1、 微生物检验基本要求微生物检验基本要求内 容n微生物学基本知识n微生物学检验技术n微生物学实验室的质量保证n微生物学实验室的生物安全微生物基本知识u微生物的概念u微生物的种类u微生物的特点u微生物学的主要分支学科微生物基本知识 微生物的概念 是一群形体微小、结构简单的低等生物的统称。需借助光镜或显微镜 测量单位为微米或纳米微生物基本知识u微生物的种类真核细胞型：(eucaryotae)真菌（霉菌、酵母、蕈类)、藻类原核细胞型：(procaryotae)细菌、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体、螺旋体 非细胞类：（no cell)病毒、类病毒、朊病毒等微生物的相对大小可见范围肉眼光学显微镜电镜真
2、核细胞型原核细胞型病 毒 微生物的特点 体积小，面积大 吸收多，转化快 生长旺，繁殖快 适应强，变异频 分布广，种类多微生物基本知识 体积小 面积大n微生物的个体极其微小 必须借助显微镜放大几倍、几百倍、上千倍，乃至数万倍才能看清。表示微生物大小的单位是微米（1米106微米）或纳米（1米109纳米）。如：n杆菌的宽度是0.5微米，80个杆菌“肩并肩”地排列成横队，也只有一根头发丝的宽度。n杆菌的长度约2微米，故1500个杆菌头尾衔接起来仅有一颗芝麻长。吸收多 转化快n如大肠杆菌在合适条件下，每小时可以消耗相当于自身重量2000倍的糖 而人要完成这样一个规模则需要40年之久 生长旺 繁殖快大肠杆
3、菌大肠杆菌(E.coliE.coli)37培养在牛奶中，12.5 min即可分裂一次；一 般培养液的菌浓度为108-109个/ml如各方面的条件都合适，大肠杆菌每12.5-20（有说20-30）分钟分裂一次按20分钟来算，则1昼夜分裂72次，那么1个菌体就会产生272（即4722366500万亿）个，重达4722吨 适应强 变异频耐热：在250-300的高温条件下正常生长 耐寒：多数细菌能耐0到196的低温 耐盐：嗜盐细菌甚至能在饱和盐水中正常生活 耐干：产芽孢细菌和真菌孢子在干燥条件下能 保藏几十年、几百年甚至上千年 耐酸 耐碱 耐压:突变频率一般为10-5-10-10 分布广 种类多在地球
4、上几乎无处不有，无孔不入 85公里的高空、11公里深的海底、2000米深的地层、近100（甚至300）的温泉、零下250的环境下，均有微生物存在微生物种类繁多 迄今为止，微生物约有10万种，估计目前已知的种只占地球上实际存在的微生物总数的20%微生物学的主要分支学科一、微生物学检验的目的 临床微生物检验：为诊断提供病原学依据 为治疗提供参考用药的信息 为医院感染提供病原微生物及其耐药性动态信息 改进或更新临床微生物学检验的方法 卫生微生物检验：判断水、空气、食品、日用品以及各类公共场所的卫 生状况 指标性微生物微生物学检验技术指标性微生物 指标菌可以归纳为以下三种类型：一般卫生状况指标菌 最常
5、用的是菌落总数、霉菌和酵母菌总数意义：评价被检样品的一般卫生质量、污染程度以及安全性 粪便污染指标菌 主要指大肠菌群，其他还有肠球菌、产气荚膜梭菌、噬菌体以及脊髓灰质炎病毒等意义：标志着检品受过人、禽畜粪便的污染，同时也可表明有肠道致病菌存在的可能指标性微生物 致病菌（控制菌）包括某些特定环境不能检出的菌类食品、化妆品或药品等样品中规定一些不得检出的致病菌例如 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、破伤风芽胞杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森菌、空肠弯曲菌、溶血性链球菌、肉毒梭菌、产气荚膜梭菌、蜡样芽胞杆菌等 食品卫生微生物检验n一般卫生状况指标菌检验 菌落总数、霉菌和酵母菌n粪
