1、多糖的研究方法及其现状多糖的研究方法及其现状活性多糖的研究活性多糖的研究-正在形成中的热点正在形成中的热点方积年方积年 中国科学院上海药物研究所中国科学院上海药物研究所2004.11.2004.11.生命的四大物质：生命的四大物质：蛋白质蛋白质核酸核酸脂类脂类多糖多糖 六十年代以后六十年代以后,随着随着现代仪器现代仪器分析方法分析方法的飞速发展的飞速发展,使人们能成使人们能成功的分离纯化和鉴定生物体内功的分离纯化和鉴定生物体内微量微量活性物质活性物质,从而对糖特别是多糖的从而对糖特别是多糖的认识产生了飞跃。认识产生了飞跃。愈来愈多的研究发现愈来愈多的研究发现,人的生命过程几人的生命过程几乎都与
2、糖链有关乎都与糖链有关:如如 细胞间通讯细胞间通讯,识别和相互作用识别和相互作用 细胞的运动和粘附细胞的运动和粘附 病原与宿主细胞的作用病原与宿主细胞的作用 等等等等.这是因为这是因为糖链携带着生物信息糖链携带着生物信息.它在细它在细胞表面的分子识别过程中起着决定性作用胞表面的分子识别过程中起着决定性作用.血型血型 -红血球表面糖链末端糖基的不同红血球表面糖链末端糖基的不同 恶性肿瘤细胞与正常细胞的不同恶性肿瘤细胞与正常细胞的不同 -糖链的不同糖链的不同 19951995年年HirabayashiHirabayashi提出提出“类似于基因密码类似于基因密码,可可能也存在能也存在多糖密码多糖密码
3、”的论点的论点.多糖的研究己愈来愈受到人们的关注多糖的研究己愈来愈受到人们的关注.国内外正在形成国内外正在形成热点热点生物细胞生物细胞 特征特征:繁殖繁殖(复制复制)凋亡凋亡 -平衡平衡 平衡破坏平衡破坏:细胞细胞过度过度增生增生-组织表组织表 面大体积堆积面大体积堆积(肿瘤肿瘤)-)-增生增生 细胞基因突变细胞基因突变(癌癌)癌细胞源于正常细胞癌细胞源于正常细胞 找既抑制癌细胞又不找既抑制癌细胞又不伤正常细胞伤正常细胞-困难困难 多糖是一种免疫调节剂多糖是一种免疫调节剂(激活机体免疫反应激活机体免疫反应)但也有少数多糖具直接杀死癌细胞作用但也有少数多糖具直接杀死癌细胞作用 或两者俱存或两者俱
4、存-治疗机体免疫功能受到严重损伤的治疗机体免疫功能受到严重损伤的癌症癌症和和爱滋病爱滋病 -治疗多种免疫缺损疾病和某些细菌治疗多种免疫缺损疾病和某些细菌,病病毒引起的疾病毒引起的疾病 多糖作为药物的最大特点是毒副作用很小多糖作为药物的最大特点是毒副作用很小 -多糖还具有明显的抗病毒、抗感染、降多糖还具有明显的抗病毒、抗感染、降血糖、降胆固醇、降血脂以及最近我们实验室血糖、降胆固醇、降血脂以及最近我们实验室发现的发现的刺激神经细胞生长作用刺激神经细胞生长作用徐徐,冯教授冯教授:抗心肌缺血作用抗心肌缺血作用但是但是 多糖的研究必竟起步较晚多糖的研究必竟起步较晚-各方面尚须进行深入的研究各方面尚须进
5、行深入的研究-大量大量新的活性多糖新的活性多糖有待于研究与开发有待于研究与开发-作用机制有待于完善作用机制有待于完善 多糖的构效关系的研究是寻找高活性多糖的构效关系的研究是寻找高活性多糖及深入研究多糖作用机制的基础多糖及深入研究多糖作用机制的基础目前研究得较为深入：目前研究得较为深入：高等真菌高等真菌(主要是蘑菇类主要是蘑菇类)产生的产生的 -葡聚糖葡聚糖 某些植物产生的具抗补体作用的某些植物产生的具抗补体作用的 果胶类多糖果胶类多糖影响构效关系研究影响构效关系研究:1)1)多糖的化学平面结构测定比较困难多糖的化学平面结构测定比较困难,特特别是含有几种糖残基的杂多糖别是含有几种糖残基的杂多糖,
6、至于决定多至于决定多糖活性的高级结构糖活性的高级结构(三维结构三维结构)测定更难测定更难.因为因为多糖是水溶性胶状物质不能结晶多糖是水溶性胶状物质不能结晶,这样限制了这样限制了用通常用通常X-X-衍射方法去测定立体结构衍射方法去测定立体结构.2)2)多糖的体内药物代谢动力学研究困难多糖的体内药物代谢动力学研究困难3)3)多糖在分子水平下与蛋白质多糖在分子水平下与蛋白质,核酸等其核酸等其他分子相互作用的认识还不清楚他分子相互作用的认识还不清楚.由于目由于目前有关多糖的药理研究主要局限于观察多前有关多糖的药理研究主要局限于观察多糖在体外或体内的生物效应糖在体外或体内的生物效应,要达到分子要达到分子
