1、吸光光度法是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一类可见分光光度法可见分光光度法:是根据物质对可见光区某一波长光的吸收程度是根据物质对可见光区某一波长光的吸收程度来确定含量的分析方法。来确定含量的分析方法。与化学分析法相比，主要有以下一些特点：与化学分析法相比，主要有以下一些特点：二、光吸收曲线（吸收光谱或吸收曲线）二、光吸收曲线（吸收光谱或吸收曲线）由图可见，由图可见，KMnO4溶液溶液选择性地吸收了选择性地吸收了525nm附近附近的绿青色光，而对其互补色的绿青色光，而对其互补色光光400nm附近的紫色光几乎附近的紫色光几乎不吸收。故溶液显紫色。不吸收。故溶液显紫色。吸光度最大值对应的波吸光
2、度最大值对应的波长称为该物质的最大吸收波长称为该物质的最大吸收波长。长。nm525max 吸收曲线的形状和最大吸收波长的位置取决于吸收曲线的形状和最大吸收波长的位置取决于物质的分子结构，不同的物质因其分子结构不同而物质的分子结构，不同的物质因其分子结构不同而具有各自特征的吸收曲线，据此也可以进行物质的具有各自特征的吸收曲线，据此也可以进行物质的定性分析。定性分析。对于同一物质，浓度对于同一物质，浓度不同，其吸收曲线的形状不同，其吸收曲线的形状和最大吸收波长的位置不和最大吸收波长的位置不变，只是在同一波长下吸变，只是在同一波长下吸光度随着浓度的增大而增光度随着浓度的增大而增大，据此可以进行物质的
3、大，据此可以进行物质的定量分析。定量分析。显然，在最大吸收显然，在最大吸收波长处测量吸光度的灵波长处测量吸光度的灵敏度最高，因此吸收曲敏度最高，因此吸收曲线是吸光光度法选择测线是吸光光度法选择测量波长的依据。量波长的依据。如果没有其它干扰，如果没有其它干扰，一般都是选择最大吸收一般都是选择最大吸收波长为测量波长。波长为测量波长。三、光吸收的基本定律（三、光吸收的基本定律（朗伯朗伯-比尔定律比尔定律）1、朗伯、朗伯-比尔定律的由来比尔定律的由来 1729年和年和1760年；布格和朗伯：年；布格和朗伯：阐明了物质对光的吸收程度与吸收层厚度之间的阐明了物质对光的吸收程度与吸收层厚度之间的关系。关系。
4、bkA1 1852年；比尔：年；比尔：阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关阐明了物质对光的吸收程度与溶液浓度之间的关系。系。ckA2 由比尔将二者结合起来，就得到布格由比尔将二者结合起来，就得到布格-朗伯朗伯-比尔比尔定律，一般叫做定律，一般叫做朗伯朗伯-比尔定律比尔定律。KbcA2、朗伯、朗伯-比尔定律比尔定律的推导（数学表达的推导（数学表达式）式）(略）略）3、灵敏度的表示方法、灵敏度的表示方法(1)吸收系数吸收系数a（吸光系数（吸光系数a）当液层厚度当液层厚度b以以cm为单位、吸光物质的浓度为单位、吸光物质的浓度c以以gL-1为单位时，为单位时，K用用a表示，称为吸收系数，其单表示
5、，称为吸收系数，其单位为位为Lg-1cm-1。此时朗伯。此时朗伯-比尔定律表示为比尔定律表示为 A=abc(2)摩尔吸光系数摩尔吸光系数 当液层厚度当液层厚度b以以cm为单位、吸光物质的浓度为单位、吸光物质的浓度c以以molL-1为单位时，为单位时，K用用表示，称为摩尔吸收表示，称为摩尔吸收系数，其单位为系数，其单位为Lmol-1cm-1。此时朗伯。此时朗伯-比尔定比尔定律表示为律表示为 A=bc(3)桑德尔灵敏度桑德尔灵敏度S 定义：当光度仪器的检测极限为定义：当光度仪器的检测极限为A=0.001时时（即仪器所能检测出的最小吸光度值），单位（即仪器所能检测出的最小吸光度值），单位截面积光程内