6、便污染指标菌检验 大肠菌群、类大肠菌群n控制菌检验 沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、蜡样芽胞杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、肉毒梭菌及肉毒毒素、产气荚膜梭菌、椰毒假单胞菌酵米面亚种、单核细胞增生李斯特氏菌、变形杆菌 化妆品卫生微生物检验u一般卫生状况指标菌检验 菌落总数检测 霉菌和酵母菌检测u粪便污染指标菌检验 粪大肠菌群检验u控制菌检验 绿脓杆菌检验 金黄色葡萄球菌检验微生物学检验技术三、标本采集与处理不同的样品采集、保存、运送的要求都是不同的标本采集原则无菌操作 无菌采集、采样用具、容器必须要经过灭菌处理 早期 安全 足量 采样前、
7、后都应及时做好标记 采集的样品要有代表性采样后应及时将样品送到微生物检验室标本的运送n标本采集后最好及时运送到实验室n若不能，应储存在合适的一定环境条件 细菌:病毒:n感染性样本应注意安全防护n运送过程防止泄漏和破碎微生物检验技术四、微生物学检查n 形态学检查n 人工培养:接种 分离纯化 培养技术 分离鉴定及增菌培养 毒力鉴定及抗菌药物敏感试验n 生化试验n 免疫检测技术：抗原检测 抗体检测n 核酸检测技术：核酸分子杂交 PCRn 动物试验n 自动化技术形态学检查 直接镜检显微镜观察：光学显微镜 电镜人工培养分离培养与鉴定：革兰氏染色阴性成鱼群状排列的弧菌 霍乱弧菌接种技术分离纯化技术培养技术
8、霍乱分离培养n分离用的培养基有强、弱2种选择培养基n弱选择培养基弱选择培养基：碱性琼脂和碱性胆盐琼脂n强选择培养基：强选择培养基：常用的有庆大霉素琼脂、4号琼脂和TCBS琼脂等n现多采用碱性蛋白胨水增菌，再用强选择培养基进行分离生化试验霍乱红试验 阳 性霍乱弧菌氧化酶试验 粘丝试验靛基质试验免疫检测技术n抗血清凝集技术n乳胶凝集实验 n荧光抗体检测技术 n协同凝集试验（COA）n酶联免疫测试技术 微生物检验技术 霍 乱 检 验 程 序分子生物学检测n核酸探针杂交技术 nPCR技术:PCR&RT-PCR Real-time PCR Q复制酶法 连续扩增反应法（Lar）转录放大系统（TAS/3SR
9、/NASBATM）放大信号检测法 分子生物学技术在病原菌检测上的应用 n细菌:沙门氏菌 李斯特杆菌 葡萄球菌 假单胞菌属 大肠杆菌 志贺氏菌 耶尔森氏菌 弯曲杆菌 弧菌n病毒:流感&禽流感 肝炎 SARS Norovirus Adenovirus Enterovirus Dengue virus Rinovirus 自动化技术微生物自动鉴定微生物自动鉴定商品名称商品名称 分析手段分析手段 生产商生产商 AutomicrobicBiochemical testsBioMerieux Vitek,Hazelwood,MO Bactometer ConductanceBioMerieux Vitek
10、,Hazelwood,MO ATB Carbon assimilationBioMerieux Vitek Hazelwood,MO VIDAS Automated EIAcBioMerieux Vitek Hazelwood,MO MIS Fatty acid profileMicrobial ID Newark,DEMaalthusd ConductanceRadiometer America Westlake,OH Sensititre Fluorogenic dnzyme Reactions Radiometer America Westlake,OH Biolog Carbon ut
11、ilizationBiolog Hayward,CAWalkAway BiochemicalBaxter Diagnostics W.Sacramento,CAAutoSCAN BiochemicalBaxter Diagnostics W.Sacramento,CA ALADIN BiochemicalAnalytab Products Plainview,NY UniSceptBiochemicalAnalytab Products Plainview,NY AutoSceptor BiochemicalBecton Dickinson Cockeysville,MD n微生物实验室质量保