7、水平水平,细胞水平还需大量研究细胞水平还需大量研究.己有的实验证明影响多糖生物活性的主要己有的实验证明影响多糖生物活性的主要因素：因素：分子量分子量,分枝度分枝度,高级结构高级结构,溶解度溶解度,粘度粘度等等 多糖多糖-大分子大分子-分子内的分子内的糖苷键糖苷键有较强有较强的旋转性的旋转性 -决定了多糖的二级结构决定了多糖的二级结构 氢键氢键,范德华力范德华力,色散力色散力和和疏水性疏水性等非共等非共价作用价作用 -决定了多糖的三级结构决定了多糖的三级结构蘑菇类产生具抗肿瘤作用的多糖蘑菇类产生具抗肿瘤作用的多糖:分子量分子量 1010万至万至100100万万分枝度为分枝度为2:32:3至至1:
8、51:5三股螺旋立体结构的三股螺旋立体结构的-葡聚糖葡聚糖 香菇多糖香菇多糖,云芝糖肽云芝糖肽,裂褶菌多糖裂褶菌多糖 -正式在临床上应用正式在临床上应用 证明在证明在提高机体免疫提高机体免疫功能上特别是功能上特别是肿瘤辅助治疗肿瘤辅助治疗中具有显著作用中具有显著作用-受到受到临床医生的青睐临床医生的青睐 但是但是,人们期待更有效的活性多糖人们期待更有效的活性多糖的问世的问世 特别是具有抗炎作用特别是具有抗炎作用,抗病毒作用抗病毒作用,降降血糖作用血糖作用,刺激神经细胞作用的多糖问世刺激神经细胞作用的多糖问世目前主要可从二方面着手目前主要可从二方面着手:一是继续从一是继续从高等真菌高等真菌(如灵
9、芝如灵芝,猪苓猪苓,猴头菇猴头菇,冬虫夏草冬虫夏草,姬松茸姬松茸)中寻找活性多中寻找活性多糖糖.同时重点从动植物特别是从传统的同时重点从动植物特别是从传统的中中草药草药及及海洋生物海洋生物（如海藻）（如海藻）中寻找高效的中寻找高效的活性多糖活性多糖.实验证明实验证明:许多属去邪扶正的中药许多属去邪扶正的中药-发挥主要作用的大多是发挥主要作用的大多是多糖多糖成份成份-从中草药及海洋生物中寻找有效的从中草药及海洋生物中寻找有效的活性多糖活性多糖-方向方向 最新报道最新报道藻类中主要存在的硫酸酯多糖藻类中主要存在的硫酸酯多糖可以抑制可以抑制HIV-I表面糖蛋白表面糖蛋白gp120与免疫与免疫细胞表面
10、细胞表面CD4受体的结合受体的结合抑制合胞体的形成抑制合胞体的形成特别适合制成一种外用型杀菌剂以防止特别适合制成一种外用型杀菌剂以防止Aids通过性交途径的感染通过性交途径的感染具有成本较低，水溶性好，不产生机体不良具有成本较低，水溶性好，不产生机体不良 我们认为影响发现活性多糖的我们认为影响发现活性多糖的关键关键:分离纯化方法及检测手段分离纯化方法及检测手段,多糖是水溶性大多糖是水溶性大分子物质分子物质,它的分离纯化方法它的分离纯化方法不同于一般小分子物不同于一般小分子物质质,而且常用的而且常用的检测手段又不灵敏检测手段又不灵敏,所以常会将微量所以常会将微量高活性成份的多糖高活性成份的多糖作
11、为杂质而丢弃作为杂质而丢弃.结构改造结构改造及及结构修饰结构修饰-结构改造或结构修饰可以提高或改变多结构改造或结构修饰可以提高或改变多糖的活性糖的活性.如如 具有抗肿瘤作用但无抗爱滋病毒作具有抗肿瘤作用但无抗爱滋病毒作用的用的香菇多糖香菇多糖,如分子中引入如分子中引入 硫酸基硫酸基 后后,则几乎不再具抗肿瘤作用则几乎不再具抗肿瘤作用,却具显著抗爱却具显著抗爱滋病毒作用滋病毒作用.同样结构修饰或改造也可以改变给同样结构修饰或改造也可以改变给药途径药途径,如高等真菌产生的具提高兔疫功如高等真菌产生的具提高兔疫功能的能的-葡聚糖葡聚糖,一般注射有效一般注射有效,口服无效口服无效.但如果连接有少量但如
12、果连接有少量 肽肽 成为多糖肽成为多糖肽,或连或连接一些其他糖残基成为杂多糖接一些其他糖残基成为杂多糖,则口服有则口服有效效.这是制作真菌来源的保健品中值得注意这是制作真菌来源的保健品中值得注意的问题的问题.却被许多人疏忽却被许多人疏忽.譬如说市场上已有的譬如说市场上已有的香菇多糖保健品香菇多糖保健品,实质上香菇多糖实质上香菇多糖(Lentinan)Lentinan)口服是口服是无效无效的的,那么为什么这些保健品确实还那么为什么这些保健品确实还是对人体有良好作用呢是对人体有良好作用呢?这是因为香菇提取物这是因为香菇提取物中不仅存在香菇多糖中不仅存在香菇多糖,还存在其他对人体有效还存在其他对人体
13、有效的活性物质的活性物质,而真正起作用的就是这些活性物而真正起作用的就是这些活性物质质,可以这么说保健品中香菇多糖含量越高可以这么说保健品中香菇多糖含量越高,其其效果越差效果越差.所以如果将香菇提取物命名为香菇所以如果将香菇提取物命名为香菇多糖保健品是不恰当的多糖保健品是不恰当的.目前对于多糖进行目前对于多糖进行结构改造结构改造或或修饰修饰常用的方法常用的方法:过碘酸盐氧化过碘酸盐氧化 SmithSmith降解降解 部分水解部分水解 衍生化衍生化 硫酸化硫酸化,羧甲基化羧甲基化,羧乙基化羧乙基化,磷酸化磷酸化,棕榈酰化棕榈酰化 多糖的多糖的羧甲基化羧甲基化可以提高多糖的水溶可以提高多糖的水溶性