6、所能检出的吸光物质的最低质量，截面积光程内所能检出的吸光物质的最低质量，其单位为其单位为 。S与与的关系：的关系：S=M/2cmg 例题：例题：用邻二氮菲分光光度法测铁。已知溶液中用邻二氮菲分光光度法测铁。已知溶液中Fe2+的浓度为的浓度为500 ugL-1，比色皿厚度为，比色皿厚度为2cm，在，在508nm处，测得吸光度处，测得吸光度A=0.190。求吸收系数。求吸收系数a，摩，摩尔吸收系数尔吸收系数和桑德尔灵敏度和桑德尔灵敏度S。在实际分析中，需作标在实际分析中，需作标准曲线，据准曲线，据A=bc应得一直应得一直线。但情况可能如右图所线。但情况可能如右图所示。示。原因较多：原因较多：有来自
7、仪器有来自仪器方面的；有来自溶液方面方面的；有来自溶液方面的；还有其它方面的，等的；还有其它方面的，等等。等。三、偏离朗伯三、偏离朗伯-比尔定律的因素比尔定律的因素 其主要原因是测定时的其主要原因是测定时的实际情况不完全符合使朗实际情况不完全符合使朗伯伯-比尔定律成立的前提条比尔定律成立的前提条件。件。一、物理因素一、物理因素（主要来自仪器方面）（主要来自仪器方面）1、单色光不纯（非单色光）所引起的偏离、单色光不纯（非单色光）所引起的偏离 朗伯朗伯-比尔定律的重要假设条件之一是入射光比尔定律的重要假设条件之一是入射光为为单色光，但实际上用各种方式从光源分离出来的单色光，但实际上用各种方式从光源
8、分离出来的都是具有一定波长范围的光谱带，以它作为人射都是具有一定波长范围的光谱带，以它作为人射光，就有可能导致对朗伯光，就有可能导致对朗伯-比尔定律的偏离。比尔定律的偏离。2、非平行入射光引起的偏离、非平行入射光引起的偏离 朗伯朗伯-比尔定律要求采用平行光束垂直入射。比尔定律要求采用平行光束垂直入射。若入射光束为非平行光，就不能保证光束全部垂若入射光束为非平行光，就不能保证光束全部垂直通过吸收池，可能导致光束的平均光程大于吸直通过吸收池，可能导致光束的平均光程大于吸收池厚度，实际测得的吸光度将大于理论值，从收池厚度，实际测得的吸光度将大于理论值，从而产生正偏离。而产生正偏离。3、介质不均匀引起
9、的偏离（入射光被散射）、介质不均匀引起的偏离（入射光被散射）朗伯朗伯-比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀非比尔定律要求吸光物质的溶液是均匀非散射的。若溶液不均匀，如产生胶体或发生浑浊，散射的。若溶液不均匀，如产生胶体或发生浑浊，当入射光通过该溶液时，除了一部分被吸收外，当入射光通过该溶液时，除了一部分被吸收外，还有一部分就会因散射而损失，使透射比减小，还有一部分就会因散射而损失，使透射比减小，实测的吸光度偏高。此时该吸光物质的浓度越大，实测的吸光度偏高。此时该吸光物质的浓度越大，对光的散射现象越严重，实测吸光度值偏高得越对光的散射现象越严重，实测吸光度值偏高得越多，从而使标准曲线的上部偏离直线向
10、吸光度轴多，从而使标准曲线的上部偏离直线向吸光度轴弯曲，即对朗伯弯曲，即对朗伯-比尔定律产生正偏离。比尔定律产生正偏离。二、化学因素二、化学因素1、平衡效应、平衡效应2、酸效应、酸效应3、溶剂效应、溶剂效应8-3 可见分光光度计可见分光光度计 分光光度计的种类和型号虽然众多，但基本都由以分光光度计的种类和型号虽然众多，但基本都由以下五部分组成：下五部分组成：一、光源：一、光源：6-12V的低压钨丝灯；的低压钨丝灯；400-2500nm 二、单色器二、单色器(分光系统分光系统):棱镜或光栅棱镜或光栅 三、吸收池：规格有：三、吸收池：规格有：0.5cm,1cm,2cm,3cm四种四种 四、检测系统
