1、实验实验2 2 分离分离以尿素为氮源的以尿素为氮源的微生物微生物思考：采用什么方法从土壤中分离出以尿素为采用什么方法从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物？氮源的微生物？如何判断分离出的细菌确实能将尿素分如何判断分离出的细菌确实能将尿素分解？解？一一.实验原理实验原理 尿素尿素 NH3 中性中性 碱性碱性 酚红颜色：酚红颜色：(酸性)黄色黄色 红色红色(变色范围变色范围 pH6.4-8.2)pH6.4-8.2)二二.实验目的实验目的 使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有有脲酶脲酶)通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基p
2、HpH的变化的变化(脲酶催化的化学反应脲酶催化的化学反应)以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中尿素的分解，产生产生的脲酶向周围扩散，将培养基中尿素的分解，产生的的NHNH3 3使培养基的使培养基的pHpH由原来的中性变为碱性，于是培养由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红变成红色，菌落的周围会产生红色环带，红基中的酚红变成红色，菌落的周围会产生红色环带，红色环带愈大，表明这种菌利用色环带愈大，表明这种菌利用尿素尿素的能力愈强。的能力愈强。三三.实验步骤实验步骤.倒平板倒平板.制备一定浓度梯度的细菌悬液制备一定
3、浓度梯度的细菌悬液g土壤土壤ml无菌水，振荡，为无菌水，振荡，为-2稀释液，依次制备稀释液，依次制备-3、-4、-5的土壤稀释液。的土壤稀释液。.稀释涂布分离法分离细菌稀释涂布分离法分离细菌.制备无菌的全营养固体培养基和尿素固体培养基制备无菌的全营养固体培养基和尿素固体培养基.培养观察培养观察（倒置，（倒置，37 24-48h）（无菌，（无菌，0.1ml，玻璃刮刀），玻璃刮刀）1、配制培养基、配制培养基 尿素培养基尿素培养基 葡萄糖葡萄糖 0.025g0.025g NaClNaCl 0.12g 0.12g K K2 2HPO4 0.12g HPO4 0.12g 琼脂糖琼脂糖 0.5g0.5g
4、酚红酚红 0.25g0.25g 尿素尿素 10ml10ml LBLB培养基培养基 蛋白胨：蛋白胨：0.25g0.25g 酵母提取液：酵母提取液：0.12g0.12g NaClNaCl：0.25g0.25g 琼脂糖琼脂糖：0.5g 0.5g 对照组对照组选择培养基选择培养基实验组实验组为什么用琼脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素为什么用琼脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素溶液？溶液？琼脂和琼脂糖琼脂和琼脂糖 琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂琼脂糖糖和和琼脂果胶琼脂果胶，还含有少量的，还含有少量的含氮含氮化合物，及其它化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。
5、琼脂作为微生物固体培养有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是：基不可缺少的组成成分，其优点是：其主要成分不能被微生物利用；其主要成分不能被微生物利用；可使培养基可使培养基固化固化；不影响不影响培养基中其他营养物质被细菌吸收。培养基中其他营养物质被细菌吸收。实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以非尿素为氮源的细菌利用物被以非尿素为氮源的细菌利用，有利于对这
6、，有利于对这类细菌的筛选。类细菌的筛选。思考？思考？选择培养基选择培养基加入青霉素的培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞分离导入了目的基因的受体细胞添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离2、倒平板、倒平板制备空白平板制备
7、空白平板：取：取2个三角瓶，分别装入已灭菌个三角瓶，分别装入已灭菌的全营养的全营养LB固体培养基固体培养基和和尿素固体培养基尿素固体培养基，放，放在超净工作台上，冷却至在超净工作台上，冷却至60 左右时，在酒精左右时，在酒精灯旁把上述两种培养基分别倒至培养皿中，轻灯旁把上述两种培养基分别倒至培养皿中，轻轻摇匀，平放至凝固。轻摇匀，平放至凝固。2、倒平板、倒平板 在无菌条件下，在将在无菌条件下，在将1g土样加到装有土样加到装有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成，即成10-2土壤稀土壤稀释液，并依次制备出释液，并依次制备出10-310-5稀释液。例如，若稀释液。
8、例如，若想制备想制备10-3的稀释液，可取的稀释液，可取0.5 mL 10-2的稀释液的稀释液。取样时，。取样时，尽量只取悬液尽量只取悬液，倒入有，倒入有4.5 mL无菌水无菌水的有盖试管中，摇匀，放在试管架上。的有盖试管中，摇匀，放在试管架上。3、制备细菌悬液制备细菌悬液4、涂布分离涂布分离 涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取0.1 mL的稀释度为的稀释度为10-3、10-4和和10-5的土壤稀释的土壤稀释液（细菌悬液）液（细菌悬液），分别加到装有全营养，分别加到装有全营养LB培培养基和尿素培养基的培养皿（空白平板）中；养基和尿素培养基的培养皿（空白平板
9、）中；再将再将保存在保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯在酒精灯火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。接种接种 取取0.1ml菌悬液菌悬液涂布分离按浓度捆成一摞按浓度捆成一摞5、37恒温培养箱恒温培养箱 倒置培养倒置培养四1 1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基 因为琼脂是因为琼脂是未被纯化未被纯化的混合物，的混合物，内含内含一定一定量的量的含氮
10、化合物含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故用菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂思考题：2 2、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用 如果土壤中有许多尿素，在自然界较高如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下就会被水解，水解后的温度下就会被水解，水解后的NHNH3 3会使土会使
11、土壤变成碱性，壤变成碱性，NHNH3 3与其他阴离子物质如与其他阴离子物质如SOSO4 42 2、COCO3 32 2、NONO3 3等形成化合物，则会等形成化合物，则会使土壤板结。使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中然界中氮的循环氮的循环。3 3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现。出现。细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境里水解后产生氨，氨为碱性
12、，酚红在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。4 4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落素培养基上只有少数菌落 因为全营养培养基中的氮源是蛋白胨，很因为全营养培养基中的氮源是蛋白胨，很多细菌都能利用它，而尿素培养基中的氮多细菌都能利用它，而尿素培养基中的氮源只有尿素，只有含脲酶的细菌才能利用源只有尿素，只有含脲酶的细菌才能利用尿素，能存活。尿素，能存活。这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有群中只占有 极少数量。极少数量。