14、性,一般水溶性提高其抗肿瘤活性也提高一般水溶性提高其抗肿瘤活性也提高 多糖中引入多糖中引入硫酸基硫酸基一般均可显著提高一般均可显著提高其抗爱滋病毒的活性其抗爱滋病毒的活性,且其活性随主链中的且其活性随主链中的氨基糖及分枝度的增加而增加氨基糖及分枝度的增加而增加,但随主链中但随主链中去氧已糖及分枝度的增加而减少去氧已糖及分枝度的增加而减少 从从高等真菌高等真菌中获得的中获得的-葡聚糖葡聚糖大多具明大多具明显的免疫活性显的免疫活性,但它们在消化道内难以被肠道但它们在消化道内难以被肠道壁直接吸收而进入血液壁直接吸收而进入血液,所以必须通过注射才所以必须通过注射才能发挥作用能发挥作用.如果进行结构修饰
15、如果进行结构修饰,使其能被消使其能被消化道吸收化道吸收,变注射为口服变注射为口服,则将大大简化给药则将大大简化给药途径途径.从从植物植物及及海藻海藻中获得的活性多糖一般是中获得的活性多糖一般是杂多糖杂多糖-它们大多口服也有效它们大多口服也有效.-植物及海藻来源的活性多糖可以植物及海藻来源的活性多糖可以作为保健品的优越之处作为保健品的优越之处 多糖是亲水性大分子多糖是亲水性大分子,难以透过由脂质难以透过由脂质构成的细胞膜构成的细胞膜,所以口服有效常受到质疑所以口服有效常受到质疑.有人认为多糖主要与肠道细胞表面的相应有人认为多糖主要与肠道细胞表面的相应受体分子起作用受体分子起作用,或者通过胞饮内吞
16、作用或者通过胞饮内吞作用(pinocytosispinocytosis)由消化道进入血液由消化道进入血液,然后刺然后刺激人体免疫细胞的成熟激人体免疫细胞的成熟,分化和繁殖分化和繁殖,诱导诱导专一性细胞因子的产生与激活专一性细胞因子的产生与激活(所谓多糖是所谓多糖是多细胞因子诱导剂多细胞因子诱导剂),),结果由这些免疫细胞结果由这些免疫细胞去吞噬或杀死肿瘤细胞或阻断细菌去吞噬或杀死肿瘤细胞或阻断细菌,病毒的病毒的吸附或繁殖吸附或繁殖.有人认为有人认为-葡聚糖是一种葡聚糖是一种融合诱融合诱导导剂剂,它能诱导免疫细胞与肿瘤细胞的它能诱导免疫细胞与肿瘤细胞的融合融合,从而使肿瘤细胞消失从而使肿瘤细胞消
17、失.上述这些上述这些作用机制的理论有的虽被初步实验证作用机制的理论有的虽被初步实验证实实,有的却是推测有的却是推测,有待人们去进一步有待人们去进一步完善完善.由此可见由此可见,至今活性多糖的研究至今活性多糖的研究尚属初级阶段尚属初级阶段.多糖的应用可分为两个方面多糖的应用可分为两个方面一类是利用多糖的独特理化性质，一类是利用多糖的独特理化性质，如易形成凝胶、高渗透压、高粘度和吸如易形成凝胶、高渗透压、高粘度和吸水性，制备医药材料、药物缓释剂、血水性，制备医药材料、药物缓释剂、血浆代用品等浆代用品等另一类利用多糖的抗原性、抗肿瘤、另一类利用多糖的抗原性、抗肿瘤、降血糖、促进免疫功能等生物功能或活
18、降血糖、促进免疫功能等生物功能或活性制备疫苗或新药。性制备疫苗或新药。至今从多糖中寻找至今从多糖中寻找具有抗爱滋病的新药已引起人们很大的具有抗爱滋病的新药已引起人们很大的兴趣。兴趣。美国学者美国学者M.M.YalpaniYalpani认为认为:“至今多糖在生物技术领域仍是一个至今多糖在生物技术领域仍是一个沉睡的巨人沉睡的巨人,有待于大家去唤醒有待于大家去唤醒.”.”可以预言可以预言:活性多糖的研究与开发将成为生命活性多糖的研究与开发将成为生命科学中的重要课题科学中的重要课题.多糖多糖多糖是由十个以上单糖通过糖苷键以共价键形式多糖是由十个以上单糖通过糖苷键以共价键形式结合起来的聚糖结合起来的聚糖
19、（Polysaccharide或或glycan）可用可用(C6H10O5)n表示，其中表示，其中n10自然界很少存在自然界很少存在n为为10-30的多糖的多糖匀多糖匀多糖只有一种类型的单糖组成的多糖只有一种类型的单糖组成的多糖杂多糖杂多糖几种类型的单糖组成的多糖几种类型的单糖组成的多糖 表表1记录了来自天然界的一些重要多糖。记录了来自天然界的一些重要多糖。天然界存在的单糖种类很多天然界存在的单糖种类很多,但组成多糖的单糖大致由表但组成多糖的单糖大致由表2 所示的一些单糖组成。所示的一些单糖组成。取代线状型取代线状型直线型直线型分枝型分枝型环状型环状型多糖结构多糖结构 表1.几种天然存在的多糖
