1、环境三致物的生物检测环境三致物的生物检测 环境三致物：指能环境三致物：指能致畸、致癌、致突变致畸、致癌、致突变的物质的物质DNA基因基因染色体染色体的作用的作用检测检测DNA损伤，损伤，DNA损伤损伤修复等修复等检测三致物检测三致物对对基因突变，包括正向突变基因突变，包括正向突变和回复突变和回复突变染色体畸变试验；微核试验；染色体畸变试验；微核试验；SCE试验试验特点：时间短、成本低、结果可靠特点：时间短、成本低、结果可靠项目九项目九 蚕豆根尖微核监测技术蚕豆根尖微核监测技术 一、蚕豆根尖微核技术的原理 让我们复习一下细胞有丝分裂的过程吧让我们复习一下细胞有丝分裂的过程吧有丝分裂各时期有丝分裂
2、各时期植物细胞的有丝分裂植物细胞的有丝分裂有丝分列各期图像有丝分列各期图像项目九项目九 蚕豆根尖微核监测技术蚕豆根尖微核监测技术 一、蚕豆根尖微核技术的原理 蚕豆根尖细胞在进行有丝分裂过程中，染色体经蚕豆根尖细胞在进行有丝分裂过程中，染色体经常发生断裂，但一般情况下，断裂可以自行愈合，常发生断裂，但一般情况下，断裂可以自行愈合，如果受到有害因子的攻击，染色体就不能愈合，如果受到有害因子的攻击，染色体就不能愈合，甚至增加断裂，形成染色体片段，这些染色体片甚至增加断裂，形成染色体片段，这些染色体片段由于缺乏着丝点而不能到达细胞的两极，而留段由于缺乏着丝点而不能到达细胞的两极，而留在细胞质中，一旦新
3、细胞核形成，这些片段就形在细胞质中，一旦新细胞核形成，这些片段就形成大小不同的小核，即微核。因此，我们可以根成大小不同的小核，即微核。因此，我们可以根据微核率的高低说明诱变物的强弱。据微核率的高低说明诱变物的强弱。项目九项目九 蚕豆根尖微核监测技术蚕豆根尖微核监测技术二、受试生物材料二、受试生物材料 松滋青皮豆松滋青皮豆，或其他蚕豆品种，或其他蚕豆品种1.蚕豆浸种催芽蚕豆浸种催芽 25，浸泡，浸泡2630h v浸种浸种 v催芽：用纱布松松包裹吸涨的种子置解剖盘内，催芽：用纱布松松包裹吸涨的种子置解剖盘内，保持湿度，在保持湿度，在2525的温箱中催芽的温箱中催芽121230h30h。待种子。待种
4、子初生根露出初生根露出2 23mm3mm，再选取发芽良好的种子，放入，再选取发芽良好的种子，放入铺满薄层湿脱脂棉的解剖盘内，仍在铺满薄层湿脱脂棉的解剖盘内，仍在2525下催芽下催芽363648h48h，当大部分种子的初生根长至，当大部分种子的初生根长至2 23cm3cm时，时，即可用于处理即可用于处理 三、试验步骤三、试验步骤项目九项目九 蚕豆根尖微核监测技术蚕豆根尖微核监测技术2.处理根尖处理根尖 每一处理选取每一处理选取68粒初生根生长良好，根长一致的种粒初生根生长良好，根长一致的种子，放入盛有被测液的培养皿中，让被测液浸泡住根子，放入盛有被测液的培养皿中，让被测液浸泡住根尖即可，用自来水
5、（或蒸馏水）作对照处理，方法相尖即可，用自来水（或蒸馏水）作对照处理，方法相同。处理时间为同。处理时间为46h。3.根尖细胞恢复培养根尖细胞恢复培养 将处理后的种子，用自来水（或蒸馏水）浸洗将处理后的种子，用自来水（或蒸馏水）浸洗3次，次，每次每次23min，然后把洗净的种子再放入湿脱脂棉盘，然后把洗净的种子再放入湿脱脂棉盘中，按前述培养条件恢复培养中，按前述培养条件恢复培养2224h 项目九项目九 蚕豆根尖微核监测技术蚕豆根尖微核监测技术4.根尖细胞的固定根尖细胞的固定 将恢复后的种子，从根尖顶端切下将恢复后的种子，从根尖顶端切下lcm长幼根放入青霉长幼根放入青霉素空瓶中，加卡诺氏液固定素空