12、证的措施 室内质控 室间质评n微生物实验室质量保证的目标 可靠性 可重复性 实际效果 及时性微生物检验中的质量保证 及实验室管理过程控制文件过程控制文件微生物学检验过程试验试验过程控制过程控制样品采集样品采集样品标记样品标记样品运输样品运输培养基培养基染料染料仪器仪器样品接收样品接收 和登记和登记检验检验分析分析研究研究准备准备相关检相关检验报告验报告试剂试剂熟练程度熟练程度微生物检验的质量控制试验试验前前试验试验中中试验试验后后正确的病人正确的取样正确的条件适当的仪器适当的仪器合适的试验材料合适的试验材料正确的方法正确的方法正确的资料合适的时间微生物培养基的质量控制检测所有培养基的性能检测所
13、有培养基的性能自行配制：所有批次自行配制：所有批次商业制备：只检测新批号商业制备：只检测新批号培养基质量要求n微生物污染n生长特性n生长率 n选择性 n生理生化特性n选择性和特异性n外观、色泽和均一性n琼脂凝胶的硬度n水份含量npH n缓冲能力 对培养基进行质量对培养基进行质量控制的主要内容控制的主要内容培养基的质量控制n检查 pH，无菌性，支持生长的能力，培养基的选择或抑制特性(目标微生物生长，非目标微生物不生长)，生化反应，琼脂凝胶的硬度，水份含量，外观和色泽的均一性n检测频率n检测各个批次或各批号n将结果记录在培养基质量控制表格 含人血的血平板含人血的血平板 不适于微生物检测不适于微生物
14、检测配制培养基时的质量控制F 严格按培养基配方和培养基配制操作程序进行配制F 每批培养基均应有配制记录 如名称、配制量（各种成分用量）、配制者、配制日期、有效期 以及性能和无菌试验F无菌实验:配制培养基时的质量控制F性能试验 F培养基的储存 应放在冷暗、干燥处 含有血液和其他有机添加剂 抗菌素的培养基要储存在冰箱里培养基的贮存 培养基种类 保存条件 保存时间三角瓶（棉塞）培养基 室温 一周三角瓶（螺旋盖）培养基 室温 三周平板培养基 室温 当天平板培养基（装袋密封）4 一周培养基使用中应避免的问题污染了的培养基已失水的培养基使用过期的培养基培养基配制记录的快速提示 实验室制备的所有培养基都必须
15、记录：配制日期和配制人培养名称，批号，培养基粉名称所配平板、试管、瓶的数量分装的批号颜色、一致性、外表 用于质量控制的平板数量 24/48小时无菌实验 生长实验培养基的pH我国培养基相关标准1.YYT 0557-2005 营养琼脂培养基2.YYT 0578-2005 沙门、志贺菌属琼脂培养基3.SNT 1538.1-2005 培养基制定指南 第一部分：实验室培养基制备质量保证通则4.SNT 1538.1-2007 培养基制定指南第2部分:培养基性能测试实用指南M-H琼脂板的质量控制n无菌（每批平板随机选择一个样本作无菌试验，培养48-72h）n厚度：4mm，且厚度必须均匀（9cm平板倾注琼脂量
16、25-30ml；16cm平板需60ml左右）n调节pH到7.2-7.4（pH过低-氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。）n胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的影响：含过量的胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶的培养基可能逆转磺胺类甲氧苄氨嘧啶的抑菌效应，使抑菌圈模糊变小，甚至消失。n用TMP-SMZ纸片可测定培养基中的磺胺嘧啶得含量，当抑菌圈清晰、直径20mm，说明该培养及合格n二价阳离子含量变化的影响nCa+、Mg+：影响氨基糖苷类、四环素的抑菌圈nZn+：影响碳头孢烯类n平板表面应干燥：使用前干燥平板n平板有效期为5天n使用含血的M-H培养基特别注意项M-H琼脂板的质量控制诊断血清的质量控制n注明收到的日