20、表表2.构成多糖的通常的单糖构成多糖的通常的单糖 多糖研究与开发的关键多糖研究与开发的关键 多糖多糖均一组分均一组分 深入研究结构分析、构效关系深入研究结构分析、构效关系多糖的多糖的纯度标准纯度标准：不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量不能用通常小分子化合物的纯度标准来衡量多糖纯品微观是不均一的，纯度只代表同一种多糖纯品微观是不均一的，纯度只代表同一种多糖的相似链长的平均配布多糖的相似链长的平均配布 通常符合下列标准即可肯定为均一多糖：通常符合下列标准即可肯定为均一多糖：1.在重复的纯化过程中其单糖的组成及摩尔比恒在重复的纯化过程中其单糖的组成及摩尔比恒定或其它理化性质不变化。如分步沉淀定或
21、其它理化性质不变化。如分步沉淀（如（如30%,50%乙醇沉淀）得到的两组分其乙醇沉淀）得到的两组分其比旋度或单糖摩尔比不变。比旋度或单糖摩尔比不变。2.超离心后，具有相同沉降速率，即具有一个对超离心后，具有相同沉降速率，即具有一个对称峰。称峰。3.高效凝胶层析（高效凝胶层析（HPGPC）得到的一个对称得到的一个对称峰峰。HPGPC目前检测多糖均一性最常用也是误差最小的一种目前检测多糖均一性最常用也是误差最小的一种方法方法多糖专用柱多糖专用柱（不是通常的反相柱及氨基柱）（不是通常的反相柱及氨基柱）检测仪（示差检测器或激光光散射仪）检测仪（示差检测器或激光光散射仪）过去常用常压凝胶层析过去常用常压
22、凝胶层析/分步收集分步收集/硫酸硫酸-苯酚法苯酚法检测检测误差很大。误差很大。一一.多糖的分离提取方法多糖的分离提取方法通过分离纯化不使原有的多糖性质改变通过分离纯化不使原有的多糖性质改变（如结构改变、降解等）。（如结构改变、降解等）。存在于动植物细胞壁外存在于动植物细胞壁外胞外多糖胞外多糖存在于细胞壁内存在于细胞壁内胞内多糖（大多数多糖）胞内多糖（大多数多糖）超声波气流粉碎技术超声波气流粉碎技术将动植物或真菌孢子的细胞壁破裂，大大提高了将动植物或真菌孢子的细胞壁破裂，大大提高了多糖的提取效率多糖的提取效率动植物的细胞大多由脂质包围，用机械粉碎后还动植物的细胞大多由脂质包围，用机械粉碎后还必须
23、脱脂（沙氏提取器，乙醇回流）必须脱脂（沙氏提取器，乙醇回流）脱脂后就可以进行提取脱脂后就可以进行提取第一步第一步动植物体的粉碎动植物体的粉碎A.热水提取法热水提取法：根据大多数多糖在热水中溶解度较大且稳根据大多数多糖在热水中溶解度较大且稳定的性质进行提取定的性质进行提取这种方法提取多糖这种方法提取多糖的破坏最小。的破坏最小。即经过上述方法处理过的植物用沸水提取即经过上述方法处理过的植物用沸水提取2-6小时。提取小时。提取液如粘度不大，则可采用过滤法过滤去残渣，对于粘度大液如粘度不大，则可采用过滤法过滤去残渣，对于粘度大的提取液则必须采用离心法去残渣，即得到多糖提取液或的提取液则必须采用离心法去
24、残渣，即得到多糖提取液或上清液。有时可在热水中加入上清液。有时可在热水中加入2-10%尿素，使多糖的构型尿素，使多糖的构型改变（这种改变是可逆的），粘度降低，增加其在热水中改变（这种改变是可逆的），粘度降低，增加其在热水中的溶解度。的溶解度。多糖的提取常用四种方法：多糖的提取常用四种方法：B.稀碱水溶液提取法稀碱水溶液提取法：酸性多糖或分子量较大的多糖在热水中溶解酸性多糖或分子量较大的多糖在热水中溶解度不大，所以常用度不大，所以常用5-15%NaOH或或Na2CO3水水溶液提取。溶液提取。不过用稀碱溶液提取时，温度必须保持在不过用稀碱溶液提取时，温度必须保持在10以下，以下，否则多糖容易发生降
25、解反应。通常在冷却的条件下否则多糖容易发生降解反应。通常在冷却的条件下（4），放置），放置6-8小时，然后过滤或离心，滤液用小时，然后过滤或离心，滤液用稀盐酸调节稀盐酸调节pH至中性即得碱性多糖提取液。至中性即得碱性多糖提取液。我们实验室我们实验室通常先用热水法提取，然后残渣再用稀碱通常先用热水法提取，然后残渣再用稀碱溶液提取，这样可将大部分多种类型的多溶液提取，这样可将大部分多种类型的多糖提取出来。糖提取出来。用稀碱提取，其提取液中存在大量的无机盐，在下一步用稀碱提取，其提取液中存在大量的无机盐，在下一步过程中必须设法除去。过程中必须设法除去。C.酶解法酶解法：粉碎的植物悬浮于水中粉碎的植物
