疗室(箱)内，一般在3540下处理几十分钟至数月。处理时间因植物而异，如香石竹于38下处理两个月，其茎尖所含病毒即可被清除。马铃薯在35下处理几个月才能获得无病毒苗。F 特点：特点：热处理方法主要缺陷是并非能脱除所有病毒。例如在马铃薯中，应用这项技术只能消除卷叶病毒。因此热处理需与其他方法配合应用，才可获得良好的脱毒效果。热处理广泛应用于葡萄、草莓、马铃
8、薯和菊热处理广泛应用于葡萄、草莓、马铃薯和菊花等植物。如：葡萄置于花等植物。如：葡萄置于38 可去除扇叶病毒。可去除扇叶病毒。热处理对热处理对葡萄葡萄扇叶病毒、草莓斑驳病毒、苹扇叶病毒、草莓斑驳病毒、苹果花叶病毒等球形病毒有作用，而对另一些病毒果花叶病毒等球形病毒有作用，而对另一些病毒不起作用，因此，必须与茎尖培养相结合脱毒效不起作用，因此，必须与茎尖培养相结合脱毒效果更好。果更好。葡萄扇叶病毒葡萄扇叶病毒苹果花叶病毒苹果花叶病毒1、茎尖培养脱毒原理 2、培养基 3、茎尖培养方法 4、影响微茎尖培养的因素 外植体大小 培养条件 外植体的生理状态（二）茎尖培养脱毒 植物的去病毒技术植物的去病毒技
9、术，实质上就是采取不含，实质上就是采取不含病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的病毒颗粒或病毒颗粒含量甚少的0.10.5mm带带12个叶原基的茎尖个叶原基的茎尖作为外植体，进行微繁作为外植体，进行微繁殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。殖，使其培养成完整的无病毒小植株的技术。1、茎尖培养脱毒原理 病毒在植物体内分布不均匀病毒在植物体内分布不均匀，其数量随植株，其数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域，病毒感染部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域，病毒感染的程度越低，生长点即分生组织（约的程度越低，生长点即分生组织（约0.1-1mm）几乎不含或含病毒很少。几乎不含或含病毒很少。1、植物体、植物体病毒的
10、移动病毒的移动主要靠主要靠2条途径：一是通过维管条途径：一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。细胞不断分裂和活跃的生长速度。2、当植物细胞分裂、当植物细胞分裂DNA复制时，病毒复制时，病毒DNA随着复制。随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。在旺因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。在旺盛分裂的分生组织中，盛分裂的分生组织中，代谢活动很高代谢活动很高，正常核蛋白合成占
11、，正常核蛋白合成占优势，使优势，使病毒无法进行复制病毒无法进行复制。3、茎尖中存在、茎尖中存在高水平内源激素高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。，可抑制病毒的增殖。4、在植物体内存在有一种、在植物体内存在有一种“病毒钝化系统病毒钝化系统”，在分生，在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。分生组织不带病毒分生组织不带病毒，可能有，可能有4方面的方面的原因原因：2、培养基 一般以一般以White、MS为基本培养基，提高钾盐为基本培养基，提高钾盐和铵盐含量有利于茎尖生长。和铵盐含量有利于茎尖生长。MS培养某些植物茎培养某些植物茎尖时，有些离子浓度过高应
12、稀释。尖时，有些离子浓度过高应稀释。在双子叶植物中，激素可能在第在双子叶植物中，激素可能在第2对叶原基中对叶原基中合成，所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，合成，所以茎尖的圆锥组织生长激素不能自给，必须加入生长素与细胞分裂素，浓度要合适。在必须加入生长素与细胞分裂素，浓度要合适。在生长素中应避免用易促进愈伤组织化的生长素中应避免用易促进愈伤组织化的2，4-D，宜用宜用NAA或或IBA；细胞分裂素用细胞分裂素用KT或或BA；GA3对对某些植物茎尖培养有用。某些植物茎尖培养有用。3、茎尖的培养方法 需要一台需要一台解剖镜解剖镜（8-40倍）。倍）。剥离茎尖要剥离茎尖要迅速迅速并尽快接种，或在一个衬