17、期，如为冻干制品，还应注明配成水溶液的日期 n使用前检查外观应清澈，如出现混浊则表示已被杂菌污染 n使用时应注意各种诊断血清的有效期和效价n每月用标准菌株试验其敏感性和特异性 染色液的质量控制n染色液配制后，必须用适当的标准菌株作阳性及阴性对照试验n在使用期内每隔一段时间进行监测n其监控频率随染色液的稳定性和使用频率而定 染液的质量控制n革兰氏染料质量控制n使用革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株n析出晶体检测n污染细菌检测 n定期参加能力验证n进行实验室内比对 n其他染料n抗酸性染色n真菌的KOH染色n吖啶黄n肠道寄生虫染色疟疾涂片染色 染料和试剂准备标签内容 名称 浓度 制备日期 使用时间 过期时间
18、/保质期 制备者 质量控制菌株n什么是质控菌株？n在染液和培养基中有预期反应的已知菌株n菌株的来源？nATCC American Type Culture Collection美国菌种保藏中心nNTCCNational Type Culture Collection(UK)国际菌种保藏中心(英国)nCIP Pasteur Institute Collection(France)巴斯德保藏中心(法国）n质控菌株如何使用？n确保培养基，试剂和用品有预期的效能 n设置阴性和阳性对照株 质控菌株的保存n储备检测所有培养基和实验系统的质控菌株 n例如：n大肠杆菌(ATCC#25922)麦康凯培养基或EM
19、B，药敏试验n金黄色葡萄球菌(ATCC#25923)血琼脂，甘露醇高盐琼脂培养基，药敏试验n淋病奈瑟氏菌(ATCC#49226）巧克力培养基，T-M培养基n所需要的其他质控菌株质控菌株的使用在每批培养基及新的药敏片使用时同时做质控，标准菌株的抑菌环或MIC值在标准范围内nE.coli ATCC 25922 nS.aureus ATCC 25923nP.aeruginosa ATCC 27853根据抑菌环直径分析变化n根据你的检测使用不同的标准株（ATCC,IP或其他）药敏试验常用质控菌株常规药敏标准菌株n大肠埃希菌ATCC 25922n金黄色葡萄球菌ATCC 25923n铜绿假单胞菌 ATCC
20、 27853n流感嗜血杆菌 ATCC 49247 ATCC 49766n肺炎链球菌ATCC 49619-内酰胺酶（ESBLs）测定标准菌株 肺炎克雷伯菌 ATCC 700603，大肠埃希菌 ATCC 35218培养基磺胺嘧啶测定标准菌株 粪肠球菌 ATCC 29212仪器设备-微生物学n监控温度n培养箱n冰箱n冷冻柜 n进行功能检测n移液器n高压锅n酸度计n秤重n保存记录显微镜 保持镜头清洁保持镜头清洁保证至少一个油镜保证至少一个油镜 (X100)(X100)使用转扭调节镜头使用转扭调节镜头非油镜不要浸入油中非油镜不要浸入油中 移动样本时不能使样本高于镜头移动样本时不能使样本高于镜头确保照明系
21、统确保照明系统 消毒与灭菌培养基培养基试剂试剂材料材料废物废物灭菌（Sterilization）：杀灭物体上所有的微生物（包括病原体和非病原体的繁殖体和芽胞）的方法消毒(Disinfection）：杀灭病原微生物的方法两阶段灭菌控制过程控制 化学指示剂 生物指示剂灭菌产品控制 生长实验 (生物验证）灭菌指示物高压湿热灭菌指示胶带（121，132）干热灭菌指示胶带环氧乙烷灭菌指示胶带射线灭菌指示标签生物指示剂 灭菌指示物化学指示物 仅指示灭菌温度，但不涉及灭菌时间和压力生物学指示物指示灭菌需要的温度、时间和压力注意注意：指示物在以下情况下不保证灭菌的效果：指示物在以下情况下不保证灭菌的效果：高压
22、锅内东西放的过多；高压锅内东西放的过多；培养液培养液体积过大；体积过大；灭菌后的生物验证试验灭菌后的生物验证试验十十分重要分重要药敏实验为选择合适的抗生素进行治疗提供依据 监测耐药趋势体外药敏实验无明显的生长无明显的生长有明显的生长有明显的生长敏感敏感不敏感不敏感药物药物目标菌目标菌肉汤稀释法肉汤稀释法药敏试验中可能出现的错误n培养基不好太陈旧，厚度，pHn过期或保存不当的药片 活性降低n错误的接种 细菌接种量太多或太少n错误的孵育 温度太热/太冷，时间 太长/太短n错误的仪器设备 读错区带n错误的解释 曲解区带 药敏检测 孵育条件、温度和时间n肠杆菌科：35 2，空气，16-18hn葡萄球菌