26、悬浮于水中调节至最适温度（通常是调节至最适温度（通常是38-50）最适最适pH范围（通常是范围（通常是pH3.8-4.5）加入加入5-25%复合酶，反应复合酶，反应4小时小时过滤去残渣过滤去残渣滤液即为多糖提取液滤液即为多糖提取液该法已在多糖保健品（如香菇多糖保健品）的制备中采用。该法已在多糖保健品（如香菇多糖保健品）的制备中采用。但大多采用热水提取法及酶法相结合的办法，即先用热水提但大多采用热水提取法及酶法相结合的办法，即先用热水提取，然后残渣再用酶法提取，这样多糖收率可提高许多。取，然后残渣再用酶法提取，这样多糖收率可提高许多。D.其它方法其它方法：对质子惰性的溶剂如二甲亚砜作溶对质子惰性
27、的溶剂如二甲亚砜作溶剂提取多糖剂提取多糖碱金属盐的有机溶剂如氯化锂碱金属盐的有机溶剂如氯化锂-二甲二甲氧基乙醇提取多糖氧基乙醇提取多糖酸性水溶液提取多糖酸性水溶液提取多糖以上这些方法现在大多数不采用了，以上这些方法现在大多数不采用了，理由是成本高、收率低理由是成本高、收率低二多糖提取液中杂质的去除：二多糖提取液中杂质的去除：多糖提取液多糖提取液都含有许多杂质，主要是无机盐、单糖、寡糖、低都含有许多杂质，主要是无机盐、单糖、寡糖、低分子量的非极性物质及高分子量的有机杂质（如蛋白质、分子量的非极性物质及高分子量的有机杂质（如蛋白质、木质素）木质素）透析法透析法使用透析袋除去无机盐、单糖、寡糖和低分
28、子量的非使用透析袋除去无机盐、单糖、寡糖和低分子量的非极性物质极性物质透析袋是一种只限于小于某一排阻范围的分子通透析袋是一种只限于小于某一排阻范围的分子通过的一种半透膜，如纤维素膜。过的一种半透膜，如纤维素膜。不同的分子量排阻值构成不同型号的透析袋不同的分子量排阻值构成不同型号的透析袋第一步是选择需要截留的分子量的透析袋类型第一步是选择需要截留的分子量的透析袋类型透析袋需要经过预处理透析袋需要经过预处理,通常将新的透析袋置于沸水中沸腾通常将新的透析袋置于沸水中沸腾2-3小小时（换水时（换水2次）以便去除透析袋中的杂质。透析袋可以反复使用，但次）以便去除透析袋中的杂质。透析袋可以反复使用，但用过
29、的透析袋必须冲洗干净，然后浸在加有少量防腐剂（如苯甲酸）用过的透析袋必须冲洗干净，然后浸在加有少量防腐剂（如苯甲酸）的水中于冰箱中保存（注意勿使其长霉及干燥！）的水中于冰箱中保存（注意勿使其长霉及干燥！）透析袋透析袋pH5-9时稳定时稳定提取液必须先调节提取液必须先调节pH至至5-9后才可进行透析。后才可进行透析。透析袋较昂贵，对于要求不高的大量透析，可采用普通玻透析袋较昂贵，对于要求不高的大量透析，可采用普通玻璃纸代替璃纸代替截流范围就比较不容易控制。截流范围就比较不容易控制。采用连续透析仪进行透析采用连续透析仪进行透析操作简便操作简便透析袋原理是分子筛原理，有一定的分子量排阻范围透析袋原理
30、是分子筛原理，有一定的分子量排阻范围由于多糖分子不是球形的，有的是线状的由于多糖分子不是球形的，有的是线状的有时分子量较大的物质也可能透过半透膜有时分子量较大的物质也可能透过半透膜 离子交换树脂法离子交换树脂法对于带有电荷的阴离子及阳离子（即无机对于带有电荷的阴离子及阳离子（即无机盐）盐）离子交换树脂的混合床去阴、阳离子离子交换树脂的混合床去阴、阳离子大量的工业化去除离子大量的工业化去除离子蛋白质除去通常采用方法：蛋白质除去通常采用方法：1.酶法酶法：蛋白酶将提取液中的蛋白质酶解。常用链霉蛋白酶(pronase)，其方法是在pH7-8时，加入链霉蛋白酶，37消化2-4天，然后反应物于沸水中加热
31、5分钟以阻断反应。2.Sevag法法：蛋白质在氯仿等有机溶剂中变性将氯仿按多糖水溶液1/5体积加入加入氯仿体积1/5的正丁醇剧烈振摇20分钟离心，分去水层与溶剂层交界处的变性蛋白条件温和，缺点是效率不高，一般要重复5次左右去蛋白的最佳pH是4-5，常用于微生物来源的多糖3.三氟三氯乙烷法三氟三氯乙烷法：等体积的三氟三氯乙烷加入到提取液中，在冷却的情况下搅拌10分钟，蛋白质成胶冻状，离心除去胶状蛋白质。上层水相再用上述溶剂处理2次，即得无蛋白质的多糖此法效率较高，但因溶剂沸点较低(b.p.56)，易挥发，且必须在低温条件下进行，不宜大量应用。4.三氯醋酸法三氯醋酸法：在冰浴中搅拌的情况下缓缓于提
