1、微生物菌种及其复壮与保藏微生物菌种及其复壮与保藏 现代微生物发酵工程研究的内容现代微生物发酵工程研究的内容1菌种的选育和扩大菌种的选育和扩大2最经济地利用营养物最经济地利用营养物，按需确定培养基按需确定培养基3灭菌灭菌4微生物在最优条件下产物的大规模生产微生物在最优条件下产物的大规模生产5发酵产物的提取纯化发酵产物的提取纯化6废物的处理、再生和生产环境的净化废物的处理、再生和生产环境的净化v精选精选 微生物菌种及其复壮与保藏微生物菌种及其复壮与保藏工业生产常用的微生物及工业生产常用的微生物及要求要求菌种的退化与复壮菌种的退化与复壮菌种的保藏菌种的保藏v精选精选工业生产常用的微生物及要求工业生产
2、常用的微生物及要求v 1.细菌细菌:分布最广，数量最多，单细胞原核，分布最广，数量最多，单细胞原核，v 二分裂殖二分裂殖.v 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌-淀粉酶、蛋白酶淀粉酶、蛋白酶v 嗜热乳杆菌嗜热乳杆菌-乳酸乳酸v 醋酸杆菌醋酸杆菌-醋酸醋酸v 棒状杆菌棒状杆菌-氨基酸氨基酸v 短杆菌短杆菌-肌苷酸肌苷酸v精选精选v2.酵母菌酵母菌:单细胞真核，含糖，偏酸，腐生，单细胞真核，含糖，偏酸，腐生，出芽繁殖，假丝出芽繁殖，假丝.v啤酒酵母啤酒酵母-酿酒、细胞色素酿酒、细胞色素C、单细胞蛋、单细胞蛋 白、白、甘油、琥珀酸甘油、琥珀酸v假丝酵母假丝酵母-面包、石油脱蜡、饲料面包、石油脱蜡、饲料v类酵母
3、类酵母-脂肪酶脂肪酶v精选精选v3.霉菌霉菌:丝状真菌丝状真菌v生产菌种生产菌种:根霉，毛霉，犁头霉，红曲根霉，毛霉，犁头霉，红曲霉，青霉等霉，青霉等v产品产品:酶制剂，抗生素，有机酸，甾体酶制剂，抗生素，有机酸，甾体激素激素v精选精选v4.放线菌放线菌:原核生物，原核生物，有机质丰富的，微碱有机质丰富的，微碱性土壤中，性土壤中，无形包子或菌丝片断繁殖。无形包子或菌丝片断繁殖。v生产菌种生产菌种:链霉菌属，小单孢菌属，诺卡菌链霉菌属，小单孢菌属，诺卡菌属等属等v产品产品:链霉素，链霉素，红霉素，金霉素，庆大霉素红霉素，金霉素，庆大霉素等等v精选精选纯净纯净健壮健壮产量产量质量质量稳定稳定2易于
4、控易于控制培养制培养条件条件,周期短周期短3对诱变对诱变剂敏感剂敏感4抗污抗污染力染力强强5原料廉原料廉价价,生长生长迅速迅速,目目的产物的产物产量高产量高6不是不是病原病原菌菌17产物产物分泌分泌型型v精选精选v菌种退化菌种退化：生产菌种或选育过程中筛选出来的较优生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良的菌株，由于进行一种传代或保藏之后，群体中良的菌株，由于进行一种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失减退或完全丧失的现的现象。象。v精选精选退化的表现产物合成能力下降产量下降发酵力或糖化力降低孢子数量变化菌落大小变化生长能力和生长速度变化v精选精
5、选v 1.菌种退化的原因菌种退化的原因退化原因基因突变质粒的脱落培养和保藏条件的影响连续移代v精选精选v 基因突变导致菌种退化：基因突变导致菌种退化：v 自发突变与回复突变自发突变与回复突变 10-7-10-9高产株高产株v精选精选v 质粒脱落导致菌种退化：质粒脱落导致菌种退化：v控制产量的质粒脱落或核内控制产量的质粒脱落或核内DNA和质粒复制不一致。和质粒复制不一致。v连续传代加速退化的发生：连续传代加速退化的发生：大量低产突变株 传代传代个别低产突变株个别低产突变株v精选精选v不良的培养条件：不良的培养条件：如营养成分、温度湿度、如营养成分、温度湿度、pH值、通气量等和值、通气量等和保藏条
