1、实验三实验三 植物染色体畸变观察植物染色体畸变观察实验学时：实验学时：6学时学时实验类型：设计性实验类型：设计性每组人数：每组人数：4 实验内容：本实验分实验内容：本实验分2部分进行部分进行1学生自行设计处理方案，用秋水仙素诱发植物学生自行设计处理方案，用秋水仙素诱发植物产生多倍体；产生多倍体；2通过取材、固定、解离、孚尔根染色法制片、通过取材、固定、解离、孚尔根染色法制片、镜检观察；镜检观察；3.找出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细胞，找出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细胞，观察加倍根尖细胞的染色体数目。观察加倍根尖细胞的染色体数目。4学生自行设计处理方案，用化学药剂或特定污学生自行
2、设计处理方案，用化学药剂或特定污染物处理洋葱或蚕豆根尖细胞，观察细胞有丝分染物处理洋葱或蚕豆根尖细胞，观察细胞有丝分裂时染色体畸变（微核、粘连、聚结、断裂等）。裂时染色体畸变（微核、粘连、聚结、断裂等）。2020/10/131一、实验目的一、实验目的1.了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植了解人工诱导植物多倍体的原理、方法及其在植物育种上的意义，并用秋水仙素诱发植物产生多物育种上的意义，并用秋水仙素诱发植物产生多倍体；倍体；2.学会利用学会利用feulgen染色方法鉴定细胞中染色方法鉴定细胞中DNA分布分布及鉴别人工诱导后植物染色体数目的变化；为学及鉴别人工诱导后植物染色体数目的变化；为
3、学习植物遗传育种学和从事有关农作物育种工作奠习植物遗传育种学和从事有关农作物育种工作奠定基础。定基础。3.通过观察染色体压片，找出根尖细胞中期分裂相，通过观察染色体压片，找出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细胞，观察加倍根尖细胞的染色确定诱发成功的细胞，观察加倍根尖细胞的染色体数目。体数目。4学会通过检查染色体畸变情况评价环境污染的学会通过检查染色体畸变情况评价环境污染的细胞遗传学简易方法。细胞遗传学简易方法。2020/10/132 二、实验原理二、实验原理一）、一）、植物多倍体人工诱发原理植物多倍体人工诱发原理 生物的染色体数目一般是相当稳定的，这是物种遗生物的染色体数目一般是相当稳定的，
4、这是物种遗传稳定性的重要特征之一。遗传学上把二倍体生物的传稳定性的重要特征之一。遗传学上把二倍体生物的一个配子的染色体数，称为染色体组。具有两个完整一个配子的染色体数，称为染色体组。具有两个完整染色体组的生物体或细胞称为二倍体，自然存在的生染色体组的生物体或细胞称为二倍体，自然存在的生物多属于二倍体，核内多于两个染色体组的生物体则物多属于二倍体，核内多于两个染色体组的生物体则称为多倍体。其中增加的染色体组来自同一物种或者称为多倍体。其中增加的染色体组来自同一物种或者是源于染色体组加倍，称为同源多倍体。是源于染色体组加倍，称为同源多倍体。自然界存在多倍体物种，此外可通过人工诱导产生自然界存在多倍
5、体物种，此外可通过人工诱导产生多倍体植物。如秋水仙素、对二氯苯等都可用于诱发多倍体植物。如秋水仙素、对二氯苯等都可用于诱发多倍体，其中以秋水仙素效果最好，使用最为广泛。多倍体，其中以秋水仙素效果最好，使用最为广泛。其主要作用原理是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使其主要作用原理是抑制细胞分裂时纺锤体的形成，使染色体不能移向两极而被阻止在分裂中期，这样细胞染色体不能移向两极而被阻止在分裂中期，这样细胞不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。不能继续分裂，从而产生染色体数目加倍的核。2020/10/133二）、孚尔根二）、孚尔根(Feulgen)核染色法原理核染色法原理 细胞内的细胞内的DNA在在1