32、取液中加入15-30%三氯醋酸，直至溶液不再继续混浊。在低温下（4）放置4小时。离心除去沉淀即得无蛋白质的多糖提取液由于三氯醋酸的酸性较强，往往会引起某些多糖的降解，所以操作必须在低温下进行，该法效率较高，常用于植物多糖的去蛋白。脱色脱色多糖提取液，常有较深的色泽（多糖提取液，常有较深的色泽（含有酚型化合物含有酚型化合物的杂质的杂质）作为保健品须脱色作为保健品须脱色活性炭脱色法活性炭脱色法活性炭对多糖有较强的吸附作用，活性炭对多糖有较强的吸附作用，多糖损失很大多糖损失很大弱碱性离子交换树脂弱碱性离子交换树脂去除多糖粗品中游离的色去除多糖粗品中游离的色素素对酸性多糖的吸附力强，故不宜使用。对酸性
33、多糖的吸附力强，故不宜使用。过氧化氢脱色法过氧化氢脱色法将将0.3-0.8%粗多糖水溶液用浓氨水调粗多糖水溶液用浓氨水调PH至至8搅拌，搅拌，50 加入过氧化氢（比例为加入过氧化氢（比例为10-30%ml/g）在在50 下保持下保持2小时小时醋酸调醋酸调节至节至PH7.0减压浓缩减压浓缩3倍量乙醇沉淀，即倍量乙醇沉淀，即得脱色的多糖。该法在多糖粗品的脱色中常用。得脱色的多糖。该法在多糖粗品的脱色中常用。但必须严格控制脱色条件，如温度、时间、但必须严格控制脱色条件，如温度、时间、PH等。等。尽管如此，该法也会引起一定多糖的降解损失尽管如此，该法也会引起一定多糖的降解损失。最近我们实验室发明最近我
34、们实验室发明一种新的多糖脱色方法一种新的多糖脱色方法十六烷基三甲基溴化铵十六烷基三甲基溴化铵正己醇正己醇异辛烷反胶束溶液异辛烷反胶束溶液在一定盐浓度下，对多糖粗品进行脱色。该法具有方在一定盐浓度下，对多糖粗品进行脱色。该法具有方便、快速，多糖回收率高等优点。这种新方法已申报专利便、快速，多糖回收率高等优点。这种新方法已申报专利（申请号（申请号01105320.8）。）。多糖提取液中杂质的去除，有时也可不采用上述多糖提取液中杂质的去除，有时也可不采用上述方法，而直接用几次反复柱层析的方法（详见纯方法，而直接用几次反复柱层析的方法（详见纯化部分）。化部分）。三多糖的纯化三多糖的纯化纯化是将分离所得
35、的混合多糖纯化为各种单一的多糖。纯化是将分离所得的混合多糖纯化为各种单一的多糖。实质上，分离与纯化是很难明显区别开来的实质上，分离与纯化是很难明显区别开来的有时在分离过程已在纯化了有时在分离过程已在纯化了譬如说先用中性热水提取，再用碱性水提取，就将中性水譬如说先用中性热水提取，再用碱性水提取，就将中性水溶多糖及酸性水溶多糖按溶解度不同分离开来了溶多糖及酸性水溶多糖按溶解度不同分离开来了反过来有的在纯化过程中进一步得到分离反过来有的在纯化过程中进一步得到分离譬如说在柱层析过程中进一步将杂质分离譬如说在柱层析过程中进一步将杂质分离（一）、（一）、分步沉淀法分步沉淀法：根据不同的多糖在低级醇或酮（通
36、常是乙醇或丙酮）中根据不同的多糖在低级醇或酮（通常是乙醇或丙酮）中具有不同溶解度而进行分离。具有不同溶解度而进行分离。分子量大的多糖较分子量小的多糖在乙醇（或丙酮）中分子量大的多糖较分子量小的多糖在乙醇（或丙酮）中的溶解度小的溶解度小逐步加大乙醇（或丙酮）的浓度可将不逐步加大乙醇（或丙酮）的浓度可将不同分子量的多糖分别沉淀出来同分子量的多糖分别沉淀出来溶液中在搅拌下缓缓加入溶液中在搅拌下缓缓加入98%以上的乙醇，使乙醇的最终浓以上的乙醇，使乙醇的最终浓度为度为25%，加毕静置，加毕静置1h，然后离心，得到上清液和沉淀，该沉淀然后离心，得到上清液和沉淀，该沉淀即为分子量最大的多糖。即为分子量最大
37、的多糖。上清液继续在搅拌下缓缓加入乙醇，使乙醇浓度达到上清液继续在搅拌下缓缓加入乙醇，使乙醇浓度达到35%，静置静置1h，再离心，得到第二次沉淀，这时沉淀的多糖的分再离心，得到第二次沉淀，这时沉淀的多糖的分子量小于第一次沉淀。上清液继续加乙醇至浓度为子量小于第一次沉淀。上清液继续加乙醇至浓度为50%及及70%，再离心，即得第三、四次沉淀。第四次沉淀的多糖，再离心，即得第三、四次沉淀。第四次沉淀的多糖其分子量最小。分步沉淀的关键是尽量避免共沉淀发生，其分子量最小。分步沉淀的关键是尽量避免共沉淀发生，具体而言就是多糖混合物的浓度不能太高，乙醇加入速度具体而言就是多糖混合物的浓度不能太高，乙醇加入速
38、度不能太快，溶液不能太快，溶液pH呈中性。呈中性。应该说多糖浓度越小，共沉淀作用也小，则应该说多糖浓度越小，共沉淀作用也小，则分离效果好。浓度太稀，会使多糖的回收率降低，分离效果好。浓度太稀，会使多糖的回收率降低，且乙醇用量大。通常将多糖混合物的浓度控制在且乙醇用量大。通常将多糖混合物的浓度控制在0.25-3%。分步沉淀在多糖纯化中常常首先使用，。分步沉淀在多糖纯化中常常首先使用，特别是分离分子量差别较大的两种多糖，它比柱特别是分离分子量差别较大的两种多糖，它比柱层析方法简便多了。层析方法简便多了。（二）、（二）、盐析法盐析法：根据分子量不同的多糖在一定浓度的盐溶液中具有根据分子量不同的多糖在