13、有并尽快接种，或在一个衬有无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，无菌湿滤纸的培养皿内进行操作，以防茎尖变干以防茎尖变干。茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严茎尖分生组织由于有彼此重叠的叶原基的严密保护，只要仔细解剖，密保护，只要仔细解剖，(无须表面消毒无须表面消毒)就可得就可得到无菌的外植体。有时消毒处理会增加培养物的到无菌的外植体。有时消毒处理会增加培养物的污染率。污染率。即：叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只即：叶片包被严紧的芽，如菊花、兰花，只须须75%酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，酒精中浸蘸一下，而叶片包被松散的芽，如香石竹、马铃薯等，则要用如香石竹、马铃薯等，则要用0.1%次氯酸钠表
14、次氯酸钠表面消毒面消毒10min。兰花兰花马铃薯马铃薯茎尖长茎尖长（）（）叶原基数叶原基数 小植株数小植株数 脱毒植株脱毒植株数数脱毒率脱毒率（）（）0.120.121 15050242448480.270.272 24242181842.942.90.60.64 464640 00 0离体茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响离体茎尖大小对马铃薯脱毒效果的影响 切取茎尖越小脱毒效果越好，但太小不易切取茎尖越小脱毒效果越好，但太小不易成活，过大又不能保证完全出去病毒，所以成活，过大又不能保证完全出去病毒，所以茎茎尖大小要合适。尖大小要合适。The Apical Meristem 剥取茎尖过程剥取茎尖过
15、程:解剖镜解剖镜下用解剖针将叶片剥掉，下用解剖针将叶片剥掉，解剖针要常消毒解剖针要常消毒。当。当一个半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀一个半圆球的顶端分生组织充分暴露出来之后，用解剖刀片将带片将带1-2个叶原基个叶原基的分生组织切下，接到培养基上。的分生组织切下，接到培养基上。将接种的茎尖置于将接种的茎尖置于22左右温度下。左右温度下。2000-3000lx 16h/d 光照下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能光照下培养。由于在低温和短日照下，茎尖有可能进入休眠；所以进入休眠；所以较高的温度和充足的日照时间必须保证较高的温度和充足的日照时间必须保证。微茎尖需数月才能成功。微茎尖
16、需数月才能成功。茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器茎尖培养的继代培养和生根培养和一般器官的培养相同。官的培养相同。茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。重要的一个途径。4、影响微茎尖成活及脱毒的因素 （1）母体材料病毒侵染程度被单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合感染的较难。被单一病毒感染的植株脱毒较容易，复合感染的较难。（2）外植体大小 在最适培养条件下，在最适培养条件下，外植体的大小外植体的大小决定茎尖的存决定茎尖的存活率，外植体越大，产生再生植株的机会也就越多。活
17、率，外植体越大，产生再生植株的机会也就越多。除了外植体的大小之外，除了外植体的大小之外，叶原基的存在叶原基的存在与否也影响分与否也影响分生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生生组织形成植株的能力，一般认为，叶原基能向分生组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。组织提供生长和分化所必需的生长素和细胞分裂素。（2）培养条件 在茎尖培养中，在茎尖培养中，光下培养光下培养的效果通常比暗培养效果的效果通常比暗培养效果好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时，光高时，光照强度便增加到照强度便增加到4000lx。（3）外植体的生理状态 茎尖最好要由茎尖最好