6、件保藏条件如营养、含水量、温如营养、含水量、温度、氧气等不仅会诱发低产基因型出现，而且度、氧气等不仅会诱发低产基因型出现，而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化。变化。v精选精选延缓退化了解退化的原因分离纯化科学保藏减少传代v精选精选v 2.菌种退化的防止菌种退化的防止尽量减少传代尽量减少传代v精选精选 1菌种经常纯化菌种经常纯化2创造良好的培养条件创造良好的培养条件3用单核细胞移植传代用单核细胞移植传代4采用有效的菌种保藏方法采用有效的菌种保藏方法v精选精选v 3.菌种的复壮及其方法菌种的复壮及其方法v复壮原理复壮原理v狭义复壮狭义复壮：从大
7、量退化的菌株中分离筛选到那些仍从大量退化的菌株中分离筛选到那些仍保持保持优良性状的个体优良性状的个体v广义复壮广义复壮：在菌种的生产性能尚未退化前就经常有在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行意识地进行纯种分离与生产性能的测试纯种分离与生产性能的测试工作工作v精选精选复壮方法复壮方法v平板划线平板划线v稀释分离稀释分离v涂布分离涂布分离v毛细管分离毛细管分离 纯种分离纯种分离v淘汰法淘汰法宿主体宿主体内复壮法内复壮法低温等条低温等条件处理件处理,使部分退使部分退化菌株死亡化菌株死亡对于寄生性对于寄生性微生物的退微生物的退化菌株化菌株,可通可通过过接种到的接种到的昆虫或动物昆虫或动物寄主体
8、内以寄主体内以提高菌株毒提高菌株毒性性v精选精选v 2.3菌种的保藏菌种的保藏 一.菌种保藏v广义：广义：在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保管，是指达到础上，将它们妥善保管，是指达到不死、不衰、不死、不衰、不污染不污染以便于研究、交换和使用的目的。以便于研究、交换和使用的目的。v狭义狭义：防止菌种退化、保持菌种的生活能力和优防止菌种退化、保持菌种的生活能力和优良的生产性能，尽量良的生产性能，尽量减少、推迟负突变、防止死减少、推迟负突变、防止死亡，并确保不污染杂菌亡，并确保不污染杂菌。v精选精选原理干燥低营养低温v精选精选干干燥燥3液体石蜡
9、2冻冻干干4真真空空5液液氮氮6斜面1v精选精选 (一).斜面保藏法v特点特点：简便有效，易变异，退化甚至死简便有效，易变异，退化甚至死v 亡。亡。v适合适合：不要求长期保藏的及不适合冷冻干不要求长期保藏的及不适合冷冻干v 燥的。燥的。v保存期保存期:3个月个月v精选精选影响保藏效果因素营养略贫乏氮源略多糖类少培养基培养基124培养条件培养条件v精选精选v （二）（二）.液体石蜡油保藏法液体石蜡油保藏法v保存期保存期:2-3年，甚至年，甚至5年传代一次年传代一次.v特别适合特别适合:在固体培养基上在固体培养基上不能形成孢子不能形成孢子的丝状担的丝状担子菌，如大型食用真菌和药用真菌以及镰刀菌、红
10、子菌，如大型食用真菌和药用真菌以及镰刀菌、红曲霉等曲霉等.v注意：保藏温度，液体石蜡需注意：保藏温度，液体石蜡需灭菌和除水灭菌和除水v精选精选（三）（三）.干燥保藏法干燥保藏法适于适于:能产生孢能产生孢子或芽孢的微子或芽孢的微生物生物 沙土沙土麦麸麦麸硅胶硅胶适合产孢子适合产孢子的霉菌和放的霉菌和放线菌线菌适合丝状适合丝状真菌和酵真菌和酵母菌母菌v精选精选砂土沙土管菌种粒度，除钙，除铁及pH。砂和土混合比例：1：1或3：2。121 间歇灭菌3次，每次1-1.5小时埋沙土干法湿法细胞浓度 108-109/ml,0.2-0.3ml/支。抽真空干燥 4小时砂土保藏法砂土保藏法特点特点:经济简便，保存