39、一定浓度的盐溶液中具有不同溶解度的性质分离各种多糖。不同溶解度的性质分离各种多糖。在多糖中加入中性盐如在多糖中加入中性盐如NaCl、KCl、(NH4)2SO4等至一等至一定浓度，溶解度最小的多糖便沉淀析出定浓度，溶解度最小的多糖便沉淀析出,然后上清液继续加然后上清液继续加盐至更高浓度，则另一多糖又沉淀析出盐至更高浓度，则另一多糖又沉淀析出实质上它的原理与操作与分步沉淀相仿。盐析法在蛋白质实质上它的原理与操作与分步沉淀相仿。盐析法在蛋白质纯化上用的很多。早期云芝多糖（纯化上用的很多。早期云芝多糖（PSK）的纯化就是应用的纯化就是应用该法。该法。盐析法的优点是成本较低，但分辨率不高，易产生共盐析法
40、的优点是成本较低，但分辨率不高，易产生共沉淀。影响盐析法分辨率的关键也是多糖的浓度。多糖溶沉淀。影响盐析法分辨率的关键也是多糖的浓度。多糖溶液的浓度越小，则纯化效果越好。次要因素是溶液的液的浓度越小，则纯化效果越好。次要因素是溶液的pH及及盐析温度。为了获得满意的实验重复性，溶液的浓度、盐析温度。为了获得满意的实验重复性，溶液的浓度、pH及温度均必须严格控制。由于各种多糖性质不同，所以为及温度均必须严格控制。由于各种多糖性质不同，所以为了获得较好的分离效果，各种条件必须反复试验。了获得较好的分离效果，各种条件必须反复试验。盐析剂很多，中性无机盐均可作为盐析剂，但在多糖中以盐析剂很多，中性无机盐
41、均可作为盐析剂，但在多糖中以硫酸铵用得最多。盐析法获得的多糖沉淀中含有很多盐类，硫酸铵用得最多。盐析法获得的多糖沉淀中含有很多盐类，必须经过透析去盐后方能进行下一步的纯化过程。必须经过透析去盐后方能进行下一步的纯化过程。（三）、（三）、金属络合法金属络合法：根据不同多糖能与各种铜、钡、钙和铅离子形成根据不同多糖能与各种铜、钡、钙和铅离子形成络合物而沉淀的性质进行多糖的纯化。络合物而沉淀的性质进行多糖的纯化。常用的络合剂有氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等常用的络合剂有氯化铜、氢氧化钡和醋酸铅等络合物沉淀络合物沉淀水洗涤水洗涤酸分解酸分解最常用的是铜盐络合法及氢氧化钡络合法最常用的是铜盐络合法及氢氧化钡
42、络合法铜盐络合法：铜盐络合法：CuCl2、CuSO4、Cu(Ac)2溶液、溶液、Feling试剂试剂 Feling试剂不能过量，否则产生的沉淀会重新溶解。试剂不能过量，否则产生的沉淀会重新溶解。得到沉淀后用水洗涤，然后用得到沉淀后用水洗涤，然后用5%HCl(V/V)的乙醇液分的乙醇液分解此络合物，用乙醇洗去解此络合物，用乙醇洗去CuCl2，得多糖。得多糖。氢氧化钡络合法氢氧化钡络合法饱和饱和Ba(OH)2溶液溶液当当Ba(OH)2浓度小于浓度小于0.03mol/L时葡甘露聚糖和半甘时葡甘露聚糖和半甘露聚糖可全部沉淀，但阿拉伯聚糖和半乳聚糖不沉淀。露聚糖可全部沉淀，但阿拉伯聚糖和半乳聚糖不沉淀。
43、沉淀用醋酸沉淀用醋酸(2 mol/L)分解，上清液加乙醇沉淀即得游离分解，上清液加乙醇沉淀即得游离多糖。多糖。（四）（四）有机盐沉淀法有机盐沉淀法：2000年美国专利年美国专利(US75920000111)报导从植物与微报导从植物与微生物中提取粘多糖或蛋白多糖的新方法：生物中提取粘多糖或蛋白多糖的新方法：溶液中加入有机酸单宁，与多糖形成有机盐复合物而溶液中加入有机酸单宁，与多糖形成有机盐复合物而沉淀。离心得沉淀，沉淀用有机溶剂或其它物质使单宁除沉淀。离心得沉淀，沉淀用有机溶剂或其它物质使单宁除去去目前这种方法已用于制备多糖药物、化妆品、保健品中。目前这种方法已用于制备多糖药物、化妆品、保健品中
44、。这种方法特别适合于从芦荟及葡聚糖中分离乙酰化甘露聚这种方法特别适合于从芦荟及葡聚糖中分离乙酰化甘露聚糖。糖。（五）、（五）、季胺盐沉淀法季胺盐沉淀法：长链季胺盐能与酸性多糖形成络合物，在低离子强长链季胺盐能与酸性多糖形成络合物，在低离子强度的水溶液中不溶解的特性，使其沉淀析出，然后度的水溶液中不溶解的特性，使其沉淀析出，然后增加溶液的离子强度到一定范围，络合物则逐渐离增加溶液的离子强度到一定范围，络合物则逐渐离解，最终溶解。解，最终溶解。常用于分离酸性多糖及中性多糖。季胺盐有十六烷基常用于分离酸性多糖及中性多糖。季胺盐有十六烷基三甲基胺盐的溴化物三甲基胺盐的溴化物(CTAB)及其碱（及其碱（