6、瓶中，加卡诺氏液固定24h 5.孚尔根（孚尔根（Feulgen）染色）染色(1)固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗固定好的幼根，在青霉素瓶中用蒸馏水浸洗2次，次，每次每次5min(2)吸净残水，再加吸净残水，再加5mol/LHCI将幼根泡住，连瓶放入将幼根泡住，连瓶放入28水浴锅中水解幼根水浴锅中水解幼根25min左右，至幼根被软化即可左右，至幼根被软化即可(3)用蒸馏水浸洗幼根用蒸馏水浸洗幼根2次，每次次，每次5min 项目九项目九 蚕豆根尖微核监测技术蚕豆根尖微核监测技术(4)在暗室或遮光的条件下加席夫（在暗室或遮光的条件下加席夫（Schiff）试剂，染色）试剂，染色14h(5)除去染
7、液，用除去染液，用SO2洗涤液浸洗幼根洗涤液浸洗幼根2次，每次次，每次5min(6)用蒸馏水浸洗用蒸馏水浸洗1次，次，5min(7)将幼根放入新换的蒸馏水中，置将幼根放入新换的蒸馏水中，置4的冰箱内保存，的冰箱内保存，可供随时制片之用。可供随时制片之用。6.制片制片 45%醋酸醋酸压片法压片法项目九项目九 蚕豆根尖微核监测技术蚕豆根尖微核监测技术7.镜检及微核识别标准镜检及微核识别标准 大小是主核大小的大小是主核大小的1/3以下，并与主核分离；以下，并与主核分离；形状为圆形、椭圆形或不规则形；形状为圆形、椭圆形或不规则形；着色与主核相当或稍浅着色与主核相当或稍浅 每一处理观察每一处理观察3个根
8、尖，每个根尖随机计数个根尖，每个根尖随机计数1000个细胞中个细胞中的微核数的微核数 项目九项目九 蚕豆根尖微核监测技术蚕豆根尖微核监测技术五、实验数据的统计处理和污染程度的划分五、实验数据的统计处理和污染程度的划分（一）数据处理（一）数据处理 1.按以下公式计算各测试样品（包括对照组）的微核按以下公式计算各测试样品（包括对照组）的微核千分率（千分率（MCN）MCN=某测试点（或对照组）观察到的某测试点（或对照组）观察到的MCN数数某测试点（或对照组）观察到的细胞数某测试点（或对照组）观察到的细胞数 1002.如果被监测的样品不多，可直接用各样品如果被监测的样品不多，可直接用各样品MCN率平均
9、率平均值与对照比较（值与对照比较（t检验），从差异的显著性判断水质污染检验），从差异的显著性判断水质污染与否与否 项目九项目九 蚕豆根尖微核监测技术蚕豆根尖微核监测技术3.如果被检测的样品较多，可先用方差分析（如果被检测的样品较多，可先用方差分析（F检验）看检验）看各样品的各样品的MCN平均值与对照的差异显著性。平均值与对照的差异显著性。（二）结果评价（二）结果评价 1.利用利用“MCN”进行评价进行评价 30重污染重污染 项目九项目九 蚕豆根尖微核监测技术蚕豆根尖微核监测技术2.利用利用“污染指数污染指数”进行评价进行评价 PI值越高，说明污染越重。值越高，说明污染越重。01.5基本没有污染基本没有污染1.52轻污染轻污染23.5中污染中污染 3.5重污染重污染（三）结果报告（三）结果报告 平均值对照组平均值处理组污染指数000000)(MCNMCNPI