6、mol/L HCl 60水解时部分地破水解时部分地破坏了脱氧核糖与嘌呤碱基之间的糖苷键而使嘌呤碱坏了脱氧核糖与嘌呤碱基之间的糖苷键而使嘌呤碱基脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的基脱掉，从而使脱氧核糖的第一个碳原子上潜在的醛基暴露。醛基暴露。无色的亚硫酸品红（无色的亚硫酸品红（Schiff试剂）是由偏重亚硫酸试剂）是由偏重亚硫酸钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐钠、盐酸和碱性品红配制成的。偏重亚硫酸钠与盐酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分酸能产生亚硫酸根，当具有醌式结构的碱性品红分子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打开，子与亚硫酸根结合后，醌式结构的共轭双键被打
7、开，碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去碱性品红变为无色。当用这种无色的亚硫酸品红去染色经酸解的细胞时，就会与染色体染色经酸解的细胞时，就会与染色体DNA上游离的上游离的醛基结合，又出现了醌式结构，从而使醛基结合，又出现了醌式结构，从而使DNA着色，着色，使染色体呈现出红色。使染色体呈现出红色。2020/10/134*孚尔根染色法的优点是制片清洁，染色体清晰，孚尔根染色法的优点是制片清洁，染色体清晰，组织软化好，易于压片。其缺点是，染色体较软，组织软化好，易于压片。其缺点是，染色体较软，容易缠绕，不易分散，在加强前处理使染色体缩短容易缠绕，不易分散，在加强前处理使染色体缩短的情况下，可
8、获得较好的效果。的情况下，可获得较好的效果。2020/10/135三）、细胞微核测试原理三）、细胞微核测试原理 微核微核(micronuclei,MCN)是真核类生物细胞中的是真核类生物细胞中的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的一种异常结构，往往是细胞经辐射或化学药物的作用而产生的不可逆遗传损伤。作用而产生的不可逆遗传损伤。一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断一般认为微核是由有丝分裂后期丧失着丝粒的断片产生的，整条染色体或几条染色体也能形成微片产生的，整条染色体或几条染色体也能形成微核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子核。这些断片或染色体在细胞分裂末期被两个子细胞核所排斥便
9、形成第三个核块。即在间期细胞细胞核所排斥便形成第三个核块。即在间期细胞形成时，核附近出现的一到几个很小的圆形结构，形成时，核附近出现的一到几个很小的圆形结构，直径大约是主核直径大约是主核1/3以下呈圆形、椭圆形或不规则以下呈圆形、椭圆形或不规则形，这就是微核（形，这就是微核（micronucleus）微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各新药试验、染色体遗传疾病及癌症前期诊断等各方面方面,是一种比较理想的方法。是一种比较理想的方法。2020/10/136三、材料及用品三、材料及用品1、材料、材料洋葱洋葱