18、要由活跃生长活跃生长的芽上切取。的芽上切取。取芽的时间也很重要，一般选取芽的时间也很重要，一般选萌动期萌动期较好。否则较好。否则采用适当的处理，打破休眠才能进行。采用适当的处理，打破休眠才能进行。（三）茎尖与热处理相结合方法 能克服单独茎尖培养时，茎尖过小成活率太低，能克服单独茎尖培养时，茎尖过小成活率太低，茎尖太大又脱除不掉病毒的缺点。茎尖太大又脱除不掉病毒的缺点。1、热处理后取较大茎尖培养获得脱毒苗。、热处理后取较大茎尖培养获得脱毒苗。2、取茎尖（或茎段）培养获得无菌苗。然后将试管、取茎尖（或茎段）培养获得无菌苗。然后将试管苗热处理，再取茎尖培养获得脱毒苗。苗热处理，再取茎尖培养获得脱毒苗
19、。（四）其它途径脱毒 1、愈伤组织培养脱毒 2、茎尖微体嫁接 3、化学疗法脱毒 1、愈伤组织培养脱毒 愈伤组织细胞带病原菌不均一，部分细胞不带病愈伤组织细胞带病原菌不均一，部分细胞不带病毒，由这些细胞再生的植株是无病毒的。多次继代的毒，由这些细胞再生的植株是无病毒的。多次继代的愈伤组织中病毒含量下降，甚至检测不出病毒。愈伤组织中病毒含量下降，甚至检测不出病毒。愈伤组织的某些细胞不带病毒原因：愈伤组织的某些细胞不带病毒原因：1、病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；、病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；2、有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。、有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。愈伤组织脱毒的缺陷
20、是植株遗传性不稳定，可愈伤组织脱毒的缺陷是植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株。能会产生变异植株。理由：理由：病毒的复制速度赶不上细胞的增殖速度；有些细胞通过突变获得了抗病毒的抗性。缺点：缺点：植株遗传性不稳定，可能会产生变异植株（二）茎尖微体嫁接（二）茎尖微体嫁接概念：概念：将无病毒茎尖（0.41.0mm）嫁接在培养基上培养的实生砧木上，以获得脱毒苗木的技术。适宜适宜：茎尖培养难以生根的植物，如桃、柑橘、苹果等无病毒茎尖来源：无病毒茎尖来源：成年无病毒植物、温室培养的植物、热处理植物和脱毒试管苗。（三）化学疗法脱毒（三）化学疗法脱毒F 许多化学药品(包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等)对
21、离体组织和原生质体的培养具有脱毒效果。F 常用的药品有：8-氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀稻瘟抗菌素、放线菌素D、庆大霉素等。F 例如，将100ug2-硫脲嘧啶加入培养基可除去烟草愈伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。三、脱毒快繁材料的选择 应注意以下几点：应注意以下几点：1）品种要可靠）品种要可靠 2）要选择经当地栽培确认的高产优质的品种来作）要选择经当地栽培确认的高产优质的品种来作 为脱毒材料为脱毒材料 3）名贵的植物良种）名贵的植物良种 4）植物生长旺盛期，再生率高，脱毒效果好）植物生长旺盛期，再生率高，脱毒效果好 四、植物病毒的鉴定 1、外观判断法 2、指示植物法 3、抗血清鉴定法 4、电子显
22、微镜检查法 5、酶联免疫鉴定法(ELISA)1、外观判断法：带病毒株往往叶片发黄，凹凸不平，畸形，可根据这带病毒株往往叶片发黄，凹凸不平，畸形，可根据这些表现来判断。但有些病毒表现不明显，仅靠这一方法还些表现来判断。但有些病毒表现不明显，仅靠这一方法还不够。不够。2、指示植物检测法：指示植物又称鉴别寄主，指的是对某种或某些特指示植物又称鉴别寄主，指的是对某种或某些特定病毒非常敏感，而且症状表现十分明显的植物。定病毒非常敏感，而且症状表现十分明显的植物。通常不同病毒应选用不同的植物。马铃薯病毒常用指通常不同病毒应选用不同的植物。马铃薯病毒常用指示植物有千日红、曼陀罗、豇豆、辣椒等。示植物有千日红