45、CTABOH）和十六和十六烷基氯化吡啶（烷基氯化吡啶（CPC）。）。实验时除控制溶液的离子强度外实验时除控制溶液的离子强度外,还必须控制溶液的还必须控制溶液的pH值值 溶液的溶液的pH应小于应小于9，并无硼砂存在，否则中性多糖也能沉淀，并无硼砂存在，否则中性多糖也能沉淀出来。季胺盐沉淀的效果极好，它能从很稀的溶液中出来。季胺盐沉淀的效果极好，它能从很稀的溶液中(如如0.01%的浓度的浓度)通过选择性沉淀将酸性多糖沉淀出来。通过选择性沉淀将酸性多糖沉淀出来。1-10%(W/V)的的CTAB或或CPC水溶液，在搅拌的情况下滴加水溶液，在搅拌的情况下滴加于于0.1-1%(W/V)的多糖溶液中，酸性多
46、糖即能从中性多糖中的多糖溶液中，酸性多糖即能从中性多糖中沉淀出来沉淀出来一般说，酸性强或分子量大的多糖首先沉淀出来，所以控一般说，酸性强或分子量大的多糖首先沉淀出来，所以控制季胺盐的浓度，也能分离各种不同酸性的多糖。制季胺盐的浓度，也能分离各种不同酸性的多糖。络合物在不同离子强度的盐溶液中、酸溶液中及有机溶络合物在不同离子强度的盐溶液中、酸溶液中及有机溶剂中溶解度不同，据此可将多糖游离出来。剂中溶解度不同，据此可将多糖游离出来。将络合物沉淀溶解于将络合物沉淀溶解于3-4mol/L的的NaCl中，然后加入中，然后加入3-5倍的乙醇使多糖沉淀，而季胺盐则留在溶液中。或倍的乙醇使多糖沉淀，而季胺盐则
47、留在溶液中。或在在3-4mol/L的的NaCl溶液中加入碘化物或硫氰酸盐使季胺溶液中加入碘化物或硫氰酸盐使季胺盐沉淀出来，而多糖留在溶液中。也可用正丁醇、戊醇盐沉淀出来，而多糖留在溶液中。也可用正丁醇、戊醇或氯仿等有机溶剂萃取季胺盐，最终均经过透析、去盐、或氯仿等有机溶剂萃取季胺盐，最终均经过透析、去盐、冷冻干燥得到多糖。冷冻干燥得到多糖。季胺盐沉淀法是一种较经典的方法，至今在多糖的纯化季胺盐沉淀法是一种较经典的方法，至今在多糖的纯化中还在使用，如香菇多糖的纯化，日本就是用此方法。中还在使用，如香菇多糖的纯化，日本就是用此方法。（六）、（六）、柱层析方法柱层析方法：使用最多的方法，效果好，操作
48、简单使用最多的方法，效果好，操作简单（1）纤维素柱层析：纤维素柱层析：乙醇液将柱内纤维素（载体）平衡乙醇液将柱内纤维素（载体）平衡多糖混合物全部沉淀于惰性的纤维素多糖混合物全部沉淀于惰性的纤维素不同浓度乙醇水溶液（如不同浓度乙醇水溶液（如80%、60%、40%、20%）洗脱）洗脱不同多糖依次洗脱出来不同多糖依次洗脱出来先洗脱的是分子量最小的多糖先洗脱的是分子量最小的多糖最终洗脱的是分子量最大的多糖最终洗脱的是分子量最大的多糖 在洗脱过程中，由于各种多糖在柱上进行无数次在洗脱过程中，由于各种多糖在柱上进行无数次的溶解和沉淀过程，最终将各种多糖分离开来。的溶解和沉淀过程，最终将各种多糖分离开来。实
49、质上与分步沉淀法相反实质上与分步沉淀法相反分步溶解法分步溶解法其其理论塔板数较高，流出液的纯度高理论塔板数较高，流出液的纯度高缺点是流速慢，纯化周期长，特别是对于粘缺点是流速慢，纯化周期长，特别是对于粘度较大的酸性多糖度较大的酸性多糖装柱与通常装柱法不同装柱与通常装柱法不同32g硅藻土与硅藻土与500ml 0.2mol/L CaCl2溶液相混，在搅拌溶液相混，在搅拌下逐步加入下逐步加入640ml 0.2mol/L K2HPO4溶液，得到均匀散布溶液，得到均匀散布于硅藻土颗粒中的磷酸钙沉淀，然后将此悬浮液装柱，于硅藻土颗粒中的磷酸钙沉淀，然后将此悬浮液装柱，上样后用上样后用0-0.2mol/L不
50、同离子强度的磷酸缓冲液（不同离子强度的磷酸缓冲液（pH6.5）洗脱。洗脱。这种柱的流速也不快，所以柱层析一般在冷房中进行，这种柱的流速也不快，所以柱层析一般在冷房中进行，以防止样品发霉变质。以防止样品发霉变质。分离酸性多糖采用的载体为硅藻土与磷酸钙的混合物：分离酸性多糖采用的载体为硅藻土与磷酸钙的混合物：（2）阴离子交换柱层析：）阴离子交换柱层析：纯化中首先使用的方法纯化中首先使用的方法柱层析中应用的最普遍的一种方法，特别是对于柱层析中应用的最普遍的一种方法，特别是对于体积较大的多糖溶液，大多数首先采用阴离子交换柱体积较大的多糖溶液，大多数首先采用阴离子交换柱层析。层析。通过层析多糖溶液得到浓