10、/大蒜（大蒜（2n=16），刮去老根，放在小烧杯上，），刮去老根，放在小烧杯上，加水至刚与根部接触为止，室内培养至新根长出加水至刚与根部接触为止，室内培养至新根长出0.51.0cm左右。分左右。分2组分别用于多倍体诱发和微组分别用于多倍体诱发和微核测试。核测试。2、器具及药品、器具及药品(1)器具器具恒温培养箱，电热恒温水浴槽，显微镜，磨口带恒温培养箱，电热恒温水浴槽，显微镜，磨口带塞试管，镊子，刀片，载玻片，盖玻片，吸水纸。塞试管，镊子，刀片，载玻片，盖玻片，吸水纸。(2)药品药品0.01%0.05%的秋水仙素水溶液，卡诺氏固定的秋水仙素水溶液，卡诺氏固定液，液，1mol/L HCL，希夫（
11、，希夫（Schiff）试剂，）试剂，10%偏重偏重亚硫酸钠，亚硫酸钠，1%醋酸洋红等醋酸洋红等2020/10/137四、实验内容和步骤四、实验内容和步骤（一）、实验内容之一：（一）、实验内容之一：1.用秋水仙素诱发植物产生多倍体；用秋水仙素诱发植物产生多倍体；2.通过取材、固定、解离、孚尔根染色法制片、通过取材、固定、解离、孚尔根染色法制片、镜检观察。以室温酸解洋葱根尖材料与镜检观察。以室温酸解洋葱根尖材料与60 C酸酸解做对照，用醋酸洋红解做对照，用醋酸洋红/改良石碳酸品红染色方改良石碳酸品红染色方法与孚尔根染色法作对照；法与孚尔根染色法作对照；3.找出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细找
12、出根尖细胞中期分裂相，确定诱发成功的细胞，观察加倍根尖细胞的染色体数目。胞，观察加倍根尖细胞的染色体数目。4.实验内容之二：实验内容之二：5.学生自行设计处理方案，用化学药剂或特定污学生自行设计处理方案，用化学药剂或特定污染物处理洋葱或大蒜根尖细胞，观察细胞有丝染物处理洋葱或大蒜根尖细胞，观察细胞有丝分裂时染色体畸变（微核、粘连、聚结、断裂分裂时染色体畸变（微核、粘连、聚结、断裂等）。等）。2020/10/138（二）、（二）、实验步骤实验步骤内容之一内容之一 植物多倍体人工诱发及鉴定植物多倍体人工诱发及鉴定1根尖培养根尖培养将洋葱或大蒜刮去老根，室内水培养至新根长出将洋葱或大蒜刮去老根，室内
13、水培养至新根长出0.51.0cm左右。左右。2多倍体诱导多倍体诱导当洋葱或大蒜新根长至当洋葱或大蒜新根长至0.51.0cm左右时，用含左右时，用含0.010.05%秋水仙素的水溶液，置阴暗处培养秋水仙素的水溶液，置阴暗处培养4h2d，及时观察，至根尖膨大为止，再恢复生长，及时观察，至根尖膨大为止，再恢复生长（学生查阅资料，自主设计秋水仙素浓度梯度和时（学生查阅资料，自主设计秋水仙素浓度梯度和时间梯度处理洋葱根尖）。间梯度处理洋葱根尖）。2020/10/1393固定固定恢复生长的根尖用蒸馏水冲洗并用卡诺氏固定液恢复生长的根尖用蒸馏水冲洗并用卡诺氏固定液(无水乙醇无水乙醇:冰醋酸冰醋酸=3:1)固
14、定固定224h备用。备用。4解离解离固定好的根尖，加入适量预热的固定好的根尖，加入适量预热的1 mol/L盐酸，盐酸，60 C水浴水浴8-10分钟。分钟。同时以室温下的盐酸解离根尖同时以室温下的盐酸解离根尖作对照。作对照。5染色染色将解离过的材料水洗将解离过的材料水洗3次，吸净水分，加入希夫次，吸净水分，加入希夫试剂，盖好磨口试管塞，染色试剂，盖好磨口试管塞，染色10分钟（在黑暗条件分钟（在黑暗条件下处理）。下处理）。以室温下酸解和以室温下酸解和1%醋酸洋红染色作对照。醋酸洋红染色作对照。6 漂洗漂洗希夫试剂染色后，先用蒸馏水冲洗，再用漂洗液希夫试剂染色后，先用蒸馏水冲洗，再用漂洗液密封漂洗密
15、封漂洗3次，每次次，每次25分钟，再水洗分钟，再水洗23次。次。2020/10/13107 压片压片取根尖置于载玻片上，取分取根尖置于载玻片上，取分生区组织长约生区组织长约0.5mm，压碎，压碎，加盖玻片，覆以吸水纸压片；加盖玻片，覆以吸水纸压片；必要时敲击盖玻片以利分散。必要时敲击盖玻片以利分散。8观察观察低倍镜下寻找染色体分散良低倍镜下寻找染色体分散良好的分裂相，换高倍镜观察并好的分裂相，换高倍镜观察并计数染色体数目，鉴别染色体计数染色体数目，鉴别染色体加倍的细胞和未加倍的细胞。加倍的细胞和未加倍的细胞。2020/10/1311内容之二内容之二 植物细胞的微核检测植物细胞的微核检测 1、根