23、、曼陀罗、豇豆、辣椒等。分为2种 汁液感染法 嫁接检测法千日红千日红曼陀罗曼陀罗豇豆豇豆 3、抗血清鉴定法（抗原抗体反应）原理：由于病毒是由蛋白质和核酸组成的，是一种较原理：由于病毒是由蛋白质和核酸组成的，是一种较好的抗原。将病毒给动物注射后产生抗体。抗原和抗体好的抗原。将病毒给动物注射后产生抗体。抗原和抗体结合产生血清反应。抗原：病毒。抗体：是指生物体在结合产生血清反应。抗原：病毒。抗体：是指生物体在外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，主要存在于外来抗原的刺激下产生的一种免疫球蛋白，主要存在于血清中，含抗体的血清称为抗血清。血清中，含抗体的血清称为抗血清。鉴定方法：鉴定方法：抗原的制备 抗
24、血清的采收，分离把稀释的抗血清与未知的病毒植物的汁液在小试管内混合根据沉淀反应来鉴定病毒种类。植物无病毒苗的培育植物无病毒苗的培育3.3.特点：特点：特异性高（这种抗血清是高度专一性的试剂），测定速度快，一般几小时甚至几分钟就可以完成。所以抗血清法成为植物病毒鉴定中最有用的方法之一。植物无病毒苗的培育植物无病毒苗的培育4 4、电子显微镜检查法、电子显微镜检查法F 病毒有一定的形态（病毒有一定的形态（球状、杆状、线状等）球状、杆状、线状等）和大小（和大小（0.010.3um 0.010.3um）。）。F 采用电子显微镜（分辨率采用电子显微镜（分辨率0.0001um0.0001um）可以）可以直接
25、观察病毒，检查出有无病毒存在，并鉴定病直接观察病毒，检查出有无病毒存在，并鉴定病毒的种类。毒的种类。F 优点：灵敏度高，能在植物粗提取液中定量优点：灵敏度高，能在植物粗提取液中定量测定病毒。测定病毒。5、酶联免疫吸附测定法(ELISA)把抗原把抗原-抗体的抗体的免疫反应免疫反应于于酶的催化反应酶的催化反应相结合而发展相结合而发展起来的一种综合性技术，灵敏度高，特异性强，发展最快起来的一种综合性技术，灵敏度高，特异性强，发展最快应用最广的方法。应用最广的方法。原理：原理：采用酶标记的特异抗体指示抗原采用酶标记的特异抗体指示抗原-抗体的结合，抗体的结合，从而检测样品中的抗原定量测定法。从而检测样品
26、中的抗原定量测定法。操作程序：操作程序：将待检植物汁液注入酶联板（聚苯乙烯多将待检植物汁液注入酶联板（聚苯乙烯多孔微量反应板）中，使抗原吸附在它的孔壁，加入酶孔微量反应板）中，使抗原吸附在它的孔壁，加入酶(过氧化物过氧化物酶或碱性磷酸酶酶或碱性磷酸酶)标记的特异抗体，标记的特异抗体，抗抗原原-抗体充分反应后，清洗，固相载体抗体充分反应后，清洗，固相载体酶联板表面只酶联板表面只留下以酶标记的留下以酶标记的抗原抗原-抗体复合物。加入酶嘚无色底抗体复合物。加入酶嘚无色底物，复合物上的酶催化底物降解，生成有色物。结果物，复合物上的酶催化底物降解，生成有色物。结果可由肉眼识别，也可可由肉眼识别，也可用特
27、殊分光光度计对底物的用特殊分光光度计对底物的降解量进行测定。降解量进行测定。五、快速繁殖 茎尖培养得到的脱毒苗不多，用于生产需扩大繁殖。茎尖培养得到的脱毒苗不多，用于生产需扩大繁殖。扩繁方法：扩繁方法：1）组培快繁）组培快繁 2）无毒苗栽到土壤中进行扩繁。如甘薯、草）无毒苗栽到土壤中进行扩繁。如甘薯、草 莓等利用蔓，马铃薯、姜、蒜等利用地下部分繁莓等利用蔓，马铃薯、姜、蒜等利用地下部分繁殖。为了预防病毒再感染，扩繁应在培育温室或殖。为了预防病毒再感染，扩繁应在培育温室或防虫罩内，因为昆虫传播病毒。防虫罩内，因为昆虫传播病毒。3）两种方法相结合，试管内扩繁，移栽后再）两种方法相结合，试管内扩繁，
28、移栽后再扩繁。扩繁。注意：注意：1、培养变异的产生，应及时去除、培养变异的产生，应及时去除 2、脱毒苗并非永远是无毒苗，由于昆虫等的传播，、脱毒苗并非永远是无毒苗，由于昆虫等的传播，不免会再感染病毒，所以要经常脱毒，一般脱毒苗不免会再感染病毒，所以要经常脱毒，一般脱毒苗用用13代代。脱毒试管苗为原原种繁殖一代为原种原脱毒试管苗为原原种繁殖一代为原种原1代原代原2代代 六、脱毒苗在生产中的应用 脱毒苗用于生产可以明显提高产量和质量，一般产量脱毒苗用于生产可以明显提高产量和质量，一般产量可提高可提高30以上。以上。目前，甘薯、马铃薯、草莓、大蒜、百合花、菊花、目前，甘薯、马铃薯、草莓、大蒜、百合花