11、：光电转换；光电倍增管四、检测系统：光电转换；光电倍增管 五、显示系统：显示信号；吸光度或透光度五、显示系统：显示信号；吸光度或透光度8-4 吸光光度法分析条件的选择吸光光度法分析条件的选择 在光度分析中，一般需先选择适当的试剂与试样中在光度分析中，一般需先选择适当的试剂与试样中的待测组分反应使之生成有色化合物，然后再进行测定。的待测组分反应使之生成有色化合物，然后再进行测定。因此，分析条件的选择包括因此，分析条件的选择包括反应条件反应条件和和测量条件的测量条件的选择。选择。一、显色反应及其条件的选择一、显色反应及其条件的选择（一）显色反应和显色剂（一）显色反应和显色剂1、概念：、概念：显色反
12、应：显色反应：将被测组分转变成有色化合物的反应称将被测组分转变成有色化合物的反应称为显色反应。为显色反应。M+R=MR 显色剂：显色剂：能与被测组分反应使之生成有色物质的试能与被测组分反应使之生成有色物质的试剂称为显色剂。剂称为显色剂。2、显色反应分类：、显色反应分类：可可分为氧化还原反应和络合反应两类。分为氧化还原反应和络合反应两类。3、显色剂分类：、显色剂分类：可分为无机显色剂和有机显色剂两类。可分为无机显色剂和有机显色剂两类。选择显色反应或显色剂的注意事项：选择显色反应或显色剂的注意事项：1、选择性好。、选择性好。2、灵敏度要高。、灵敏度要高。3、对比度要大。指有色化合物与显色剂两者的、
13、对比度要大。指有色化合物与显色剂两者的最大吸收波长的差别要大，一般要求相差最大吸收波长的差别要大，一般要求相差60nm以以上。上。4、有色化合物要稳定，组成要恒定。、有色化合物要稳定，组成要恒定。5、显色反应的条件要易于控制。、显色反应的条件要易于控制。二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择二、吸光光度法的测量误差及测量条件的选择 光度法的误差除各种化学因素外，还有因仪器精光度法的误差除各种化学因素外，还有因仪器精度不够，测量不准所带来的误差。度不够，测量不准所带来的误差。（一（一)仪器测量误差仪器测量误差 仪器测量误差是仪器测量误差是指在测量吸光度或透射比时所产指在测量吸光度或透射比时所产
14、生的误差生的误差。它来源于很多方面。如光源和检测器的。它来源于很多方面。如光源和检测器的不稳定性、吸收池位置的不确定性以及读数的不准不稳定性、吸收池位置的不确定性以及读数的不准确性等。普通分光光度计主要的仪器测量误差是表确性等。普通分光光度计主要的仪器测量误差是表头透射比的读数误差。头透射比的读数误差。光度计的读数标尺上透射比光度计的读数标尺上透射比T的刻度是均匀的，的刻度是均匀的，故透射比的读数误差故透射比的读数误差T(绝对误差绝对误差)与与T本身的大小本身的大小无关，对于一台给定的仪器它基本上是常数，一般无关，对于一台给定的仪器它基本上是常数，一般在在0.002-0.01之间，仅与仪器自身
15、的精度有关。之间，仅与仪器自身的精度有关。但光度分析的目的是通过但光度分析的目的是通过T测得溶液的浓度测得溶液的浓度c，由，由读数误差读数误差T引起的被测组分浓度测量的相对误差用引起的被测组分浓度测量的相对误差用c/c表示表示(其中其中c为浓度的绝对误差为浓度的绝对误差)。（二）测量条件的选择（二）测量条件的选择 1、测量波长的选择、测量波长的选择 2、吸光度范围的控制、吸光度范围的控制 0.150-0.800 3、参比溶液的选择、参比溶液的选择8-5 吸光光度法的应用吸光光度法的应用 一、多组分的同时测定一、多组分的同时测定 依据依据1、吸光度具有加合性；、吸光度具有加合性；2、K=K=()