16、尖培养：将洋葱或大蒜刮去老根，室内水培养至、根尖培养：将洋葱或大蒜刮去老根，室内水培养至新根长出新根长出0.51.0cm左右。左右。2、处理根尖：阳性检测采用、处理根尖：阳性检测采用 CrO3/NaN3/EMS，另外另外自我设计自我设计1-2种测试物，种测试物，对照用自来水对照用自来水/蒸馏水处理，蒸馏水处理，处理时间处理时间24h。（必要时测试物浓度需稀释，以免根尖腐烂）（必要时测试物浓度需稀释，以免根尖腐烂）3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次次，每次2-3min，洗净后在水中恢复培养，洗净后在水中恢复培养24h。4、固定、固定(8:0010
17、:00；14:3016:30)：用甲醇：冰醋：用甲醇：冰醋酸（酸（3：1）固定液固定）固定液固定24h后弃去固定液，或换入后弃去固定液，或换入70酒精中保存。酒精中保存。5、酸解：弃去固定液，用清水漂洗、酸解：弃去固定液，用清水漂洗2-3次，吸净水，加次，吸净水，加入入16 mol/L盐酸，于室温解离盐酸，于室温解离10min，弃去盐酸，弃去盐酸，漂洗根尖漂洗根尖2-3次，彻底洗净盐酸。次，彻底洗净盐酸。6、染色：截下、染色：截下0.5-1mm长的根尖，滴加石炭酸品红染长的根尖，滴加石炭酸品红染液，染色液，染色10min，加盖玻片，压片观察、统计。，加盖玻片，压片观察、统计。2020/10/1
18、3127、统计计算、统计计算微核千分率：微核千分率：MCN=（观察到的微核细胞（观察到的微核细胞数数/观察的细胞总数）观察的细胞总数）1000染色体畸变率：染色体畸变率：CAF=（染色体畸变细胞数（染色体畸变细胞数/分裂期的染色体细胞数）分裂期的染色体细胞数）1002020/10/1313五、实验结果五、实验结果1.染色体记数，区分染色体加倍和未加倍的染色体记数，区分染色体加倍和未加倍的细胞；细胞；2.绘出所观察到的多倍体细胞的显微观察图；绘出所观察到的多倍体细胞的显微观察图；3.总结说明秋水仙素诱导洋葱根尖多倍体的总结说明秋水仙素诱导洋葱根尖多倍体的最佳浓度和时间。最佳浓度和时间。4.绘制细
19、胞微核实物图；绘制细胞微核实物图；5.每个根尖统计每个根尖统计1000个细胞，计算每一处理个细胞，计算每一处理（3个根尖）的平均微核千分率。个根尖）的平均微核千分率。2020/10/1314六、思考题六、思考题1秋水仙素诱导多倍体的原理是什么秋水仙素诱导多倍体的原理是什么?2根尖经秋水仙素处理之后为什么会发生膨根尖经秋水仙素处理之后为什么会发生膨大大?3对照对照feulgen染色中用热盐酸处理与否的染色中用热盐酸处理与否的镜检结果之异同，说明水解时间和温度对镜检结果之异同，说明水解时间和温度对染色效果的影响。染色效果的影响。4分析醋酸洋红分析醋酸洋红/卡宝品红染色和孚尔根染卡宝品红染色和孚尔根
20、染色效果之异同。色效果之异同。5.在大蒜在大蒜/洋葱根尖细胞微核检测中为什么要洋葱根尖细胞微核检测中为什么要恢复培养？恢复培养？2020/10/1315七、注意事项七、注意事项1Schiff试剂及时取放，及时清洗吸试剂及时取放，及时清洗吸Schiff试剂的吸管。试剂的吸管。2黑暗条件下染色。黑暗条件下染色。3漂洗时要盖好磨口试管塞。漂洗时要盖好磨口试管塞。4用于压片的材料不可太多。用于压片的材料不可太多。5.你怎样看待对照组出现的微核？你怎样看待对照组出现的微核？2020/10/1316谢谢您的指导THANK YOU FOR YOUR GUIDANCE.感谢阅读！为了方便学习和使用，本文档的内容可以在下载后随意修改，调整和打印。欢迎下载！汇报人：XXXX日期：20XX年XX月XX日17