11、时间长，不易经济简便，保存时间长，不易变异。一般变异。一般2-3年年.v精选精选:用用保护剂保护剂制备菌悬液，制备菌悬液，然后将含菌样然后将含菌样快速降至冰冻状态，减压抽真空，使冰升华成水蒸汽快速降至冰冻状态，减压抽真空，使冰升华成水蒸汽排出，从而使含菌样脱水干燥，排出，从而使含菌样脱水干燥，并在真空状态立即密并在真空状态立即密封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境，封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境，然后置于低然后置于低温下保存。温下保存。v特点特点：不易发生变异，不易发生变异，5-10年。需要冻干机。年。需要冻干机。v适用适用：除了一些不产孢子的丝状真菌外。除了一些不产孢子的丝状真菌外。（四）
12、（四）.冷冻干燥保藏法冷冻干燥保藏法v精选精选v精选精选v1.安剖瓶安剖瓶：2%盐酸浸泡盐酸浸泡7-10h。装入标签，塞上装入标签，塞上棉花，灭菌备用。棉花，灭菌备用。v2保护剂保护剂：选择适合的种类选择适合的种类。v精选精选保护剂减少细胞的损伤和死亡维持细胞的构型重新培养适宜溶解v精选精选成长良好，健壮无污染稳定期高浓度菌种3.菌种制备菌种制备v精选精选v预冻：预冻：防止泡沫溢出，冻结，升华。防止泡沫溢出，冻结，升华。v 不低于不低于-20，30min，疏松状态疏松状态 v 时，转入室温抽时，转入室温抽1h，融封，融封，检测真检测真v 空度，空度，4，避光。避光。4.预冻和真空干燥预冻和真空
13、干燥v精选精选v v v 冻干物呈酥块状或松散片状冻干物呈酥块状或松散片状v v 真空度接近空载时的最高值真空度接近空载时的最高值v v 以等量水作对照以等量水作对照v 干燥终止：干燥终止：v精选精选v恢复培养恢复培养：室温下平衡后，加入最适培养基，室温下平衡后，加入最适培养基，控制溶化速度，操作靠近火焰。控制溶化速度，操作靠近火焰。v避免：避免：样品逸散，污染样品逸散，污染。v精选精选v常温下直接真空干燥。设备简单，操作方常温下直接真空干燥。设备简单，操作方 便。便。v适于适于:预冻后易受冻伤的菌株预冻后易受冻伤的菌株（五）真空干燥法 v精选精选v以甘油、二甲基亚砜等作保护剂，在液氮超低温下
14、以甘油、二甲基亚砜等作保护剂，在液氮超低温下保藏的方法。保藏的方法。v是防止退化的最有效的方法是防止退化的最有效的方法。v适合于各种微生物的保藏适合于各种微生物的保藏。v原理原理：菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来。v（六）（六）.液氮超低温法液氮超低温法v精选精选v保护剂：甘油，二甲基亚砜，糊精，血清蛋保护剂：甘油，二甲基亚砜，糊精，血清蛋白等。白等。v不同微生物的保护剂不同，需实验确定。不同微生物的保护剂不同，需实验确定。v甘油甘油10-20%，二甲基亚砜，二甲基亚砜5
15、-10%v安剖瓶的选择：安剖瓶的选择：95料或料或GG17的玻璃管制成。的玻璃管制成。液氮超低温法液氮超低温法v精选精选v菌种制备和冻结保藏菌种制备和冻结保藏：孢子或菌丝体。孢子或菌丝体。-35 以前以前控制降温速度。控制降温速度。v恢复培养恢复培养:38-40 水中水中v注意防护注意防护：防冻，防爆。防冻，防爆。v精选精选v良好的培养基，新鲜培养的菌种，健良好的培养基，新鲜培养的菌种，健壮的菌体，丰满的孢子，适宜的菌龄壮的菌体，丰满的孢子，适宜的菌龄2严格无菌严格无菌3注意保藏菌种的制备质量注意保藏菌种的制备质量4创造最适宜的保藏条件创造最适宜的保藏条件菌种保藏注意事项菌种保藏注意事项5严格控制传代次数严格控制传代次数6恢复培养时，要移接到保藏以前所用的恢复培养时，要移接到保藏以前所用的同一培养基进行培养同一培养基进行培养v精选精选谢谢谢谢v精选精选