16、即总吸光度为各个组分吸光即总吸光度为各个组分吸光度的总和度的总和,如右图所示。如右图所示。在每一组分的最大吸收波长下测量总吸光度时，在每一组分的最大吸收波长下测量总吸光度时，它们有下列的关系：它们有下列的关系：两个方程两个方程6个未知数，个未知数，其中四个摩尔吸光系数可其中四个摩尔吸光系数可以从以从M和和N的标准溶液获的标准溶液获得。得。二、差示分光光度法二、差示分光光度法 分光光度法主要用于测定试样中的微量组分。当分光光度法主要用于测定试样中的微量组分。当用用于测定高合量组分时，会产生很大误差。利用用用于测定高合量组分时，会产生很大误差。利用差示分光光度法，就可克服这一缺点。差示分光光度法，
17、就可克服这一缺点。差示光度法差示光度法:是用一个比试液浓度稍低的标准溶是用一个比试液浓度稍低的标准溶液液(Cs)作参比溶液与试样溶液作参比溶液与试样溶液(Cx)进行比较。根据进行比较。根据朗伯朗伯-比尔定律，得：比尔定律，得：As=KbCs Ax=KbCx因因 Cx Cs,两式相减两式相减,得得:Ax-As=Kb(Cx-Cs)=KbC A=KbC即两溶液吸光度之差与浓度之差成正比。用即两溶液吸光度之差与浓度之差成正比。用A对对C作图，可得一条工作曲线。作图，可得一条工作曲线。这就是这就是差示光度法的工作原理。差示光度法的工作原理。三、酸碱离解常数的测定三、酸碱离解常数的测定 如果一种有机化合的
18、酸性官如果一种有机化合的酸性官能团或碱性官能团是发色团的能团或碱性官能团是发色团的一部分，则该物质的吸收光谱一部分，则该物质的吸收光谱随溶液的随溶液的pH值而改变。且可从值而改变。且可从不同不同pH值时所获得的吸光度测值时所获得的吸光度测定该物质的高解常数。定该物质的高解常数。作图法测定离解常数作图法测定离解常数四四、络合物组成的测定、络合物组成的测定1、摩尔比法、摩尔比法（饱和法）（饱和法）设配位反应为设配位反应为 mM+nR=MmRn 此法是固定一种组分此法是固定一种组分(通常通常是金属离子是金属离子M)的浓度，改变的浓度，改变络合剂络合剂(R)的浓度，得到一系的浓度，得到一系列列R/M比
19、值不同的溶液，比值不同的溶液，并配制相应的试剂空白作参比液，分别测定其吸并配制相应的试剂空白作参比液，分别测定其吸光度。以吸光度光度。以吸光度A对对R/M作图。作图。曲线的转折点所对应的横坐标值即为配合物的曲线的转折点所对应的横坐标值即为配合物的配位比。即配位比。即CM:CR=m:n 随着络合剂量逐渐增加，生随着络合剂量逐渐增加，生成的络合物便不断增多。当络成的络合物便不断增多。当络合剂增加到一定浓度时，吸光合剂增加到一定浓度时，吸光度不再增大，如右图所示。度不再增大，如右图所示。图中曲线转折点不敏锐，是由于络合物解离造图中曲线转折点不敏锐，是由于络合物解离造成的。运用外推法得一交点，从交点向
20、横坐标作成的。运用外推法得一交点，从交点向横坐标作垂线，对应的垂线，对应的R/M比值就是络合物的络合比。比值就是络合物的络合比。这种方法简便、快速，对于解离度小的络合物，这种方法简便、快速，对于解离度小的络合物，可以得到满意的结果。可以得到满意的结果。2、等摩尔连续变化法、等摩尔连续变化法 此法的做法是保持此法的做法是保持CM和和CR的浓的浓度保持不变，即度保持不变，即CM+CR=常数，常数，连续改变连续改变CM和和CR的比值，在选定的比值，在选定的仪器条件和波长下测定溶液的的仪器条件和波长下测定溶液的吸光度吸光度A。以以A对对CM/CR+CM作图。作图。等摩尔连续变化法测定络合物组成等摩尔连续变化法测定络合物组成