29、、菊花、康乃馨等都广泛利用脱毒苗。康乃馨等都广泛利用脱毒苗。小结：脱毒快繁的一般过程 1、诊断：首先了解供试材料感染病毒的种类、诊断：首先了解供试材料感染病毒的种类 2、茎尖培养脱毒或结合热处理、茎尖培养脱毒或结合热处理 3、鉴定、鉴定 4、繁殖、繁殖 5、驯化移植、驯化移植马铃薯微型薯 马铃薯营养繁殖时易受病毒浸染，当条件适合时，病毒就会在植株内增殖，转运和积累，随着世代传递，病毒危害逐年加重，一般造成减产50以上。研究发现，有30多种病毒易感染马铃薯，并引起品种退化，严重影响马铃薯的生产。通过微茎尖组织培养技术能从马铃薯体内脱除PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒。全国现有
30、马铃薯播种面积300多万公顷，且有逐步增加的趋势，每年需合格种薯45亿公斤，脱毒原种4亿公斤，脱毒小薯或微型薯45亿粒。因此，脱毒马铃薯推广具有广阔的市场前景。采用组培技术，通过一定良种繁殖体系，生产优质种薯，是保证马铃薯高产、稳产的一项有效措施。1脱毒种薯生产程序 用微茎尖组织培养法，诱导出苗，联免疫吸附法或指示植物法鉴定马铃薯病毒，经鉴定后无主要病毒的试管苗可定为脱毒试管基础苗。一、马铃薯脱毒技术马铃薯脱毒技术 试管基础苗在无菌条件下，采用固体、液体培养基相结合的方法，进行扩繁基础苗，在防虫网室栽植或封闭温室扦插，生产出原原种（或称脱毒小薯）。用原原种在一定隔离条件下产生原种1代，以后逐级
31、称为原种2代、良种1代、良种2代。2茎尖培养脱毒（1）取材和培养 多采用在室内发芽，芽经热处理(38)2周。然后取顶芽或侧芽1cm的茎尖，自来水冲洗干净，无菌条件下先用70酒精浸润30s，再用2次氯酸钠液浸4-5min，然后用无菌水冲洗3次。消毒芽在解剖镜下仔细逐层剥去幼叶，露出圆滑的生长点，可留1-2个叶原基，0.2-0.3mm，接种于液体培养基:MS+BA0.5+NAA0.1+GA30.2+2%蔗糖，p H值5.8。培养条件：2125、2000-3000 lx、12h/d。3-6月长成2-3cm小芽。(2)继代和生根继代和生根 脱毒苗经ELISA（试剂盒）鉴定后,采用固、液培养基相结合方法
32、扩繁。取试管苗单节切段扦插，每瓶插20个茎段，20d长成5-10cm高小植株，继续切段繁殖，每月可繁58倍。试管苗多节接种进行浅层静止液体培养。培养基:MS+NAA 0.2-0.5+D-泛酸钙10+3%蔗糖，20-25 ，3000-4000LX，14-16h/d，每3周继代一次，单芽茎段约1cm，可插也可平放，原则试管苗用2年-3年。(3)驯化移植驯化移植 3.脱毒苗切繁 基础苗成活后便可切繁，但切繁量的多少和质量的高低，除与水与温湿度条件有关外，正确的切繁方法和适宜的切繁苗龄也非常重要。脱毒苗切繁主要是剪取顶部芽尖茎段（主茎芽尖和腋芽芽尖）直接扦插。微型薯生产：网室内铺6cm蛭石，3%撒可富
33、稀释1倍，喷潮湿即可。插前浇水湿润，插后浇透。覆膜7d，湿度80%以上，期间喷水2次。揭膜后喷营养液3%撒可富，每周2次，每周喷一次0.5%硫酸铜，中后期喷药防病虫，连续喷2-4次。苗高6-8cm培蛭石防绿薯，1-2cm厚，35-40d出现气生薯，不断盖蛭石。二、马铃薯无病毒苗的鉴定材料、马铃薯无病毒苗的鉴定材料1、指示植物鉴定、指示植物鉴定 在马铃薯的病毒鉴定中，汁液鉴定是最常用的方法，病毒、病毒和纺锤块状病毒很容易通过汁液来接种。2、鉴定寄主的准备、鉴定寄主的准备 马铃薯常用的鉴定寄主植物有苋科的千日红，茄科的洋酸浆、毛曼佗罗等。寄主植物应在无虫网室中培养。.接种液制备及接种接种液制备及接种 放置防虫室中，一般510d可发病。三、马铃薯无病毒株的繁殖和保存、马铃薯无病毒株的繁殖和保存 通过茎尖培养只能得到很少的无病毒植株，而生产上需要数以万计的健康种薯。同时无病毒植株并没有对该病毒获得免疫能力，仍会在繁殖中再次侵染。如何在以后繁殖中防止受病毒再侵染是很关键的一环。繁殖主要:()直接块茎繁殖()扦插繁殖()组织培养切段繁殖 A：继代培养 B：低温保存