23、属：33-35,空气，16-18h，苯唑西林和万古霉素需24h观察n肠球菌属：35 2 ，空气，16-18h，万古霉素需24h观察n嗜血杆菌属：35 2，5%CO5%CO2 2 16-18hn链球菌属：35 2，5%CO5%CO2 2，20-24h药敏实验的质量控制n质控菌株必须有可靠的来源 n使用特定的质控菌株去检测不同的药物-目标菌组合 n按照厂家的说明储存抗生素试剂 药敏试验质量控制培养基培养基抗生素抗生素菌液菌液培养箱培养箱菌种菌种药片药片M-H培养基培养基保存温度保存温度McFarland 0.5(108 bacteria/ml)温度温度 气压气压 保存条件，使用要求保存条件，使用要
24、求保存条件（温度、干燥）保存条件（温度、干燥）ATCC标准株，标准株，4mm厚，厚，pH-20oC 以下以下 分光光度计检测分光光度计检测 标准的温度计气压计标准的温度计气压计标准菌株、待测菌株标准菌株、待测菌株纸片分配器n优点优点n实用，快速实用，快速 n提高了可重复性提高了可重复性 n缺点缺点n增加污染的机会增加污染的机会n降低了人员判断技能等降低了人员判断技能等n保存保存n使用之后，放回冷藏箱，使用之后，放回冷藏箱，朝上放置。朝上放置。操作者的熟练度n常规的能力验证 n室内实验程序n完全按照SOP进行实验操作质量控制：免疫学-血清学n针对抗原-抗体检测试验n每天至少有一次试验带上阳性和阴
25、性对照。包括弱阳性对照 n所有孵箱，摇床和离心机的功能监控 质量控制：分子诊断n样品采集，运输和处理n保证所有上述过程中核酸的完整性 n控制污染n在无DNA区域，配制试剂后进入样本处理区，再进入扩增和检测区；并保持这一单向流程 n阳性和阴性对照n参考：感染性疾病的分子诊断方法 目的：存活，不丢失，不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种 原理：选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞等）创造降低微生物代谢活动强度 生长繁殖受抑制 难以发生突变的环境条件 其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等 菌种保藏：菌 连续在培养基上（内）移种 种 生活态 传代培养保藏法
26、 连续在活宿主上（内）移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上菌种保藏的方法干法保藏菌种的方法 滴入小试管（在放入大试管干燥器中）藏在玻璃管内 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法（L-干燥法）冷冻真空干燥法 细粒状载体（土壤、沙粒、土壤+沙粒）球块状载体（硅胶、瓷球）合适的载体 有机基质（曲料、麦粒）薄片状载体 滤纸片 明胶小片（滴在蜡纸板上干燥而成）血清蛋白小片（乙烯薄膜）几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价 冰箱保藏法（斜面）冰箱保藏法（半固体）石蜡油封藏法*沙土保藏法冷冻干燥法
27、低温低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类细菌、酵母菌各大类*产孢子微生物各大类3-6月6-12月1-2年1-10年5-15年以上简便简便简便简便有效简便有效：广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。：中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM)美国的典型菌种保藏中心(ATCC)英国国家典型菌种保藏所（NCTC）法国里昂巴斯德研究所（IPL）国内外菌种保藏机构：微生物检验与生物安全n实验室安全防护n感染性废弃物的处理实验室分级依据实验室分级实验室分级处理对象处理对象危险等级危险等级BSL-1BSL-1ABSL-1ABS
28、L-1对人体和环境危害较低，不会引发健康成人疾病 级BSL-2BSL-2ABSL-2ABSL-2对人体和环境有中等危害或具有潜在危险的致病因子 级BSL-3BSL-3ABSL-3ABSL-3主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致命疾病的致病因子。通常有预防治疗措施 级BSL-4BSL-4ABSL-4ABSL-4对人体有高度危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明的微生物。尚无预防治疗措施 级微生物危害程度分级（国际分级标准）n危险等级危险等级I I （低个体危害，低群体危害）不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。n危险等级危险等级 (中等个体危害，有限群体危害)能
29、引起人或动物发病，但一般情况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。微生物危害程度分级（国际分级标准）n危险等级危险等级 IIIIII （高个体危害，低群体害）能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。n危险等级危险等级 (高个体危害，高群体危害)能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物间传播的病原体。病原生物的危险等级分布种类危害等级危害等级危害等级危
30、害等级 III危害等级危害等级危害等级危害等级I病毒185114219细菌311901真菌635寄生虫1232临床检验相关生物危险等级分布吸入30ml培养液至50ml试管中 0-5.5移去离心管上的棉花塞 0.8-5振荡后移去烧瓶上的湿棉花 0.6-19划平板 0-20接种环插入到100ml培养液中 6-24倾注离心培养液至烧瓶 0-115使用轴承磨损的混合器混合培养液 12-126使用盖子松动的混合器混合培养液 77-124650ml离心管离心时损坏或飞溅 80-1800微生物实验室相关安全操作要求n实验室安全设备及安全要求n实验室个人防护要求n实验室操作的安全要求一级防护屏障n设备类：生物
31、安全柜、负压罩等n个体防护装备：手套、口罩等n目的：实现操作者和被操作对象之间的隔离一级生物安全柜气流组织房间空气污染空气HAPE过滤空气二级生物安全柜气流组织三级生物安全柜气流组织房间空气污染空气HAPE过滤空气生物安全柜类别生物安全柜类别级别级别工作口平工作口平均进风速均进风速m/sm/s循环风比例循环风比例（%）排风比排风比例（例（%）连接方式连接方式I I级级0.360.360 0100100密闭连接密闭连接IIII级级A1A10.380.380.510.5170703030可排到房间或设置可排到房间或设置局部排风罩局部排风罩A2A20.510.5170703030可排到房间或设置可排
32、到房间或设置局部排风罩局部排风罩B1B10.510.5130307070密闭连接密闭连接B2B20.510.510 0100100密闭连接密闭连接IIIIII级级/0 0100100密闭连接密闭连接离心机安全帽生物安全型离心机 二级防护屏障n是生物安全实验室和外部环境的隔离 也称二级隔离 n保护目标：环境、实验对象感染性废物的处理n感染性废物:携带病原微生物具有引发感染疾病传播的废物n常见种类:病原体的培养物 菌、毒种保存液 血液 排泄物等各种医学样本 各种一次性用品或器械 医疗废物管理条例国务院 2003年6月16日医疗卫生机构医疗废物管理办法 卫生部 2003年8月14日n分类收集 定点保存 暂时保存 n防止泄漏、扩散或意外事故n紧急处理措施和安全防护感染性废物的处理 Thank you!
